Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a fabricação do stretchable, dual channel, dispositivos de cultura de célula órgão microplaqueta microfluidic para recapitulando a funcionalidade de nível de órgão em vitro.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips
* These authors contributed equally
Neste artigo
Aviso de errata
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumo
Resumo
Um número significativo de compostos de chumbo falha no pipeline de farmacêutica, pois estudos em animais, muitas vezes, não conseguem prever respostas clínicas em pacientes humanos. Órgão-em-um-microplaqueta (órgão Chip) microfluidic celular cultura dispositivos humana, que fornecem uma plataforma experimental em vitro para avaliar a eficácia, toxicidade e farmacocinéticos (PK) perfis em seres humanos, podem ser melhores preditores de eficácia terapêutica e segurança na clínica comparada com estudos em animais. Estes dispositivos podem ser usados para modelar a função de praticamente qualquer tipo de órgão e podem ser fluidically através de microcanais comum de endotélio-alinhado para realizar estudos em vitro na fisiologia humana de órgãos-nível e de todo corpo sem ter que realizar experiências com as pessoas. Esses Chips de órgão consistem em dois canais microfluídicos perfundidos, separados por uma membrana polimérica permeável com células parenquimais órgão específico, de um lado e endotélio microvascular do outro, que pode ser esticado ciclicamente para fornecer órgão específico pistas mecânicas (por exemplo, respiração movimentos no pulmão). Este protocolo detalha a fabricação de flexível, dual channel, Chips de órgãos através de fundição de peças usando 3D impresso moldes, permitindo a combinação de vários casting e pós-processamento em etapas. Porosa poli (dimetil siloxano) membranas (PDMS) são expressos com micrômetro de tamanho usando matrizes de pilar silício sob compressão através de buracos. Fabricação e montagem de Chips de órgãos envolve equipamentos e etapas que podem ser implementadas fora de uma sala de limpeza tradicional. Este protocolo fornece aos pesquisadores acesso a tecnologia de Chip de órgão para em vitro estudos de nível de órgão e corpo na descoberta da droga, segurança e testes de eficácia, bem como estudos mecanicistas dos processos biológicos fundamentais.
Introdução
Aqui, descrevemos a fabricação de canal duplo, vascularizado órgão-em-um-microplaqueta (órgão Chip) microfluidic cultura dispositivos que utilizam um protocolo escalável favorável para uso por grupos de pesquisa, falta de acesso a salas limpas e ferramentas tradicionais litografia macia. Estes dispositivos foram desenvolvidos para recapitular as funções de nível de órgão humano para compreensão normal e fisiologia da doença, bem como drogas respostas em vitro1,2. Crítica à engenharia essa funcionalidade são dois canais microfluídicos perfundidos, separados por uma membrana semi-permeável (Figu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. preparação geral
- Para evitar detritos, limpe a área de trabalho usando fita adesiva e limpe a área com uma limpeza de salas limpas e álcool isopropílico.
- Para todas as etapas que exigem PDMS, misture PDMS na proporção de 10:1 (10 g de cruz ligando agente, 100 g de elastômero base). Misture com a mão ou com um misturador comercialmente disponível. Use um misturador planetário centrífugo aqui: mistura por 2 minutos a 2000 rpm e, em seguida, o PDMS de desgasificação por 2 minutos em 2200 rpm.
- Limpar tudo molda com pistola de ar para explodir fora detritos antes de usar.
Atenção: Não use pinça de metal para remover detr....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O protocolo aqui apresentado descreve a fabricação escalável de PDMS órgão Chips. Estes dispositivos permitem a cultura de dois tipos de tecidos perfundidos distintos em uma membrana elástica porosa (Figura 1). Os canais PDMS são expressos usando 3D moldes impressos, que acelera a prototipagem de novos projetos (Figura 2A e 2B). Top canais são moldadas em moldes sob compressão contra uma vedação compatível com po.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O processo de fabricação baseia-se em moldes impressos 3D de alta resolução padrão os PDMS superior e inferior órgão Chip componentes do corpo juntamente com micromolded membranas porosas de PDMS. Esta abordagem crítica foi selecionada devido à facilidade de prototipagem, combinada com uma rápida transição para dimensionado para fabricação e substituição de ferramentas. Os moldes do componente superior destinam-se às portas padrão em locais precisos com perfis verticais definidos durante a etapa de fundição. Isto não só .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
D.E.I. é dos fundadores e detém participações em emular, Inc. e preside o Conselho Consultivo Científico. J.P. atualmente é funcionário da R.N. emular, Inc., Y.C., J.P., e D.E.I. são inventores em propriedade intelectual que foi licenciado para emular, Inc.
Agradecimentos
Agradecemos a M. Rousseau e S. Kroll para ajudar com fotografia e videografia e M. Ingram, J. Nguyen, Shea D. e s. Wen de contribuições para o desenvolvimento do protocolo de fabricação inicial. Esta pesquisa foi patrocinada pelo Instituto Wyss biologicamente inspirados engenharia na Universidade de Harvard e o Defense Advanced Research Projects Agency sob contratos cooperativo #W911NF-12-2-0036 e #W911NF-16-C-0050 e FDA conceder # HHSF223201310079C, NIH concede #R01-EB020004 e #UG3-HL141797-01, e Fundação Bill e Melinda Gates concede #OPP1163237 e #OPP1173198 que o DEI. As opiniões e conclusões contidas neste documento são as dos autores e não deve ser interpretadas ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento de proteção individual | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Jaleco Tyvek | VWR | 13450-506 | |
| Luvas de punho estendido | VWR | 89521-898 | |
| Equipamento | |||
| Tapete de corte | VWR | 102096-430 | |
| Cortador de azulejos | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Moldes superiores Mold-in-place (MIP) | Protolabs, Inc. | impresso sob medida | Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) | Protolabs, Inc. | impresso sob medida | em Prototherm 12121 |
| Pinça curva Bico de pato | VWR | 63041-864 | |
| Pinça de ponta afiada | Microscopia Eletrônica Sciences | 72700-D | |
| Espátula de metal | VWR& | nbsp; 82027-528 | |
| Gravação de íons reativos profundos (DRIE) wafers de matriz de pilares | Sensera, Inc. | personalizado | Quatro matrizes de pilares de 50 x 50 mm por wafer; pilares de 7 um de largura, 50 um de altura, espaçados hexagonalmente 40 um de distância |
| Policarbonato texturizado de 0,01" de espessura | McMaster-Carr | 85585K33 | cortado em blocos PDMS quadrados de 45 mm |
| (40 x 40 x 5 mm) | n/a | personalizado | |
| Capuz de fluxo laminar | BVBI | fundido internamente | |
| Pistola | |||
| de ar comprimido60° Dessecador a vácuo do forno | |||
| Precisão do balanço | para 0,1 g | ||
| Máquina de plasma | Diener | A | capacidade de plasma de nano oxigênio é crítica |
| SuprimentosKit de | |||
| nbsp; | |||
| Copo | Assegure uma ventilação adequada ao manusear o pré-polímero devido aos baixos níveis de etilbenzeno | ||
| Seringa de 1 mL | VWR | 10099-395 | |
| Toalhetes para salas limpas | VWR | TWTX1080 | |
| lâminas de microscópio de vidro de 25 x 75 mm | VWR | 48311-703 | |
| Fita de embalagem | VWR | 500043-724 | |
| Fita adesiva | VWR | 500026-873 | |
| Tiras de poliuretano (PU) cortadas | Atlantic Gasket, Inc. | Personalizado: AGWI2X3 | 1/8" grosso; 60 durômetros de poliuretano preto; 2" x 3" |
| Filme de policarbonato .005" de espessura | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm placas de Petri quadradas gradeadas | VWR | 60872-480 | |
| Folha de alumínio | |||
| Equipamento opcional | |||
| Thinky Misturador PDMS | Thinky | ARE-310 | |
| Gabarito de | compressão de braçadeira de parafuso | interno | |
| Fabricante automatizado de membranas (AMF) | interna | pistão de compressão pneumática com aquecedor programável |
Referências
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips
Posted by JoVE Editors on 5/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips. The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.
In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.
to:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean.
In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
to:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
The References section has been updated from:
- Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at <http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf> (2007).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E.G.E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).
to:
- Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).
- Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).
