Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

Resumo

Para testar os efeitos inibitórios dos agentes farmacológicos na fosfolipase C (PLC) em diferentes regiões do cérebro de abelhas, apresentamos um ensaio bioquímico para medir a atividade PLC nessas regiões. Este ensaio pode ser útil para comparar a atividade PLC entre os tecidos, assim como entre abelhas exibindo comportamentos diferentes.

Resumo

A abelha é um organismo modelo para avaliação de comportamentos complexos e função cerebral, como aprendizagem, memória e divisão do trabalho. O corpo de cogumelo (MB) é um centro de cérebro superior proposto para ser o substrato neural dos comportamentos complexos da abelha. Embora estudos anteriores identificaram genes e proteínas diferencialmente expressas no MBs e outras regiões do cérebro, as atividades das proteínas em cada região não são ainda totalmente compreendidas. Para revelar as funções destas proteínas no cérebro, análise farmacológica é uma abordagem viável, mas é primeiro necessário para confirmar que manipulações farmacológicas de fato alteram a atividade de proteínas nestas regiões do cérebro.

Anteriormente, identificamos uma maior expressão dos genes que codificam a fosfolipase C (PLC) no MBs do que em outras regiões do cérebro e farmacologicamente avaliado o envolvimento do PLC no comportamento de abelhas. Nesse estudo, bioquimicamente testamos dois agentes farmacológicos e confirmou que eles diminuíram a atividade PLC no MBs e outras regiões do cérebro. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de como detectar atividade PLC na abelha cerebral homogeneizado. Neste sistema de ensaio, homogenates derivados de regiões diferentes do cérebro são reagiu com um substrato fluorogenic sintético, e fluorescência resultantes da actividade da PLC é quantificada e comparada entre regiões do cérebro. Também descrevemos a nossa avaliação dos efeitos inibitórios de certas drogas na atividade PLC, usando o mesmo sistema. Embora este sistema seja provável afetado por outros compostos endógenos fluorescência e/ou a absorção dos componentes do ensaio e tecidos, a medição da atividade PLC, usando este sistema é mais seguro e mais fácil do que usando o ensaio tradicional, que necessita de substratos radiolabeled. O procedimento simples e manipulações nos permitem examinar a atividade PLC no cérebro e outros tecidos das abelhas envolvidos nas diferentes tarefas sociais.

Introdução

A Europeu abelhas (Apis mellifera L.) é um inseto eusocial e abelhas femininas mostram reprodução da casta-dependente e dependente da idade de divisão do trabalho. Por exemplo, na casta estéril de abelhas, conhecido como "trabalhadores", indivíduos mais jovens alimentam as ninhadas quando mais velhos forragem néctar e pólen fora da colmeia¹. Aprendizagem e memória capacidade é criticamente importante na vida da abelha, porque operárias devem repetidamente ir e voltar entre fontes de alimento e seu ninho e então comunicar os locais das fontes de boa comida para seus nestmates através da dança comunicação¹. Estudo....

Protocolo

1. captura de abelhas operárias

1. Colônias de abelhas de compra de um distribuidor local.
2. Usando uma rede do inseto, pega as abelhas campeiras que voltar para a colmeia com os sacos de pólen em suas patas. Transferir as abelhas para um padrão 50 mL tubo cônico de plástico e tampa do tubo (Figura 1). Colocar o tubo no gelo para anestesiar as abelhas.
   Nota: Use as jaquetas designadas para apicultura evitar picadas de abelha. Abelhas de enfermagem também podem ser coletadas dependendo do experimento. Pegar as abelhas de enfermeira, observar o comportamento da abelha no pente cera e capturar as abelhas de enfermeira, que ....

Resultados

Concentrações de proteína no cérebro Homogenates:
Estamos dispostos a homogenates usando abelhas campeiras. As concentrações de proteína calculada em homogenates o original são mostradas na Figura 3. As concentrações de proteína aproximado em homogeneizado o original foram como segue: 1,5 mg/mL no MBs e 2,3 mg/mL em outras regiões do cérebro. Nós usamos duas abelhas por lote e seis lotes foram analisados.

Discussão

O exame bioquímico de atividade da proteína é profundamente importante para a compreensão molecular de sinalização no cérebro, porque a atividade de uma enzima é afectada por várias moléculas, tais como substratos e inibidores e pode, assim, mudar junto com comportamento animal (por exemplo, aprendizagem e memória)⁵. Em estudos de abelhas, enzimas como a adenilato ciclase, GMP cíclico-dependente da proteína quinase, PKC, CaMKII fosforilada e AMP cíclico-dependente da proteína quinase A sã.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de ensaio de proteína Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	23227	O kit de reagentes para medição da concentração de proteína
Pierce Bovine Serum Albumina Standard Ampoles 2mg/mL	ThermoFisher Scientific	23209	As amostras padrão usadas no ensaio BCA
Cera de parafina	GC	13B1X00155000141	Cera dental usada como estágio de dissecação
Pino de inseto	Shiga	No. 0	Cabeça contínua e inoxidável
PLCglow	KXT Bio	KCH-0001	Um substrato fluorogênico de microplaca PLC
de 384 poços	Corning	4511	Placa de baixo volume, fundo redondo na cor preta
Leitor de microplacas Gemini EM	Molecular Devices
Edelfosine	Santa Cruz Biotechnology	sc-201021	inibidor
pan-PLCSulfato de neomicina	Santa Cruz Biotecnologia	sc-3573	inibidor pan-PLC