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Derivação e diferenciação de células-tronco mesenquimais ovário canina

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DOI:

10.3791/58163

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16 de dezembro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1The School of Agricultural and Veterinary Studies (FCAV), Jaboticabal, São Paulo State University (UNESP), 2CRRF, Université de Montréal, 3FZEA, University of São Paulo, 4FMVZ, University of São Paulo

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um método para o isolamento, expansão e diferenciação de células-tronco mesenquimais de tecido ovariano canina.

Resumo

Interesse em células-tronco mesenquimais (MSCs) aumentou na última década devido a sua facilidade de expansão de isolamento e cultura. Recentemente, estudos têm demonstrado a capacidade de diferenciação de largura que estas células possuem. O ovário representa um candidato promissor para terapias baseadas em células, devido ao fato de que é rica em MSCs e que ela frequentemente é descartada após cirurgias de ovariectomia como resíduos biológicos. Este artigo descreve os procedimentos para o isolamento, a expansão, e diferenciação de MSCs derivado do ovário canino, sem a necessidade de ordenação de células técnicas. Este protocolo representa uma importante ferramenta para a medicina regenerativa devido a ampla aplicabilidade destas células altamente diferenciável em ensaios clínicos e terapêuticos, usa.

Introdução

O número de estudos publicados que foco sobre células-tronco tem aumentado substancialmente na última década, um esforço de investigação que tem sido alimentado pelo objetivo coletivo de descobrir terapias da medicina regenerativa poderosa. Células-tronco têm dois marcadores definição primárias: autorenovação e diferenciação. Células-tronco mesenquimais são responsáveis por volume de negócios de tecido normal e têm uma capacidade mais restrita de diferenciação em comparação com células-tronco embrionárias1. Recentemente, muitos estudos têm mostrado uma vasta gama de diferenciação do MSCs, e um tema em discussão é se existem diferenças entre as células-tronco embrionárias e adultas em todos os2.

O epitélio de superfície ovarium é uma camada não confirmada de células, relativamente menos diferenciada, que expressa ambos os marcadores epiteliais e mesenquimais3, mantendo a capacidade de se diferenciarem em diferentes tipos de células em resposta a sinais ambientais4. A localização exata de células-tronco no ovário não é bem conhecida; no entanto, tem sido proposto que bipotential progenitores na túnica albugínea originar células germinativas5. Estudos imunológicos têm a hipótese de que estas células têm uma origem do estroma6 ou estão localizados em ou proximal para a superfície do ovário7. Uma vez que as células-tronco mesenquimais express numerosos receptores que desempenham um papel importante na aderência de célula8, um experimento foi concebido para testar a hipótese de que a seleção de uma população de células com a rápida adesão iria isolar uma população de células claramente characterizable como mesenquimais na natureza. Recentemente, nosso grupo relatou a derivação de MSCs de tecido ovariano com base na sua capacidade de aderência à superfície plástica do prato cultura nas primeiras 3 horas de cultura, a fim de obter uma população purificada de células exibindo rápida adesão9. Aqui, descrevemos o método desenvolvido por isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do ovário.

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Protocolo

Esta experiência foi realizada com os ovários de quatro cães femininos rafeiros doados após a cirurgia eletiva em um programa de esterilização canina. Este experimento foi aprovado pelo Comitê de ética no uso de animais da UNESP-FCAV (protocolo n º 026991/13).

1. preparação experimental

  1. Preparar ou comprar 500 mL de fosfato salino de estéril Dulbecco (DPBS) sem cálcio ou magnésio.
  2. Preparar uma colagenase armazeno solução através da mistura de 40 µ g da enzima em 1 mL de DPBS. Filtrar usando um filtro de seringa 0,2 µm e armazenar alíquotas de 2 mL a-20 ° C.
  3. Prepare os meios de cultura a partir médio (DMEM) baixos de glicose do Eagle modificado de Dulbecco com 10% de soro fetal e 1% de antibióticos.
  4. Coletar o material esterilizado: tesoura e pinça, um frasco de cultura de tecidos, pratos, tubos e pipetas de 10 mL e 5 mL.
  5. Usar equipamento de laboratório de cultura de célula padrão: uma câmara de segurança biológica (CSB), uma incubadora de cultura celular fixado em 5% de CO2 e 38 ° C e uma centrífuga.
  6. Limpar o BSC: com as mãos enluvadas, esterilize-a com 70% EtOH, usando luzes UV.

2. isolamento de células-tronco mesenquimais do ovário

  1. Após a cirurgia, manter os ovários em PBS no gelo em um tubo cônico, até sua chegada ao laboratório.
  2. Preencha dois pratos de Petri de 100 mm com 10 mL de PBS.
  3. Remover os ovários de tubo e transferi-los para o primeiro prato de Petri com PBS. Lave-os com os movimentos de mistura.
  4. Delicadamente, recuperar o ovário e coloque-o no outro prato. Com uma pinça estéril e tesoura, mince o tecido em pedaços muito pequenos, cerca de 1 mm de tamanho.
  5. Transferir o tecido para um prato de Petri de 35mm e adicionar 2 mL de colagenase. Picar o tecido um pouco mais.
  6. Coloque o prato de Petri na incubadora a 38 ° C por 3 h e agite suavemente a placa de Petri com movimentos circulares a cada 20 min.
  7. Após 3h, retire o prato de Petri da incubadora.
  8. Transfira o conteúdo do prato para um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de mídia de expansão.
  9. Inverta suavemente o tubo antes da centrifugação. Centrifugar o tubo a 2100 x g durante 7 min. remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 3 mL de mídia de expansão.
  10. Transferi o sedimento para uma garrafa de T25. Coloque a garrafa na incubadora com 5% CO2 a 38 ° C por 3 h.
    Nota: A parte mais importante do procedimento é mudar a mídia após 3 h de incubação.
  11. Retire a garrafa da incubadora e remova a mídia com o tecido restante. Adicione 3 mL de mídia expansão fresco para a garrafa.
  12. Mudar a cada 48 h mídia e observar a garrafa para celular confluência.
    Nota: As principais etapas do processo podem ser observadas na Figura 1.

3. expansão de células-tronco mesenquimais do ovário

  1. Passagem de células
    1. Quando as células chegam a confluência, remova a mídia do frasco.
    2. Lave o frasco com 3 mL de PBS. Remova a PBS.
    3. Adicione 1,5 mL de tripsina e colocar a garrafa na incubadora a 38 ° C por 3 min. Bata levemente o frasco para ajudar as células a se separar.
      Nota: Células devem alcançar confluência aproximadamente 5 - 7 d após o chapeamento inicial.
    4. Adicionar 3 mL de mídia de expansão e transferir o conteúdo para um tubo cônico.
    5. Centrifugar o tubo a 2100 x g durante 7 min. remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de mídia de expansão.
    6. Homogeneizar cuidadosamente o conteúdo do tubo.
    7. Tome uma alíquota de 10 µ l da amostra para realizar a célula contando e colocar o tubo com as células de volta na incubadora.
    8. Lugar de 10 µ l da mistura para o hemocytometer.
  2. Contar as células
    1. Use o objectivo de X 10 do microscópio e concentrar as linhas de grade do hemocytometer.
    2. Conte as células em cinco pequenos quadrados (Figura 2).
    3. Multiplique o número contado por 50.000 para estimar o número de células por mililitro.

4. diferenciação de células-tronco mesenquimais do ovário

Nota: Diferenciação ensaios foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas em Hill et al . 9.

  1. Semente de 1,0 x 104 células por poço, em triplicado, usando um prato de cultura 4-bem.
  2. Adicione 1 mL de mídia de expansão.
  3. Agite suavemente o prato com movimentos circulares.
  4. Após 24 h, substitua os meios de cultura com os meios de diferenciação desejável.
  5. Para osteogênica, adipogenic e chondrogenic de diferenciação, incubam as células com os meios de indução para 30 d, com substituição de mídia cada 3 kits de diferenciação específica d. foram utilizados para cada um destes ensaios.
  6. Para a diferenciação da linhagem neurogênica, Incube as celulas para 10 d na mídia da indução, com a substituição de mídia cada 3 d. A mídia utilizada aqui contidos DMEM baixa glicose, ácido valproico de 2 mM, 1 hidrocortisona µM, 10 µM forskolin, cloreto de potássio de 5 mM, 5 µ g/mL insulina e 200 µM butil hidroxianisolo.
  7. Para os precursores de endoderme, incube 5D em mídia endoderme conforme as instruções do fabricante reagente.
  8. Para a diferenciação da linhagem primordial de células germinativas, Incube as celulas na mídia indução para 14 d, com substituição de mídia cada 3 d. A mídia utilizada aqui contidos DMEM, 10% FBS, piruvato de sódio 1 mM, 10 ng/mL LIF, aminoácidos não essenciais de 1 mM, 2 mM L-glutamina, 5 µ g/mL insulina, 0,1 mM β-Mercaptoetanol, 60 putrescina µM, 20 transferrina µ g/mL, 10 ng/mL do mouse fator de crescimento epidérmico, humano de 1 ng/mL fator de crescimento fibroblástico básico, 40 ng/mL humanos gliais celular fator neurotrófico derivado de linha e penicilina de 15 mg/L.

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Resultados

Isolamento de células-tronco mesenquimais de ovário canino:

O procedimento de isolamento de MSC ovário está resumido na Figura 1. Após a cirurgia, tecido de picagem, digestão de colagenase e uma mudança de mídia 3 h após o início da cultura, uma população de MSC putativa com propriedades de plástico adesivo rápidas foi com êxito isolada de tecido ovariano canino. As...

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Discussão

Aqui nós fornecemos evidências que MSCs podem ser isolados de tecido ovariano canino, que é considerado lixo biológico após ovariectomia. Devido ao fato de que muitos tipos de células podem ser encontrados no ovário, propusemos um protocolo para selecionar MSCs baseadas sua rápida aderência ao plástico, que com sucesso selecionado células que cresceram em uma monocamada com uma morfologia de fibroblasto tipo.

O primeiro relatório da derivação do MSCs da medula óssea baseou-se na capacidade de ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o programa de esterilização canina na UNESP-FCAV para gentilmente fornecendo os ovários. Este trabalho foi financiado por doações da FAPESP (processo n º 2013/14293-0) e a CAPES.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DPBS Thermo Fisher14190144
Collagenase IThermo Fisher17100017
Frasco de tecidoCorningCLS3056
DMEM baixa glicoseThermo Fisher11054020
FBSThermo Fisher12484-010
TrypLE expressThermo Fisher12604021
StemPro Kit de Diferenciação de AdipogêneseThermo FisherA1007001
Kit de Diferenciação de Condrogênese StemProThermo FisherA1007101
Kit de Diferenciação de Osteogênese StemPro Kit de Diferenciação de OsteogêneseThermo FisherA1007201
STEMdiffStemCell5110
Penicilina-EstreptomicinaThermo Fisher15070063
CD45AbD SerotecMCA 2035S
CD34AbD SerotecMCA 2411GA
CD90AbD SerotecMCA 1036G
CD44AbD SerotecMCA 1041
NestinMiliporeMAB353
β-Tubulina MiliporeMAB1637
DDX4InvitrogenPA5 -23378
IgG- FITCAbD SerotecSTAR80F
IgG-FITC AbD SerotecSTAR120F

Referências

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