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Artigo de método

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

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DOI:

10.3791/58140

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3 de outubro de 2018

 ,  ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2LGI Flow Cytometry Core Facility, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Resumo

Síndromes Mielodisplásicas (MDS) são um grupo diverso de desordens de células-tronco hematopoiéticas são definidos pela hematopoiese ineficaz, sangue periférico citopenias, displasia e uma propensão para a transformação para leucemia aguda. NUP98-HOXD13 (NHD13) ratos transgénicos recapitular MDS humana em termos de citopenias de sangue periférico, displasia e transformação para leucemia aguda. Demonstramos anteriormente que a MDS poderão ser transferidos de um rato geneticamente modificado com MDS para destinatários do selvagem-tipo por transplante de células de medula óssea nucleated MDS (BMNC). A mais claramente compreender a célula MDS de origem, desenvolvemos abordagens específicas de transplante, immunophenotypically definidos hematopoiéticos subconjuntos. Neste artigo, descrevemos o processo de isolar e transplantar populações específicas de tronco hematopoiético e células progenitoras. Após transplante, descrevemos abordagens para avaliar a eficiência do transplante e a persistência das células MDS doador.

Introdução

Síndromes Mielodisplásicas (MDS) representam um conjunto diverso de desordens de sangue clonal caracterizada pela hematopoiese ineficaz, evidências morfológicas de displasia e uma propensão para a transformação para leucemia mieloide aguda (LMA)1,2 ,3,4. Hematopoiese ineficaz é reconhecido como uma prisão de maturação na medula óssea, resultando em sangue periférico citopenias apesar de medula hipercelular1,3. A incidência de MDS foi estimada vària como 2-12 casos por 100.000 pessoas por ano nos Estados Unidos, e a incidência de MDS aumenta com a idade, tornando esta uma condição importante para entender tendo em conta o envelhecimento da população dos EUA3, 5. Embora a maioria dos casos de MDS tem sem etiologia, alguns casos de MDS são pensados para ser devido à exposição a agentes genotóxicos conhecidos, incluindo solventes tais como benzina e quimioterapia de câncer6.

Pacientes MDS normalmente adquiriram mutações no MDS células7. Embora relativamente incomum, um número de pacientes MDS adquiriram equilibradas translocações cromossômicas envolvendo genes tais como NUP98, EVI1, RUNX1 e MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Nosso laboratório tem um interesse de longa data em translocações cromossómicas, que envolvem o gene de NUP988. Ratos transgénicos que expressa um transgene NUP98-HOXD13 (NHD13), regulado pelo promotor Vav1 e elementos de potenciador exibem todos os principais recursos do MDS, incluindo citopenias de sangue periférico, evidências morfológicas de displasia e transformação para LMA9 .

Embora o MDS foram reconhecidos por mais de 60 anos,10e são considerados ser uma desordem clonal de células estaminais, os esforços para engraft célula humana do MDS em camundongos imunodeficientes foram pela maior parte mal sucedidos, porque as células MDS engraft mal11, 12,13,14 e os ratos não desenvolvem a doença clínica. Em um esforço para identificar quais células hematopoiéticas podem transmitir MDS, viramos para o modelo de NHD13 e mostrou que nós poderíamos engraft MDS como uma entidade de doença que mostrou todas as características cardinais da MDS humano, incluindo sangue periférico citopenias, displasia, e transformação para LMA15. Neste relatório, nós apresentamos os detalhes técnicos destas experiências, bem como abordagens para fracionar mais tronco hematopoiético e células precursoras (HSPC), em um esforço para identificar células MDS-iniciando.

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Protocolo

Os animais procedimentos descritos neste artigo foram aprovados pelo Instituto Nacional de câncer, no Comité de uso e cuidado do Animal de Bethesda e estão em conformidade com as políticas contidas a política de serviço de saúde pública no cuidado humano e uso de animais de laboratório, o Ato do bem-estar animal e o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.

1. preparação da pilha

  1. Colheita da medula óssea célula nucleada (BMNC)
    1. Use apenas o material esterilizado. Esterilize instrumentos reutilizáveis usando uma autoclave a vapor. Compra de agulhas, seringas e utensílios plásticos em recipientes estéreis de uso único. Execute todas as manipulações de animal e a célula em uma classe II, tipo A2 local de segurança microbiológica.
    2. Prepare-se BMNCs em um mL 14 redondo tubo inferior contendo 3 mL de HF2 (Hank está equilibrada solução salina suplementada com 2% de soro fetal bovino).
    3. Eutanásia C57Bl6 ratos do doador (positivos para CD45 alelo CD45.2), idade normalmente de 2 a 6 meses, utilizando uma câmara de2 CO.
    4. Esterilize a carcaça do mouse em etanol a 70% de pulverização por todo o corpo com um frasco de spray. Tirar a pele das pernas, desde a pelve até o tornozelo.
    5. Remova os fêmures e tíbias da carcaça usando uma tesoura esterilizada (em linha reta, sharp/sharp, 11,5 cm) e fórceps (Graefe, serrilhada, largura da ponta de 0.8 mm). Apare os músculos anexados claramente.
    6. Corte as extremidades proximais e distais da tíbia com a tesoura. Segura a tíbia com fórceps, inserir uma seringa de 3 mL de calibre 27 contendo 2,5 mL de HF2 na cavidade da medula tibial na extremidade distal da tíbia (tornozelo). Retirar as células da medula óssea da tíbia usando uma pressão suave para a 14 mL redonda tubo inferior.
      1. Repita para o outro tibia.
    7. Corte as extremidades proximais e distais do fêmur com uma tesoura. Resplendor da cavidade de medula do fêmur através da inserção de uma agulha de calibre 20 anexado a uma seringa de 3 mL contendo 2,5 mL de HF2 na extremidade distal da cavidade de medula de fêmur e aplicando uma pressão suave para a seringa.
      1. Repita para o outro fêmur, coletando todas as da medula óssea de ambas as tíbias e os fêmures no mesmo 14 mL tubo de fundo redondo.
    8. Disperse a massa da medula por aspiração para cima e para baixo várias vezes com a mesma agulha de calibre 20 anexada para a seringa de 3 mL.
  2. Mancha do anticorpo de BMNC
    1. BMNC de contagem. Adicione 20 µ l de uma solução de ácido acético de 3% a 20 µ l da suspensão BMNC gerada na etapa 1.1.8. Então, conta usando um hemocytometer e um microscópio invertido.
    2. Pelota a BMNC por centrifugação suave a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet com HF2 usando 90 µ l por 107 células e adicionar 10 µ l de biotinilado antilinhagem cocktail à suspensão de células.
    3. Após incubação por 20 min a 4 ° C, lave as células coradas com 3 mL de tampão fosfato salino (PBS).
    4. Ressuspender o BMNC com 100 µ l de HF2 por 107 células. Adicione 2 µ l de allophycocyanin (APC) conjugado anticorpo antibiotina à suspensão de células, seguida de incubação a 4 ° C por 20 min.
    5. Enxágue o BMNC manchada com 3 mL de PBS e ressuspender o BMNC com HF2 suplementado com 0,2 µ g/mL de iodeto de propidium (PI) por citometria de fluxo celular classificação.
  3. Fluxo cytometry célula classificação de BMNC
    1. Calibre o classificador de pilha de citometria de fluxo. Otimizar todos os tubos fotomultiplicadores (PMTs), dispersão e parâmetros de fluorescência usando células imaculadas e definir dentro da escala linear de cada detector.
    2. Preparar imaculado, PI-manchada, e APC rotulado linhagem cocktails células em paralelo da etapa 1.2. Analise espectral da indemnização.
    3. Discriminar as células dubleto pelo gating sequencial de FSC-H vs CCD-H 640-SSC-A vs 640-SSC-H e 640-SSC-S vs 640-SSC-W.
    4. Exclua células viáveis usando PI animado a 561 nm e emissão coletados com um filtro passa-banda 614/20. Excite a linhagem APC rotulada células em 640 nm e coletar a emissão com um filtro passa-banda 671/30.
    5. Gravar valores de fluorescência como altura de tensão e coletar pelo menos 100.000 eventos em arquivos de dados de modo de lista para visualizar as populações a serem classificados.
    6. Calcular a compensação espectral após a aquisição de três amostras de 10.000 células para o seguinte: unlabeled células, PI rotulado células e cocktail de antianticorpo linhagem conjugado com APC rotulada de células.
    7. Conjunto de três regiões para classificar a linhagem negativa (LN), linhagem positivo (LP) com intensidade de fluorescência ofuscante (LP1) e a população de LP com fluorescência (LP2) para tubos de 5 mL contendo 0,5 mL de mídia FBS de 10%.
    8. Células de tipo usando uma uma gota envolvem e purificam o modo de anular.
    9. Execute análise de tipo post com 1.000 células totais em cada amostra classificada para confirmar a pureza e a viabilidade das células classificadas.
    10. Recolher pilhas classificadas por centrifugação a 450 x g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet de células com 0,5 mL de HF2.
    11. Confirme celular classificada número com hemocytometer e azul Trypan. Ajuste o número de células com HF2 para transplante.
      Nota: Um amplo espectro de populações BMNC pode ser isolado para transplante usando combinações adicionais de anticorpos conjugados a fluorocromo na etapa 1.2.2 acima.

2. destinatário ratos preparação e transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH)

  1. Preparação de transplantados
    1. Manter a veterinária e pecuária conta congenic ratos destinatário (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) em uma instalação animal livre de patógeno específico (SPF).
    2. Para descontaminação profilática da faixa gastrointestinal, fornecer água estéril contendo 100 mg/L de ciprofloxacina aos destinatários por 7 dias antes da irradiação de dose letal (Gy 9) e manter durante 14 dias após a irradiação.
    3. Fornece uma irradiação de dose letal (Gy 9) de uma fonte de Cs da seguinte maneira. Use um operador treinado e certificado do Cs. Defina o instrumento de fonte de Cs para entregar 70 irradiação de gama de corpo total cGy/min. Coloque 10 ratos em um suporte personalizados e encaixe o suporte da câmara difusora. Entregar a irradiação de corpo total 9 Gy em 13 min e retornar os ratos de suas gaiolas.
  2. Transplante de células-tronco hematopoiéticas
    1. Misture tipo selvagem (WT) BMNC de um congenic destinatário mouse (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) na dose de 2 x 105 células por rato com 2 a 5 x 10 célula4 células do teste purificada que BMNC preparado com fluxo cytometry classificando como descrito em 1.3 acima. Misture as células na mesma seringa.
      Nota: O WT BMNC fornecem um radiação poupando-efeito para o destinatário mouse e permitir a sobrevivência do destinatário mouse se as células de teste não oferecem suporte a hematopoiese. A WT BMNC utilizados neste tipo de experimento expressa o alelo CD45.1 e, portanto, podem ser distinguido das células teste usando anticorpos que discriminam entre CD45.1 e CD45.2. As células de WT BM são referidas como "células helper", "células de poupadores de radiação" ou "células de concorrente".
    2. Ajuste o volume de mistura de célula a 200 µ l por destinatário usando o HF2 estéril para facilitar a injeção.
    3. Transplante as misturas de célula para a ratos destinatário letalmente irradiados através de cauda por via venosa veia injeção usando uma seringa de 1 mL e agulha de calibre 28, no prazo de 24 h de irradiação. Coloque a cauda de rato sob uma lâmpada de calor, como calor leva à dilatação da veia da cauda.
      Nota: Eutanásia em todos os ratos destinatários no final do estudo e avaliar a progressão da doença por necrópsia, histologia e citometria de fluxo.

3. enxertia ensaio usando citometria de fluxo

  1. Para avaliar a enxertia de célula do doador, colete sangue periférico (PB) dos destinatários ratos na 6ª semana, 12 e 16 semana após o transplante.
  2. Aqueça os destinatários na gaiola com lâmpada de calor por cerca de 1 min e posicione o mouse em uma retenção.
  3. Cortar a veia da cauda com um bisturi (lâmina 10, alça para bisturi #3) e coletar 100 µ l de PB por destinatário usando um conta de tubo contendo EDTA como anticoagulante.
  4. Divida o PB coletado em duas alíquotas iguais colocando-se 50 µ l em um tubo estéril microcentrifuga. Use uma alíquota para uma automatizado hemograma completo (CBC) (realizada no núcleo de Histopatologia do ICN) e use a segunda alíquota para coloração de anticorpo e citometria de fluxo.
  5. Para detectar a enxertia de doador por citometria de fluxo, Lise os glóbulos vermelhos (RBC), adicionando 1 mL de tampão de Lise hipotónica RBC (8,29 g/L de NH4Cl, 1 g/L de KHCO3, 0,037 g/L de Na2EDTA, pH 7,2) a 50 µ l do PB coletado. Vórtice da amostra para misturar e incubar 10 min à temperatura ambiente.
  6. Centrifugue o PB lisado a 4.600 x g por 1,5 min. cuidadosamente Aspire o sobrenadante e descartar.
  7. Interromper parcialmente o centrifugado por suavemente tocando ou "sacudir" o fundo do tubo. Adicione 1,3 mL de PBS para a pelota localizado no tubo e centrifugar 4.600 x g por 1,5 min. cuidadosamente aspirado e descartar o sobrenadante.
  8. Perturbar o centrifugado por tocar ou passar rapidamente e adicionar 200 µ l de HF2 suplementado com 5% de soro de rato para o centrifugado.
  9. Adicione o anticorpo anti-CD45.2 (1 µ l) conjugado com allophycocyanin (APC) para a suspensão de eritrócitos. Incube a 4 ° C, durante pelo menos 30 min e brevemente vórtice a mistura.
  10. Após a coloração, lavar as células duas vezes como descrito acima e ressuspender com 400 µ l de HF2 suplementado com 1 µ g/mL de PI.
  11. Detecta a enxertia usando um citômetro de fluxo de 4 cores. Obter informações adicionais sobre os tipos de células no sangue periférico pela adição de anticorpos adicionais para detectar tipos específicos de células, como linfócitos B ou T.
  12. Gravar dados de enxertia serial usando uma planilha para permitir a posterior análise de dados.

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Resultados

Nós mostramos figuras representativas para obter resultados de vários experimentos. A Figura 1 mostra uma citometria de fluxo representativo classificação experimento. Durante a diferenciação hematopoiética normal, como as células se tornam comprometidas com uma linhagem específica de hematopoiética, eles adquirem marcadores de superfície celular linhagem-definição e perdem o potencial de auto-renovação. Portanto, em ratos do selvagem-tipo, auto-renovação de ...

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Discussão

Embora MDS são uma desordem clonal células-tronco hematopoiéticas, os MDS "tronco", ou células de iniciante, ainda não foram caracterizados. Demonstramos anteriormente que o MDS pode ser para transplante para camundongos WT usando a medula óssea de ratos NHD13 por TCTH, caracterizada por anemia macrocítica, leucopenia, neutropenia e evidências morfológicas de displasia15. Além disso, ensaios de repovoamento do competidor identificaram uma vantagem de crescimento de células de medula óssea NHD13 MD...

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Divulgações

Nós não temos nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de câncer, National Institutes of Health (conceder números ZIA SC 010378 e BC 010983).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo inferior redondo de 14 mLSolução
Hank'sAnticorpo Lonza10-527F
Anti-CD45.2Southern Biotech1800-15LOTE# A077-T044O
Seringa de 3 mLMonoject8881513934
agulha 27-GBD305109
agulha 20-GBD
Lineage CocktailMiltenyi130-090-858LOTE# 5170418221
Anticorpos anti-biotinaMiltenyi130-113-288LOTE# 5171109046
Seringa de 1 mLExcelint26027Seringa
Insulina Lâmpada de AquecimentoThermo Fisher ScientificE70001901
Máquina FACS CytecFACScan2 lasers, 5 detectores de cores
Instrumento de classificação FACSBeckman CoulterMOFLO ASTRIOS5 lasers, 23 parâmetros, 6 classificação de população simultaneamente
Iodeto de propídioThermo Fisher ScientificP3566
Gamma IrradiatorMelhor TheratronicsGammacell 40
Tubo de coleta de sangueRAM scientific76011
Destinatário camundongosCharles RiverB6-LY5.1 / Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 camundongosn / aC57Bl / 6, CD45.2Colônia mantida no NIH
5 mL tubo inferior redondoFalcon352058
salina balanceada Falcon 352057 305176 de

Referências

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