Parácrina e justácrina interacções celulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Aqui, um método de cultura proximal é usado para estudar a sinalização parácrina onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas, evitando o contato direto do celular.
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Artigo de método
Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células
Neste artigo
Resumo
Resumo
Interações intercelulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Parácrina ou sinalização justácrina Medeia tais interações. O uso de um meio condicionado e estudos coculture são os métodos mais comuns para discriminar entre estes dois tipos de interações. No entanto, o efeito de concentrações elevadas localizadas dos fatores secretados para o microambiente durante as interações parácrina não é instaurado com precisão por meio condicionado e, assim, pode levar a conclusões imprecisas. Para superar este problema, criámos um método de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina. Os tipos de duas células são cultivados em qualquer superfície de uma membrana de policarbonato µm de espessura 10 com 0,4 µm de poros. Os poros permitem a troca de fatores secretados e, ao mesmo tempo, inibem a sinalização justácrina. As células podem ser coletadas e lysed no ponto de extremidade para determinar os efeitos da sinalização parácrina. Além de permitir para localizadas gradientes de concentração dos fatores secretados, este método é passível de experimentos que envolvem períodos prolongados de cultura, bem como o uso de inibidores. Enquanto nós usamos este método para estudar as interações entre as células de câncer de ovário e as células mesoteliais que encontram no local da metástase, pode ser adaptado para qualquer dois tipos de células aderentes aos pesquisadores estudar parácrina sinalização em vários campos, incluindo desenvolvimento, imunologia e microambiente do tumor.
Introdução
O papel de produtivas interações recíprocas entre as células cancerosas e o microambiente do tumor na progressão do tumor foi bem estabelecido e tornou-se um grande foco de pesquisa em câncer biologia1. Instâncias similares de sinalização bidirecional são cruciais durante o ferida cura, respostas imunes, angiogênese, nichos de células-tronco e desenvolvimento2,3,4,5,6 , 7 , 8. um tema comum em todos estes processos....
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Protocolo
O protocolo segue as diretrizes do Conselho regulamentação institucional da Indiana University.
1. preparação da pilha
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Isolamento e cultura de células mesoteliais primárias de
- Isolado primárias mesoteliais células humanas (HPMCs) de omento humana como descrito anteriormente,17,18 e cultivá-las em completar o meio de crescimento [modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina-estreptomicina, 1% não aminoácidos essenciais e vitaminas 1%] a 37 ° C e 5% de CO2.
Nota: Os HPMCs são normalmente ....
- Isolado primárias mesoteliais células humanas (HPMCs) de omento humana como descrito anteriormente,17,18 e cultivá-las em completar o meio de crescimento [modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina-estreptomicina, 1% não aminoácidos essenciais e vitaminas 1%] a 37 ° C e 5% de CO2.
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Resultados
Metástase de células de câncer de ovário encontram células mesoteliais no local da metástase dentro da cavidade peritoneal19. Produtivo parácrina e justácrina interações com a ajuda de células mesoteliais na indução de respostas adaptáveis nas células de câncer de ovário, que permitem sucesso metástase17,18,20,21 . Para testar a eficácia .......
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Discussão
Compreender o mecanismo de parácrina e justácrina sinalização entre as células é essencial para o desenvolvimento de um melhor conhecimento do tecido normal homeostase e doença condições7,8. Parácrina a maioria dos estudos são conduzidos através da recolha de sinalização condicionado médio de uma célula tipo e usá-lo para tratar o outro tipo de célula. Este método tem uma vantagem em sua simplicidade inerente. No entanto, isso não com precisão recapitular as conc.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Estamos em dívida para com os pacientes para a sua participação na coleção de tecidos para estas experiências. Um prêmio de academia do DoD OCRP ovário câncer (W81XWH-15-0253) e um piloto prêmio da Fundação de sonho de Colleen para Anirban K. Mitra apoiaram esta pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Suporte permeável Transwell de 24 mm com 0,4 µ m Inserção de Membrana de Policarbonato de Poros | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µ membrana de policarbonato translúcido de espessura m • Tratado para fixação celular ideal • Embalado 6 insertos em uma placa de 6 poços, 4 placas por caixa • A membrana deve ser corada para visibilidade celular • Esterilizado por radiação gama |
| Placa de 6 poços | Corning (Falcon) | 353046 | Fundo plano, tratado com TC, estéril, com tampa |
| Placa de cultura de 15 cm | Corning (Falcon) | 353025 | Estéril, placa de cultura de células tratada com TC |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicilina Estreptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Amino não essencial ácidos | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitaminas | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Soro bovino fetal | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipetas | Qualquer marca é boa | ||
| Incubadora | Qualquer marca é boa | ||
| de nível II de biossegurança | Qualquer marca está bem | ||
| FN1 TaqMan Ensaio de Expressão Gênica | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 Ensaio de Expressão Gênica TaqMan | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 Ensaio de Expressão Gênica TaqMan | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH Expressão Gênica TaqMan Ensaio | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini kit de isolamento de RNA | Qiagen | 217004 | |
| Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| Células de câncer de ovário HeyA8 | Obtido do Laboratório Ernst Lengyel, Universidade de Chicago | ||
| TGFβ Neutralizante R | D Sistemas | MAB1835-100 |
Referências
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology.
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Reimpressões e permissões
