Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Síndromes Mielodisplásicas (MDS) representam um conjunto diverso de desordens de sangue clonal caracterizada pela hematopoiese ineficaz, evidências morfológicas de displasia e uma propensão para a transformação para leucemia mieloide aguda (LMA)^{1,2 ,3,4}. Hematopoiese ineficaz é reconhecido como uma prisão de maturação na medula óssea, resultando em sangue periférico citopenias apesar de medula hipercelular^1,3. A incidência de MDS foi estimada vària como 2-12 casos por 100.000 pessoas por ano nos Estados Unidos, e a incidência de MDS aumenta com a idade, tornando esta uma condição importante para entender tendo em conta o envelhecimento da população dos EUA^{3, 5}. Embora a maioria dos casos de MDS tem sem etiologia, alguns casos de MDS são pensados para ser devido à exposição a agentes genotóxicos conhecidos, incluindo solventes tais como benzina e quimioterapia de câncer⁶.

Pacientes MDS normalmente adquiriram mutações no MDS células⁷. Embora relativamente incomum, um número de pacientes MDS adquiriram equilibradas translocações cromossômicas envolvendo genes tais como NUP98, EVI1, RUNX1 e MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Nosso laboratório tem um interesse de longa data em translocações cromossómicas, que envolvem o gene de NUP98⁸. Ratos transgénicos que expressa um transgene NUP98-HOXD13 (NHD13), regulado pelo promotor Vav1 e elementos de potenciador exibem todos os principais recursos do MDS, incluindo citopenias de sangue periférico, evidências morfológicas de displasia e transformação para LMA⁹ .

Embora o MDS foram reconhecidos por mais de 60 anos,¹⁰e são considerados ser uma desordem clonal de células estaminais, os esforços para engraft célula humana do MDS em camundongos imunodeficientes foram pela maior parte mal sucedidos, porque as células MDS engraft mal^{11, 12,13,14} e os ratos não desenvolvem a doença clínica. Em um esforço para identificar quais células hematopoiéticas podem transmitir MDS, viramos para o modelo de NHD13 e mostrou que nós poderíamos engraft MDS como uma entidade de doença que mostrou todas as características cardinais da MDS humano, incluindo sangue periférico citopenias, displasia, e transformação para LMA¹⁵. Neste relatório, nós apresentamos os detalhes técnicos destas experiências, bem como abordagens para fracionar mais tronco hematopoiético e células precursoras (HSPC), em um esforço para identificar células MDS-iniciando.

Os animais procedimentos descritos neste artigo foram aprovados pelo Instituto Nacional de câncer, no Comité de uso e cuidado do Animal de Bethesda e estão em conformidade com as políticas contidas a política de serviço de saúde pública no cuidado humano e uso de animais de laboratório, o Ato do bem-estar animal e o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.

1. preparação da pilha

1. Colheita da medula óssea célula nucleada (BMNC)
   1. Use apenas o material esterilizado. Esterilize instrumentos reutilizáveis usando uma autoclave a vapor. Compra de agulhas, seringas e utensílios plásticos em recipientes estéreis de uso único. Execute todas as manipulações de animal e a célula em uma classe II, tipo A2 local de segurança microbiológica.
   2. Prepare-se BMNCs em um mL 14 redondo tubo inferior contendo 3 mL de HF2 (Hank está equilibrada solução salina suplementada com 2% de soro fetal bovino).
   3. Eutanásia C57Bl6 ratos do doador (positivos para CD45 alelo CD45.2), idade normalmente de 2 a 6 meses, utilizando uma câmara de₂ CO.
   4. Esterilize a carcaça do mouse em etanol a 70% de pulverização por todo o corpo com um frasco de spray. Tirar a pele das pernas, desde a pelve até o tornozelo.
   5. Remova os fêmures e tíbias da carcaça usando uma tesoura esterilizada (em linha reta, sharp/sharp, 11,5 cm) e fórceps (Graefe, serrilhada, largura da ponta de 0.8 mm). Apare os músculos anexados claramente.
   6. Corte as extremidades proximais e distais da tíbia com a tesoura. Segura a tíbia com fórceps, inserir uma seringa de 3 mL de calibre 27 contendo 2,5 mL de HF2 na cavidade da medula tibial na extremidade distal da tíbia (tornozelo). Retirar as células da medula óssea da tíbia usando uma pressão suave para a 14 mL redonda tubo inferior.
      1. Repita para o outro tibia.
   7. Corte as extremidades proximais e distais do fêmur com uma tesoura. Resplendor da cavidade de medula do fêmur através da inserção de uma agulha de calibre 20 anexado a uma seringa de 3 mL contendo 2,5 mL de HF2 na extremidade distal da cavidade de medula de fêmur e aplicando uma pressão suave para a seringa.
      1. Repita para o outro fêmur, coletando todas as da medula óssea de ambas as tíbias e os fêmures no mesmo 14 mL tubo de fundo redondo.
   8. Disperse a massa da medula por aspiração para cima e para baixo várias vezes com a mesma agulha de calibre 20 anexada para a seringa de 3 mL.
2. Mancha do anticorpo de BMNC
   1. BMNC de contagem. Adicione 20 µ l de uma solução de ácido acético de 3% a 20 µ l da suspensão BMNC gerada na etapa 1.1.8. Então, conta usando um hemocytometer e um microscópio invertido.
   2. Pelota a BMNC por centrifugação suave a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet com HF2 usando 90 µ l por 10⁷ células e adicionar 10 µ l de biotinilado antilinhagem cocktail à suspensão de células.
   3. Após incubação por 20 min a 4 ° C, lave as células coradas com 3 mL de tampão fosfato salino (PBS).
   4. Ressuspender o BMNC com 100 µ l de HF2 por 10⁷ células. Adicione 2 µ l de allophycocyanin (APC) conjugado anticorpo antibiotina à suspensão de células, seguida de incubação a 4 ° C por 20 min.
   5. Enxágue o BMNC manchada com 3 mL de PBS e ressuspender o BMNC com HF2 suplementado com 0,2 µ g/mL de iodeto de propidium (PI) por citometria de fluxo celular classificação.
3. Fluxo cytometry célula classificação de BMNC
   1. Calibre o classificador de pilha de citometria de fluxo. Otimizar todos os tubos fotomultiplicadores (PMTs), dispersão e parâmetros de fluorescência usando células imaculadas e definir dentro da escala linear de cada detector.
   2. Preparar imaculado, PI-manchada, e APC rotulado linhagem cocktails células em paralelo da etapa 1.2. Analise espectral da indemnização.
   3. Discriminar as células dubleto pelo gating sequencial de FSC-H vs CCD-H 640-SSC-A vs 640-SSC-H e 640-SSC-S vs 640-SSC-W.
   4. Exclua células viáveis usando PI animado a 561 nm e emissão coletados com um filtro passa-banda 614/20. Excite a linhagem APC rotulada células em 640 nm e coletar a emissão com um filtro passa-banda 671/30.
   5. Gravar valores de fluorescência como altura de tensão e coletar pelo menos 100.000 eventos em arquivos de dados de modo de lista para visualizar as populações a serem classificados.
   6. Calcular a compensação espectral após a aquisição de três amostras de 10.000 células para o seguinte: unlabeled células, PI rotulado células e cocktail de antianticorpo linhagem conjugado com APC rotulada de células.
   7. Conjunto de três regiões para classificar a linhagem negativa (LN), linhagem positivo (LP) com intensidade de fluorescência ofuscante (LP1) e a população de LP com fluorescência (LP2) para tubos de 5 mL contendo 0,5 mL de mídia FBS de 10%.
   8. Células de tipo usando uma uma gota envolvem e purificam o modo de anular.
   9. Execute análise de tipo post com 1.000 células totais em cada amostra classificada para confirmar a pureza e a viabilidade das células classificadas.
   10. Recolher pilhas classificadas por centrifugação a 450 x g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet de células com 0,5 mL de HF2.
   11. Confirme celular classificada número com hemocytometer e azul Trypan. Ajuste o número de células com HF2 para transplante.
       Nota: Um amplo espectro de populações BMNC pode ser isolado para transplante usando combinações adicionais de anticorpos conjugados a fluorocromo na etapa 1.2.2 acima.

2. destinatário ratos preparação e transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH)

1. Preparação de transplantados
   1. Manter a veterinária e pecuária conta congenic ratos destinatário (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) em uma instalação animal livre de patógeno específico (SPF).
   2. Para descontaminação profilática da faixa gastrointestinal, fornecer água estéril contendo 100 mg/L de ciprofloxacina aos destinatários por 7 dias antes da irradiação de dose letal (Gy 9) e manter durante 14 dias após a irradiação.
   3. Fornece uma irradiação de dose letal (Gy 9) de uma fonte de Cs da seguinte maneira. Use um operador treinado e certificado do Cs. Defina o instrumento de fonte de Cs para entregar 70 irradiação de gama de corpo total cGy/min. Coloque 10 ratos em um suporte personalizados e encaixe o suporte da câmara difusora. Entregar a irradiação de corpo total 9 Gy em 13 min e retornar os ratos de suas gaiolas.
2. Transplante de células-tronco hematopoiéticas
   1. Misture tipo selvagem (WT) BMNC de um congenic destinatário mouse (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) na dose de 2 x 10⁵ células por rato com 2 a 5 x 10 célula⁴ células do teste purificada que BMNC preparado com fluxo cytometry classificando como descrito em 1.3 acima. Misture as células na mesma seringa.
      Nota: O WT BMNC fornecem um radiação poupando-efeito para o destinatário mouse e permitir a sobrevivência do destinatário mouse se as células de teste não oferecem suporte a hematopoiese. A WT BMNC utilizados neste tipo de experimento expressa o alelo CD45.1 e, portanto, podem ser distinguido das células teste usando anticorpos que discriminam entre CD45.1 e CD45.2. As células de WT BM são referidas como "células helper", "células de poupadores de radiação" ou "células de concorrente".
   2. Ajuste o volume de mistura de célula a 200 µ l por destinatário usando o HF2 estéril para facilitar a injeção.
   3. Transplante as misturas de célula para a ratos destinatário letalmente irradiados através de cauda por via venosa veia injeção usando uma seringa de 1 mL e agulha de calibre 28, no prazo de 24 h de irradiação. Coloque a cauda de rato sob uma lâmpada de calor, como calor leva à dilatação da veia da cauda.
      Nota: Eutanásia em todos os ratos destinatários no final do estudo e avaliar a progressão da doença por necrópsia, histologia e citometria de fluxo.

3. enxertia ensaio usando citometria de fluxo

1. Para avaliar a enxertia de célula do doador, colete sangue periférico (PB) dos destinatários ratos na 6ª semana, 12 e 16 semana após o transplante.
2. Aqueça os destinatários na gaiola com lâmpada de calor por cerca de 1 min e posicione o mouse em uma retenção.
3. Cortar a veia da cauda com um bisturi (lâmina 10, alça para bisturi #3) e coletar 100 µ l de PB por destinatário usando um conta de tubo contendo EDTA como anticoagulante.
4. Divida o PB coletado em duas alíquotas iguais colocando-se 50 µ l em um tubo estéril microcentrifuga. Use uma alíquota para uma automatizado hemograma completo (CBC) (realizada no núcleo de Histopatologia do ICN) e use a segunda alíquota para coloração de anticorpo e citometria de fluxo.
5. Para detectar a enxertia de doador por citometria de fluxo, Lise os glóbulos vermelhos (RBC), adicionando 1 mL de tampão de Lise hipotónica RBC (8,29 g/L de NH₄Cl, 1 g/L de KHCO₃, 0,037 g/L de Na₂EDTA, pH 7,2) a 50 µ l do PB coletado. Vórtice da amostra para misturar e incubar 10 min à temperatura ambiente.
6. Centrifugue o PB lisado a 4.600 x g por 1,5 min. cuidadosamente Aspire o sobrenadante e descartar.
7. Interromper parcialmente o centrifugado por suavemente tocando ou "sacudir" o fundo do tubo. Adicione 1,3 mL de PBS para a pelota localizado no tubo e centrifugar 4.600 x g por 1,5 min. cuidadosamente aspirado e descartar o sobrenadante.
8. Perturbar o centrifugado por tocar ou passar rapidamente e adicionar 200 µ l de HF2 suplementado com 5% de soro de rato para o centrifugado.
9. Adicione o anticorpo anti-CD45.2 (1 µ l) conjugado com allophycocyanin (APC) para a suspensão de eritrócitos. Incube a 4 ° C, durante pelo menos 30 min e brevemente vórtice a mistura.
10. Após a coloração, lavar as células duas vezes como descrito acima e ressuspender com 400 µ l de HF2 suplementado com 1 µ g/mL de PI.
11. Detecta a enxertia usando um citômetro de fluxo de 4 cores. Obter informações adicionais sobre os tipos de células no sangue periférico pela adição de anticorpos adicionais para detectar tipos específicos de células, como linfócitos B ou T.
12. Gravar dados de enxertia serial usando uma planilha para permitir a posterior análise de dados.

Nós mostramos figuras representativas para obter resultados de vários experimentos. A Figura 1 mostra uma citometria de fluxo representativo classificação experimento. Durante a diferenciação hematopoiética normal, como as células se tornam comprometidas com uma linhagem específica de hematopoiética, eles adquirem marcadores de superfície celular linhagem-definição e perdem o potencial de auto-renovação. Portanto, em ratos do selvagem-tipo, auto-renovação de células-tronco é confinada a linhagem negativo BMNC. Neste experimento, estamos classificados BMNC da medula óssea de NHD13 em células de linhagem-positivo positivo e alta linhagem linhagem-negativo, baixa. Estas ordenadas as células foram então transplantadas para destinatários WT para determinar a capacidade de auto-renovação.

A Figura 2 mostra os resultados de uma experiência separada, na qual linhagem células negativas ou indiferenciados de células de doadores de NHD13 com MDS foram transplantadas para destinatários WT letalmente irradiados. As células do doador NHD13 expressaram o marcador de superfície de célula CD45.2, Considerando que as células de concorrente do WT (ver seção 2.2.1 acima) expressaram o marcador de superfície de célula CD45.1. A Figura 3 mostra a análise de enxertia serial de indiferenciados BMNC NHD13 ou linhagem-negativo NHD13 BMNC. Depois de aproximadamente 16 semanas, as células de NHD13 outcompete as células WT, como mostrado pela crescente percentagem de células CD45.2 + no sangue periférico. A Figura 4 mostra um exemplo de transformação leucêmicas de um rato transplantado com células NHD13 MDS.

Figura 1: citometria de fluxo, ordenação estratégia de BMNC manchadas com anticorpo linhagem cocktail. Cada caixa retangular sobre a trama de ponto representa uma população celular classificada para TCTH avaliar a função da célula. R4, linhagem negativa; R5, baixa linhagem positiva; R6, positivo de alta linhagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: perfis de FACS representativa para o ensaio de enxertia utilizando anticorpos do doador específicos anti-CD45.2. Destinatário BMNC foi transplantado com 1 X 106 BMNC NHD13 (CD45.2 +) e células de destinatário LNBM com 5 X 104 NHD13 linhagem negativa BM (CD45.2 +). Em cada caso, 2 x 105 WT BMNC (CD45.1 +) foram usados como células de concorrente. Números no positivo caixas superior e inferior representam CD45.2 (derivado de doador de NHD13) e CD45.2 negativo (derivem de células de concorrente WT), respectivamente, no pós-transplante 6 e 24 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: cinética de enxertia de destinatários individuais após transplante. Cada linha do gráfico mostra os ensaios de enxertia serial de um mouse de destinatário individual. Destinatários BMNC foram transplantados com 1 X 106 células de NHD13 toda BMNC e destinatários LNBM foram transplantados com 5 X 104 de NHD13 linhagem BM negativo depois da classificação. NHD indica NHD13 doador. BM, BMNC ratos destinatários; LNBM, destinatário de BM negativo de linhagem; PBMC, células mononucleadas de sangue periférico. Em todos os casos, as células do doador NHD13 outcompete gradualmente as células do WT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: maio-Grünwald Giemsa (MGG) coloração da medula óssea (BM) do destinatário do MDS que evoluiu para a LMA. Observe a presença de numerosas explosões e formas imaturas. As setas indicam a explosões, e pontas de flechas indicam formas imaturas. Original 400 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nós não temos nada para divulgar.