Artigo de método

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

DOI:

10.3791/58173

⸱

14 de setembro de 2018

 ,  , 
1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para testar os efeitos inibitórios dos agentes farmacológicos na fosfolipase C (PLC) em diferentes regiões do cérebro de abelhas, apresentamos um ensaio bioquímico para medir a atividade PLC nessas regiões. Este ensaio pode ser útil para comparar a atividade PLC entre os tecidos, assim como entre abelhas exibindo comportamentos diferentes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A abelha é um organismo modelo para avaliação de comportamentos complexos e função cerebral, como aprendizagem, memória e divisão do trabalho. O corpo de cogumelo (MB) é um centro de cérebro superior proposto para ser o substrato neural dos comportamentos complexos da abelha. Embora estudos anteriores identificaram genes e proteínas diferencialmente expressas no MBs e outras regiões do cérebro, as atividades das proteínas em cada região não são ainda totalmente compreendidas. Para revelar as funções destas proteínas no cérebro, análise farmacológica é uma abordagem viável, mas é primeiro necessário para confirmar que manipulações farmacológicas de fato alteram a atividade de proteínas nestas regiões do cérebro.

Anteriormente, identificamos uma maior expressão dos genes que codificam a fosfolipase C (PLC) no MBs do que em outras regiões do cérebro e farmacologicamente avaliado o envolvimento do PLC no comportamento de abelhas. Nesse estudo, bioquimicamente testamos dois agentes farmacológicos e confirmou que eles diminuíram a atividade PLC no MBs e outras regiões do cérebro. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de como detectar atividade PLC na abelha cerebral homogeneizado. Neste sistema de ensaio, homogenates derivados de regiões diferentes do cérebro são reagiu com um substrato fluorogenic sintético, e fluorescência resultantes da actividade da PLC é quantificada e comparada entre regiões do cérebro. Também descrevemos a nossa avaliação dos efeitos inibitórios de certas drogas na atividade PLC, usando o mesmo sistema. Embora este sistema seja provável afetado por outros compostos endógenos fluorescência e/ou a absorção dos componentes do ensaio e tecidos, a medição da atividade PLC, usando este sistema é mais seguro e mais fácil do que usando o ensaio tradicional, que necessita de substratos radiolabeled. O procedimento simples e manipulações nos permitem examinar a atividade PLC no cérebro e outros tecidos das abelhas envolvidos nas diferentes tarefas sociais.

Introdução

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A Europeu abelhas (Apis mellifera L.) é um inseto eusocial e abelhas femininas mostram reprodução da casta-dependente e dependente da idade de divisão do trabalho. Por exemplo, na casta estéril de abelhas, conhecido como "trabalhadores", indivíduos mais jovens alimentam as ninhadas quando mais velhos forragem néctar e pólen fora da colmeia1. Aprendizagem e memória capacidade é criticamente importante na vida da abelha, porque operárias devem repetidamente ir e voltar entre fontes de alimento e seu ninho e então comunicar os locais das fontes de boa comida para seus nestmates através da dança comunicação1. Estudos anteriores demonstraram que o MB, um centro maior do cérebro em insetos, está envolvida na aprendizagem e memória capacidade da abelha2,3,4. Genes diferencialmente expressos e proteínas foram identificadas em várias regiões do cérebro das abelhas5,6,7,8,9,10 ,11, sugerindo que eles estão relacionados com as funções exclusivas de cada região do cérebro. Embora a inibição farmacológica ou ativação de uma proteína de interesse é uma abordagem bem utilizada para revelar a função da proteína no comportamento de abelhas a12,13,14, é desconhecido se todos drogas. têm efeitos funcionais em diferentes regiões do cérebro de abelhas. A validação das funções dessas drogas reforçará as conclusões em estudos de farmacologia comportamental.

Aqui, focalizamos PLC, uma das enzimas implicadas no rato cognição15,16,17,18. Cálcio de gatilhos PLC sinalização degradando o fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) em inositol 1, 4,5-triphosphate (IP3) e diacilglicerol (DAG)19,20,21. IP3 abre receptores IP3 , sobre o retículo endoplasmático (ER), levando à liberação de íons cálcio da emergência. O cálcio liberado ativa tanto cálcio-dependente/calmodulina proteína quinase II (CaMKII) com calmodulina e proteína quinase C (PKC) na presença de DAG. Ambos quinases de proteína estão envolvidos na aprendizagem e memória22,23, consistente com o envolvimento de PLC neste processo. CLPs são classificados em subtipos, incluindo PLCβ, PLCγ e PLCε, com base em suas estruturas de20. Cada subtipo PLC é ativado em um contexto diferente de20, e os genes que codificam os subtipos são diferencialmente expressos em diferentes tecidos. Demonstramos anteriormente que a abelha MBs expressam genes que codificam os subtipos PLCβ e PLCε em níveis mais elevados do que o restante de regiões cerebrais24, e que dois inibidores de pan-PLC (edelfosine e neomicina sulfato [neomicina]) diminuem a atividade PLC em diferentes regiões do cérebro e, de fato, afetar a capacidade de aprendizagem e memória do abelha24.

Tradicionalmente, a atividade enzimática da PLC foi medida usando radiolabeled PIP225, que requer instalações, equipamento e treinamento apropriado. Recentemente, um substrato fluorogenic sintético de PLC tem sido estabelecida26, tornando mais fácil para avaliar a atividade PLC em laboratório padrão. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para detectar atividade PLC em regiões cerebrais diferentes da abelha utilizando o substrato fluorogenic e posteriormente testar os efeitos inibitórios da edelfosine e neomicina no PLC nestes tecidos. Porque o protocolo exige apenas manipulações básicas, pode ser aplicável aos estudos da atividade PLC em outros tecidos ou áreas do cérebro em abelhas atribuídas tarefas sociais diferentes.

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Protocolo

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1. captura de abelhas operárias

  1. Colônias de abelhas de compra de um distribuidor local.
  2. Usando uma rede do inseto, pega as abelhas campeiras que voltar para a colmeia com os sacos de pólen em suas patas. Transferir as abelhas para um padrão 50 mL tubo cônico de plástico e tampa do tubo (Figura 1). Colocar o tubo no gelo para anestesiar as abelhas.
    Nota: Use as jaquetas designadas para apicultura evitar picadas de abelha. Abelhas de enfermagem também podem ser coletadas dependendo do experimento. Pegar as abelhas de enfermeira, observar o comportamento da abelha no pente cera e capturar as abelhas de enfermeira, que arrancar suas cabeças em células ninhadas para alimentar as larvas, pelo ala ou tórax usando uma pinça. Em seguida, colocar as abelhas em um tubo de plástico de 50 mL, tampa do tubo e colocá-lo no gelo, como mencionado na etapa 1.2.
  3. Capture 12 operárias aleatoriamente.
    Nota: Este protocolo usa duas abelhas por lote, resultando em seis lotes. Várias abelhas podem ser pego em um tubo, e o número de abelhas em um único tubo não é importante, como as abelhas em cada lote são combinadas mais tarde (ver passo 3.1.1). Manter a calma de tubo no verão, como a alta temperatura no tubo fere as abelhas.

2. dissecação do cérebro de abelhas

  1. No laboratório, coloca o tubo de 50 mL no gelo pelo menos 30 min6 anestesiar as abelhas.
  2. Para preparar a fase de dissecação, dobre um pedaço de cera dental na metade (o tamanho resultante é de cerca de 3,5 x 7,5 cm) e empurre-a em um prato de plástico (60 x 15 mm).
    Nota: A cera dobrada firmemente mantém os pinos do insetos.
  3. Sob um microscópio binocular, separar a cabeça da abelha do seu corpo com uma pinça e corrigi-lo na cera dental através da inserção de pinos de insetos na base de cada antena para segurar a parte anterior da cabeça em posição ascendente(Figura 2).
    Nota: Lave a pinça antes de usar, usando álcool ou água esterilizada.
  4. Despeje bastante solução salina (NaCl de 0,13 mol/L, 5 mmol/L KCl e 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) na cabeça para cobri-lo. Perfure a cabeça novamente com os pinos se a cabeça flutua na solução. Use uma solução salina gelada, se necessário.
    Nota: No entanto, este protocolo funciona sem a solução salina fria.
  5. Retire as antenas usando uma pinça (Figura 2B).
  6. Fazer um corte horizontal perto as bases das antenas e longitudinalmente na fronteira entre os olhos compostos, usando um bisturi. Em seguida, fazer um corte horizontal no topo da cabeça. Remova a cutícula para abrir uma janela sobre o cérebro (Figura 2C).
    Nota: Se necessário, lave o bisturi com etanol ou água esterilizada antes do uso.
  7. Remova o retinae os ocelos e os tracheae na superfície anterior do cérebro, usando uma pinça (Figura 2D).
  8. Expanda o corte na fronteira entre os olhos compostos dorsalmente e ventralmente, usando o bisturi(Figura 2). Em seguida, remova o tecido conjuntivo entre a cutícula dos olhos compostos e retinae inserindo a pinça diretamente sob a cutícula do olho (Figura 2-F).
  9. Descarte a cutícula dos olhos compostos. Escolher as pontas dorsais da retinae dos olhos compostos com uma pinça e mover a pinça na direção ventral, cuidadosamente Descole o retinae (Figura 2G).
  10. Remova cuidadosamente o restante tracheae na superfície anterior do cérebro, usando uma pinça (Figura 2H).
  11. Cortar o tecido conjuntivo entre o cérebro e ao redor dos tecidos, usando uma pinça e dissecar o cérebro da cabeça cápsula (Figura 2H).
  12. Retire os tracheae na superfície posterior do cérebro, usando uma pinça (Figura 2eu).
  13. Usando um bisturi, corte a conexão entre o MBs e outras regiões do cérebro ao lado dos lóbulos verticais, que são parte da MBs (Figura 2J).
  14. Lugar do MBs dissecado e restantes tecidos cerebrais para tubos de 1,5 mL e rapidamente congelá-los com gelo seco ou nitrogênio líquido (Figura 2K). Armazene os tecidos congelados a-80 ° C até o uso.
    Nota: Lidar com nitrogênio líquido com o designado luvas e ventilação para evitar asfixia e queimaduras de fria. Gelo seco também devem ser manuseado com cuidado, com luvas. O protocolo pode ser pausado aqui. A dissecção e armazenamento do cérebro tecidos devem ser realizada uma abelha de cada vez para evitar a degradação de proteínas.

3. preparação do cérebro Homogenates

  1. Adicionar 10 µ l de tampão de homogeneização compreendendo de 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl e 1,0 mmol/L de CaCl2 para o congelado tecido do cérebro e homogeneizar o tecido no tubo de 1,5 mL, manualmente, aplicando pressão com um pilão de plástico. Derrame o tecido pelo menos 200 x.
    Nota: Execute as manipulações descritas no capítulo 3 no gelo. Use um pilão encaixe bem no tubo suficientemente esmagar os tecidos, que facilmente flutuar no buffer de homogeneização.
    1. Transferir a solução de homogeneizado de tecido para o tecido próximo no lote e homogeneizar o tecido da mesma forma.
      Nota: As abelhas em cada lote são combinadas neste passo. Este protocolo usa seis lotes.
  2. Adicione 30 µ l de tampão de homogeneização.
  3. Centrifugar a amostra de tecido homogeneizado por 10 min aproximadamente 900 x g27 e 4 ° C.
  4. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e centrifuga-lo novamente por 20 min em aproximadamente 9.500 x g27 e 4 ° C.
  5. Coloque o sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mL. Armazene o homogenate a-20 º C até o uso.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
  6. Determine a concentração de proteína usando o bicinchoninic ácido (BCA) ensaio.
    1. Diluir 2,5 µ l do homogeneizado com 17,5 µ l de água esterilizada (assim, diluindo o homogenate oito vezes) e usar todo o homogenate diluído.
      Nota: Amostragem homogenate utilizando uma micropipeta deve ser executada com cuidado por causa de sua alta viscosidade.
    2. Realize o ensaio BCA usando 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 e 2,0 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) em 20 µ l como padrões.
      Nota: Alterar a escala do ensaio do BCA, conforme necessário, baseado no volume do homogeneizado e amostras-padrão. O protocolo pode ser pausado aqui.

4. PLC reação no cérebro Homogenates

  1. Prepare a solução-mãe de fluorogenic substrato WH-1526 dissolvido em água esterilizada a 50 µmol/L e armazená-lo a-80 ° C.
    Nota: Cobrir as soluções contendo o substrato com folha para evitar o desbotamento.
  2. Preparar a pré-mistura de reação no volume necessário para alcançar a seguinte composição em 10 µ l da mistura reacional: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, 1,0 mmol/L CaCl2, 2,0 mmol/L ditiotreitol, 50 mg/L, BSA e 12,5 µmol/L WH-15.
  3. Dilua o homogeneizado com tampão de homogeneização, se necessário.
  4. Misture a pré-mistura de reação e homogeneizado contendo 1,3 µ g de proteínas em um tubo de reação em cadeia (PCR) polimerase para alcançar um volume final de 10 µ l da mistura reacional.
    1. Preparar dois tipos de misturas de controle para a análise estatística: colocar o homogenate mas não WH-15 na mistura (mistura de controle 1) e vice-versa (mistura de controle 2).
      Nota: Prepare as misturas de reação e controle de misturas no gelo para evitar a degradação das proteínas e reação de PLC. Misturas de controle 1 e 2 são usadas para detectar a fluorescência do homogeneizado e substrato livre, respectivamente.
  5. Lave o tubo e incube-lo em um termociclador por 30 min a 25 ° C.
  6. Pare a reação adicionando 2 µ l de 25 bis de etileno glicol mmol/L (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético.
    Nota: Quantidades adequadas de proteína e tempos de reação variam entre experimentos. Assim, para otimizar a condição de reação, pode ser necessário repetir os procedimentos descritos nas etapas 4.1-5.3 nos experimentos preliminares, alterando a proteína quantidade e incubação tempo até que a fluorescência aumenta linearmente. Para referência, quando é usado o homogenate derivado as outras regiões do cérebro, a reação normalmente funciona linearmente com 1,3 µ g ou menos de proteínas dentro de 30 min, mas a linearidade diminui com pelo menos 2,7 µ g de proteínas ou com um tempo de incubação de 90 min ou lo dedo.

5. detecção de fluorescência resultantes da actividade da PLC

  1. Centrifugue a mistura reacional e misturas de controle durante 5 min à aproximadamente 310 x g28 e transferir 10 µ l do sobrenadante para poços diferentes em uma microplaca de 384-bem aplicável para a deteção de fluorescência.
    Nota: Para evitar uma contaminação com poeira e desvanecimento, cubra o prato com papel alumínio.
  2. Irrigue a microplaca utilizando uma centrífuga para a microplaca.
  3. Coloque a placa em um leitor de microplacas e detectar fluorescência com um técnico triplicado.
    Nota: Os comprimentos de onda de excitação e emissão são 344 nm e 530 nm, respectivamente. Se for o caso (dependendo do leitor de microplacas), misturar as misturas de amostra para 5 s antes de cada detecção. O protocolo pode ser parado aqui.

6. teste da ação inibitória de agentes farmacológicos

  1. Preparar soluções estoque de edelfosine e neomicina nas concentrações adequadas e armazená-los até o uso: edelfosine a 5,0 mmol/L e -20 ° C; neomicina em 550 mmol/L e 4 ° C.
  2. Ao preparar a pré-mistura de reação, conforme descrito na etapa 4.2., adicionar inibidores para a pré-mistura para alcançar as concentrações finais apropriadas: edelfosine, 1,0 mmol/L; neomicina, 0.55 mmol/L.
  3. Adicione o homogeneizado para as misturas de pré-mistura e apropriado de controle de reação etapa 4.4.
    1. Preparar três tipos de misturas de controle: colocar o homogeneizado e inibidor, mas não o substrato mistura de controle 1; Adicione o substrato e inibidor mas não o homogeneizado na mistura de controle 2; e colocar o inibidor, mas não o homogeneizado ou substrato mistura de controle 3.
  4. Realize a reação de PLC e detecção de fluorescência como descrito nos passos 4,5-5,3.

7. análise estatística

  1. Para a detecção de atividade PLC utilizando as misturas descritas na seção 4, calcule a fluorescência derivada da reação entre PLC e o substrato subtraindo-se a fluorescência emitida a partir do homogeneizado ou substrato livre como segue.

    FL (atividade PLC) = Fl (mix de reação) - {Fl (Ctrl + 1) + Fl (Ctrl + 2)}
    ​
    Nota: Fl (atividade PLC), Fl (mistura de reação), Fl (Ctrl + 1) e Fl (Ctrl + 2) denotam a fluorescência de bona fide derivada da atividade PLC, fluorescência detectada na mistura de reação e misturas de controle 1 e 2, respectivamente.
    1. Após a medição de fluorescência nas misturas conforme descrito nas etapas 4.1-5.3, calcule Fl (atividade PLC) de acordo com a equação na etapa 7.1 e então a média Fl (atividade PLC) do técnico triplicado para cada homogeneizado.
    2. Usando o Fl média (atividade PLC) do triplicado técnico obtido na etapa 7.1.1, calcular novamente a média Fl (atividade PLC) de réplicas biológicas o MBs e outras regiões do cérebro e comparar os valores entre os tecidos do cérebro.
  2. Para a análise da atividade PLC na presença de inibidores, utilizando as misturas descritas na secção 6, calcule a fluorescência derivada da reação entre o homogeneizado, substrato e inibidor da seguinte maneira.

    FL (atividade PLC com inibidor) = Fl (mix de reação) - {Fl (Ctrl + 1) + Fl (Ctrl + 2)} + Fl (Ctrl + 3)

    Nota: Aqui, Fl (atividade PLC com inibidor) é bona fide fluorescência resultantes da actividade da PLC na presença do inibidor. FL (mistura de reação), Fl (Ctrl + 1), Fl (Ctrl + 2) e Fl (Ctrl + 3) são sinais de fluorescência detectados na mistura de reação, a mistura de controle 1, controlam de mistura 2 e a mistura de controle 3, respectivamente.
    1. Após a medição de fluorescência nas misturas conforme descrito nas etapas 6,1-6,4, calcule Fl (atividade PLC com inibidor) de acordo com a equação na etapa 7.2. Em seguida, obter a média Fl (atividade PLC com inibidor) do técnico triplicado para cada homogeneizado.
    2. Usando o valor médio calculado na etapa 7.2.1, calcule a média Fl (atividade PLC com inibidor) de réplicas biológicas derivadas de cada tecido cerebral. Compare o Fl (atividade PLC com inibidor) e o Fl (atividade PLC) obtido na etapa 7.1.2 em cada tecido cerebral.

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Resultados

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Concentrações de proteína no cérebro Homogenates:
Estamos dispostos a homogenates usando abelhas campeiras. As concentrações de proteína calculada em homogenates o original são mostradas na Figura 3. As concentrações de proteína aproximado em homogeneizado o original foram como segue: 1,5 mg/mL no MBs e 2,3 mg/mL em outras regiões do cérebro. Nós usamos duas abelhas por lote e seis lotes foram analisados.

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O exame bioquímico de atividade da proteína é profundamente importante para a compreensão molecular de sinalização no cérebro, porque a atividade de uma enzima é afectada por várias moléculas, tais como substratos e inibidores e pode, assim, mudar junto com comportamento animal (por exemplo, aprendizagem e memória)5. Em estudos de abelhas, enzimas como a adenilato ciclase, GMP cíclico-dependente da proteína quinase, PKC, CaMKII fosforilada e AMP cíclico-dependente da proteína quinase A sã...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figura 4B - 4D foi modificado de Suenami et al . 24 com a permissão do aberto de biologia. Os autores são gratos ao Publicador para a permissão. Este trabalho foi apoiado pela humana Frontier Science Program (RGY0077/2016) para Shota Suenami e Ryo Miyazaki.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de ensaio de proteína Pierce BCAThermoFisher Scientific23227O kit de reagentes para medição da concentração de proteína
Pierce Bovine Serum Albumina Standard Ampoles 2mg/mLThermoFisher Scientific23209As amostras padrão usadas no ensaio BCA
Cera de parafinaGC13B1X00155000141Cera dental usada como estágio de dissecação
Pino de insetoShigaNo. 0Cabeça contínua e inoxidável
PLCglowKXT BioKCH-0001Um substrato fluorogênico de microplaca PLC
de 384 poçosCorning4511Placa de baixo volume, fundo redondo na cor preta
Leitor de microplacas Gemini EMMolecular Devices
EdelfosineSanta Cruz Biotechnologysc-201021inibidor
pan-PLCSulfato de neomicinaSanta Cruz Biotecnologiasc-3573inibidor pan-PLC

Referências

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