Summary
Här, anställer vi en trycksatt varmvatten utvinning (PHWE) metod, som använder en omodifierad hushållens espressomaskin för att introducera studenterna till naturprodukter kemi i laboratoriet. Två experiment presenteras: PHWE av eugenol och acetyleugenol från kryddnejlika och PHWE av seselin och (+)-epoxysuberosin från australiska växten Correa reflexa.
Abstract
En nyligen utvecklad trycksatt varmvatten utvinning (PHWE) metod som utnyttjar en omodifierad hushållens espressomaskin för att underlätta naturprodukter forskning finns också program som ett verktyg för effektiv undervisning. Specifikt, har denna teknik använts för att introducera andra och tredje år studenter till aspekter av naturprodukter kemi i laboratoriet. I denna rapport presenteras två experiment: PHWE av eugenol och acetyleugenol från kryddnejlika och PHWE seselin och (+)-epoxysuberosin från de endemiska australiska växtarterna Correa reflexa. Genom att anställa PHWE i dessa experiment, den rå nejlika extrakt, berikad med eugenol och acetyleugenol, erhölls i 4-9% w/w från kryddnejlika av andra året grundutbildningsstudenter och seselin och (+)-epoxysuberosin isolerades i avkastning upp till 1,1% w/w och 0,9% w/w från C. reflexa av tredje årets studerande. Före detta utövande utvecklades som en ersättning för traditionella ånga destillation experimentet som ger en introduktion till utvinning och separation tekniker, medan den sistnämnda verksamheten med guidad-förfrågan undervisningsmetoder i ett försök att simulera naturliga produkter Bioprospektering. Detta härrör främst från den snabba typ av denna PHWE teknik i förhållande till traditionella extraktionsmetoder som ofta är oförenligt med de tidsbrist som är associerad med grundutbildning laboratorieexperiment. Denna snabba och praktiska PHWE metod kan användas för att effektivt isolera olika klasser av organiska molekyler från olika växtarter. Den kompletterande karaktären av denna teknik i förhållande till mer traditionella metoder har också visats tidigare.
Introduction
Isolering och identifiering av naturliga produkter är av grundläggande betydelse för forskarvärlden och samhället generellt. 1 Bioprospektering, sökandet efter värdefulla organiska molekyler som finns i naturen, förblir en nödvändig process i upptäckten av nya drug leads och potentiella terapeutiska medel. Det uppskattas att från 1981-2014 ~ 75% av alla godkända småmolekylära läkemedel var naturliga produkter, naturliga produkt-härledda eller naturlig produkt-inspirerade. 1 dessutom naturprodukter besitter enorma strukturella och kemiska mångfald. Av denna anledning representerar de också värdefulla kemiska ställningar som kan användas direkt i organisk syntes eller i utvecklingen av kirala ligander och katalysatorer. 2 , 3
Traditionellt, har relativt tidskrävande förfaranden såsom maceration, Soxhlet utvinning och ånga destillation varit stöttepelaren i forskning inriktad på isoleringen av sekundära metaboliter från växter. 4 mer moderna utvinning tekniker, inklusive accelererad vätskeextraktion, har fokuserat på att minska utvinning gånger och inrättande av grönare protokoll. 4 , 5 under 2015 rapporterades en originell metod för trycksatt varmvatten-utvinning (PHWE). 6 denna teknik anställd espressomaskin med omodifierade hushåll att underlätta snabb och särskilt effektiv utvinning av shikimic syra från star anis. Espressomaskiner har specifikt utformad och konstruerad för att extrahera organiska molekyler från lämpligt marken kaffebönor. För att uppnå detta, dessa instrument värma vatten vid temperaturer upp till 96 ° C och vid tryck på typiskt 9 bar. 7 med detta i åtanke, det är kanske inte förvånande att espressomaskiner kan utnyttjas effektivt extrahera naturliga produkter från en rad olika växtmaterial.
Senare studier som involverar en mängd terrestrial växtarter har visat kapacitet av denna PHWE teknik effektivt extrahera naturprodukter över ett relativt brett polaritet utbud. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 vidare föreningar innehållande något känsliga funktionella grupper, såsom aldehyder, epoxider, glykosider och potentiellt epimerizable stereogenic centrerar var vanligen opåverkad av extraheringen. Den kompletterande karaktären av denna teknik i förhållande till mer traditionella metoder har också påvisats. 12 , 16 detta PHWE metod har också varit anställd att isolera flera gram kvantiteter av naturliga produkter som har använts för att förbereda nya naturprodukt derivat och komplex molekyl syntes mer generellt. 8 , 11 , 17
Det identifierades att detta nya PHWE-metoden skulle kunna fungera som ett användbart läromedel som kunde ingå i grundutbildning laboratorium. Detta härrör främst från den snabba typ av denna teknik i förhållande till de traditionella extraktionsmetoder som ofta är oförenligt med de tidsbrist som är associerad med grundutbildning laboratorieexperiment. Följaktligen, denna teknik ersatt det traditionella grundutbildningsprogram kemi laboratorie experiment fokuserade på utvinning av eugenol från kryddnejlika anställa steam-destillering vid University of Tasmania. 9 , 18 sedan den tiden, variationer av detta experiment har antagits av andra universitet och en modifierad experiment med fokus på PHWE av kryddnejlika nu funktioner i programmet grundutbildningsprogram kemi laboratorium vid University of Sydney (vide infra ).
För att demonstrera de praktiska och genomförbarhet sysselsätter denna nya PHWE strategi för undervisningsändamål, presenteras två protokoll som en del av denna studie. Den första delen av detta betänkande belyser ett experiment på PHWE av eugenol och acetyleugenol från kryddnejlika som är del av det andra års grundutbildningsprogram laboratorium programmet vid University of Sydney (figur 1). Detta experiment serverar att introducera studenterna till naturprodukter kemi samtidigt utveckla grundläggande praktiska färdigheter. Den andra delen har ett experiment på PHWE av det endemiska australiska växtart Correa reflexa som ingår i programmet tredje år grundutbildningsprogram laboratorium vid University of Tasmania (figur 2). Detta experiment är utformad för att simulera naturliga produkter Bioprospektering och stärka core laboratorietekniker. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Det är tillrådligt att alla procedurer utförs i dragskåp. Studenter måste bära lämplig personlig skyddsutrustning vid alla tidpunkter i laboratoriet och säkerhetsdatablad (SDS) associerade med varje reagens måste rådfrågas före användning.
1. PHWE av kryddnejlika: isolering av eugenol och acetyleugenol
- Utvinning av eugenol och acetyleugenol från kryddnejlika
- Placera grovt malda kryddnejlikor (12,5 g) i en 250 mL-bägare.
- Lägg sand (12,5 g) till de kryddnejlika slipar och blanda väl.
- Samla en portafiltret (prov fack) och fyll korgen med hela kryddnejlika-sand blandningen. Lätt komprimera provet med Sabotageskydd.
Obs: Komprimera inte blandningen alltför mycket eller vätska kommer inte att flöda genom. - Placera portafiltret in espressomaskinen och placera en ren 250 mL-bägare därunder. Lägga till en 30% etanol/H2O lösning i vattenbehållaren av espresso om det är mindre än halvfull.
- Använda espressomaskinen för att samla 100 mL av extraktet.
Obs: Kontakta instruktör om maskinen verkar vara igensatta. - Tillåta portafiltret avsluta droppande och sedan ta bort det från espressomaskinen.
Varning: De slipar och omgivande metall områden kommer att vara varm. - Med hjälp av en spatel, de kryddnejlika slipar ta bort portafiltret och kasta i papperskorgen.
- Skölj de kvarvarande fasta från portafiltret med H2O under en kran i diskbänken och returnera den för nästa person att använda.
- Cool kryddnejlika extrakt i ett isbad tills temperaturen har reducerats till minst 30 ° C.
- Placera extraktet i en 250 mL separatory tratt, tillsätt 30 mL hexan och skaka försiktigt.
- Plats separertratten i en ring klämma monteras på retorten ställning och tillåta vattenfasen och den organiska skikten separera sedan samla (lägre) vattenskiktet tillbaka in i 250 mL-bägare.
Obs: Det kan ta 10 minuter för lagrarna som ska separera. Eleverna uppmanas att genomföra lösningsmedel optimering av TLCs fördriva tiden väntan för den första separationen inträffar (se 1.2). - Överföra det organiska (översta) lagret (som innehåller produkten) till en ren 250 mL kolv och häll sedan botten (vattenskiktet) tillbaka till separatory tratten.
- Extrahera vattenskiktet ytterligare två gånger med hexan (2 x 30 mL).
- Kombinera de organiska (övre) skikt till samma kolven efter varje extraktion.
- Efter tredje vätska-vätska utvinning, häll det kombinerade ekologiska extraktet i den separatory tratten, och tvätta med 100 mL H2O genom skakning. Samla det organiska (översta) lagret i en ren 250 mL konisk kolv och torrt genom att lägga till MgSO4 och snurra kolven.
- Filtrera efterföljande blandningen genom veckat filtrerpapper som ingår i en glastratt i en pre vägde 250mL runda-botten kolv.
Obs: Den fasta återstoden (hydrerad MgSO4) kan kastas i avfallet. - Avdunsta lösningsmedlet (hexan) från insamlade filtratet med en rotationsindunstare (bad vattentemperatur: 60 ° C, vakuumtryck: 350 mbar) och åter väger den kolv som innehåller den resulterande oljan.
- Optimering av tunnskiktskromatografi (TK) lösningsmedel system
Obs: Som en grupp studenter kommer att tilldelas ett lösningsmedel system från 100:0 aceton: cyklohexan 0:100 aceton: cyklohexan av instruktören att identifiera förhållandet som ger den maximala upplösningen av eugenol från acetyleugenol.- Skaffa en TLC referenslösning av ren eugenol och acetyleugenol.
Obs: TLC Referenslösningar av ren eugenol och acetyleugenol utarbetades av laboratorieassistenter före laborationen. - På en TLC-plattan, markera en baslinje ~1.5 cm från botten med en mjuk blyertspenna. Bocka av tre jämnt fördelade punkter.
- Använd en TLC spotter för att upptäcka en droppe ren eugenol TLC referens lösning i ett körfält, en plats av ren acetyleugenol TLC referenslösning i tredje körfält och en plats för var och en i andra körfält (co plats).
- Kontrollera förekomsten av eugenol och acetyleugenol på TLC plattan genom att Visa plattan under en UV-lampa (254 nm) i TLC visning skåp.
Obs: Det ska vara små (1-2 mm brett) svarta fläckar på plattan där TLC referenslösningarna sågs. Om det finns inga fläckar eller fläckar syns svagt, tillämpa en annan plats av lämpliga TLC lösningen tills en svart fläck observeras under UV-ljus. - Tillsätt 10 mL av tilldelade lösningsmedel blandningen till en ren, torr TLC-burk.
Anmärkning: Se till att lösningsmedel höjden i burken inte överstiger ~ 1 cm. - Med pincett, placera beredd TLC plattan i TLC burken. Stäng locket på burken.
Obs: Lösningsmedlet skall ligga under baslinjen för den TLC-plattan. - Låt spädningsvätskan resor upp på TLC-plattan. När vätskan är ~ 1 cm från toppen av plattan, avlägsna TLC plattan från burken med pincett och markera raden av lösningsmedel framsidan med en penna.
- Låt lösningsmedlet avdunsta från TLC plattan (~ 1 min) sedan Visa TLC plattan under en UV-lampa (254 nm). Med en blyertspenna cirkla de svarta fläckar observerats på TLC plattan.
- Beräkna den bibehållande faktorn (Rf) av eugenol och acetyleugenol genom att dividera den tillryggalagda sträckan av föreningen av den tillryggalagda sträckan av lösningsmedlet.
- Beräkna skillnaden mellan de Rf värdena för eugenol och acetyleugenol (ΔRf).
- Dela resultatet med resten av klassen. Registrera retention värdena förvärvats av andra studenter med andra lösningsmedel nyckeltal.
- Identifiera vilket lösningsmedel system blir bäst att analysera rå eugenol lösning och efterföljande reningssteg.
Obs: Det bästa TLC lösningsmedel förhållandet kommer att ge största separationen mellan eugenol och acetyleugenol betecknas med största ΔRf -värdet. Om ΔRf ritas mot lösningsmedel sammansättning, ska grafen likna en klockformad kurva.
- Skaffa en TLC referenslösning av ren eugenol och acetyleugenol.
- Separation av eugenol och acetyleugenol av vätska-vätska utvinning
- Lägga till hexan (10 mL) i den råa eugenol-innehållande extrakt erhållits från steg 1.1.17 och häll över efterföljande lösningen i en 250 mL separatory tratt.
- Skölj runda-botten kolven med hexan (10 mL) och Lägg till detta att separatory tratten.
- Extrahera hexan lösningen med 3 M vattenlösning NaOH (2 x 25 mL) via vätska-vätska utvinning. Samla in och kombinera aqueous nedre lagren i en 250 mL e-kolv från varje utvinning. Samla det organiska lagret i en 50 mL konisk kolv och torrt genom att lägga till MgSO4 och snurra kolven.
FÖRSIKTIGHET: NaOH är frätande. Undvika kontakt med hud.
Obs: Acetyleugenol är fortfarande i det organiska lagret, medan eugenol är nu i alkaliska vattenextrakt (nedre lager). - Behålla den organiska skikt (organisk lösning A) för senare TLC analys.
- Snurra den koniska kolven som innehåller den alkaliska vattenlösning fraktionen från steg 1.3.3 i ett is-vatten-bad och sakta lägga 10 M vattenlösning HCl tills en vit emulsion bildas; kontrollera dess surhetsgrad med kongorött papper, med en pipett för att överföra en droppe av lösning på pH papper (det ska vända blå).
FÖRSIKTIGHET: HCl är frätande. Undvika kontakt med hud. Tillägg av HCl kan orsaka kraftig bubblande, HCl bör läggas noga, att hålla den koniska kolven på is.
Obs: Sammanlagt 20-30 mL HCl (10 M vattenlösning) kommer att krävas. - Extrahera den mjölkaktig vattenemulsion med hexan (2 x 30 mL), med vätska-vätska utvinning i en 250 mL separera kolv. Kontrollera att temperaturen i vätskeextraktet är rumstemperatur eller nedan innan du lägger till hexan. Kombinera de två hexan-extrakt i en ren 100 mL konisk kolv.
Obs: Eugenol kommer nu att kombinerade ekologiska (överst) lager (organisk lösning B). - Lägg till MgSO4 tork ekologisk lösning B.
- Analysera organisk lösning A, ekologisk lösning B, ren eugenol TLC referens och acetyleugenol TLC referens av TLC optimerad TLC lösningsmedel förhållandet identifierade i föregående session.
- Filtrera organisk lösning A och B genom veckat filtrerpapper till separat före vägde 250mL runda-botten kolvar. Kassera den fasta återstoden (hydrerad MgSO4) i avfallet.
- Ta bort vätskan från de runda-botten kolvarna med en rotationsindunstare (bad vattentemperatur: 60 ° C, vakuumtryck: 350 mbar).
- Tillsätt dietyleter (5 mL) i varje runda-botten kolv och överföra renat acetyleugenol (ekologisk lösning A) och eugenol (organisk lösning B) in en omärkt, preweighed injektionsflaskan med hjälp av en tratt.
- Skölj kolven med ytterligare dietyleter (5 mL) i injektionsflaskan. Avdunsta lösningsmedlet med en rotationsindunstare (vatten bad temperatur: 50 ° C, vakuum 800 mbar) med en injektionsflaska bifogad fil. Spela in avkastningen och märk flaskan på lämpligt sätt.
- Analysera organisk lösning A, ekologisk lösning B, ren eugenol TLC referens och acetyleugenol TLC referens av TLC optimerad TLC lösningsmedel förhållandet identifierade i föregående session.
Obs: Vattenlösningar kan hällas ut i avloppet för bortskaffande. Hexan och eter avfall ska bortskaffas i icke-klorerade organiska avfall flaskorna.
2. PHWE av Correa reflexa : isolering av seselin och (+)-epoxysuberosin
-
Session 1. PHWE av Correa reflexa
- Mala Correa reflexa blad (10 g) i en elektrisk spice grinder och sedan överföra växtmaterialet som marken till en 250 mL-bägare.
Obs: Slipning bör ta 20-30 sekunder. - Lägg till ~ 2 g av grov sand i den bägare som innehåller växtmaterial.
- Blandning och förpackning i korgen med portafiltret (prov fack). Komprimera provet med Sabotageskydd.
Obs: Inte packa provet för hårt. - Tillsätt ~ 300 mL 35% etanol/H2O lösning till espresso maskin tank.
- Placera portafiltret in espressomaskinen och placera en ren 250 mL-bägare därunder.
- Samla in ~ 100 mL extrakt, vänta ~ 1 minut och sedan samla ytterligare 100 mL.
FÖRSIKTIGHET: Maskinen och extrakt är het på denna punkt. - Cool denna blandning i isbad och avdunsta etanol med en rotationsindunstare (vatten bad temperatur: ~ 40 ° C).
- Överföra vattenextrakt till en separatory tratt och extrahera med etylacetat (4 x 50 mL).
Obs: Tid kan behövas för att tillåta emulsioner att skilja mellan extraktioner. - Kombinera de ekologiska extrakt, torka genom att lägga till MgSO4 och virvlande kolven, filtrera med hjälp av en sintrad glastratt, och avdunsta med en rotationsindunstare (vatten bad temperatur: ~ 35 ° C) att tillhandahålla den råa extraktet.
- Få ett 1H kärnmagnetisk resonans (NMR) spektrum (se instruktören för hjälp). 11
- Utföra TLC analys av det rå extraktet för att bestämma ett lämpligt lösningsmedel system att isolera de föreningar som har utvunnits.
Obs: TLC analys utförs av analogi till anvisningarna i steg 1.2.
- Mala Correa reflexa blad (10 g) i en elektrisk spice grinder och sedan överföra växtmaterialet som marken till en 250 mL-bägare.
-
Session 2. Separation av seselin och (+)-epoxysuberosin av flash kolumn kromatografi11,19
Obs: Följande protokoll innebär användning av flash kolonnkromatografi för separation av organiska föreningar. Kontakta en instruktör för att demonstrera hur man packar en flash kiselgel kolumn.- Plats kolumnen (~ 30 mm i diameter) i en klämma monteras retorten ställning. Placera en 100-mL konisk kolv under kolumnen.
- Fyll kolonnen med kiselgel (60 μm flash grad) till en nivå av ~ 10 cm och sedan lägga till hexanes (~ 100 mL) i kolumnen.
- Placera en propp av glas i kolumnen, ta bort kolumnen från klämman och skaka för att få en slurry. Placera kolumnen i klämman och låt blandningen sedimentera.
- Öppna kranen i kolumnen och använder en gas-adapter ansluten till en tryckluftsledning, Tom kolumnen för att lämna ~ 2 mm vätska ovan sängen av kiselgel. Ta bort gas adaptern sedan Stäng kranen.
- Använda de hexanes som samlas i den koniska kolven (~ 5 mL) för att skölja ner eventuella kiselgel från väggarna i kolumnen med en Pasteur-pipett försedd med en gummi septum.
- Upprepa steg 2.2.4 sedan lägga till en liten lager av sand (~ 1 cm) i kolumnen.
- Lägg till diklormetan (~ 1mL) till kolven som innehåller rå extrakt från steg 2.1.9. Noggrant läsa den efterföljande lösningen på den kolumnen med Pasteur pipett försedd med en gummi septum. Öppna kranen i kolumnen och låta provet adsorberas på kiselgel.
- Upprepa steg 2.2.7 ytterligare två gånger.
- Tillsätt försiktigt hexanes (~ 20 mL) till kolumnen. Upprepa steg 2.2.4.
- Tillsätt försiktigt (~ 180 mL av en lösning med 15% i etylacetat/hexanes). Öppna kranen kolumnen och med hjälp av en gas-adapter kopplad till en tryckluftsledning, tomma kolumnen för att lämna ~ 2 mm vätska ovan sängen av kiselgel, uppsamling fraktioner i 10 mL provrör.
Obs: Detta gör att seselin ska isoleras. - Kombinera provrör fraktioner som innehåller seselin i en 250 mL rund botten kolv och Indunsta med en rotationsindunstare (vatten bad temperatur: ~ 35 ° C).
Obs: TLC analys används för att avgöra detta och utförs av analogi till anvisningarna i steg 1.2. - Tillsätt försiktigt (~ 75 mL av en lösning med 25% i etylacetat/hexanes). Öppna kranen kolumnen och med hjälp av en gas-adapter kopplad till en tryckluftsledning, tomma kolumnen för att lämna ~ 2 mm vätska ovan sängen av kiselgel, uppsamling fraktioner i 10 mL provrör.
Obs: Detta gör att (+)-epoxysuberosin ska isoleras. - Kombinera provrör fraktioner innehållande (+)-epoxysuberosin i en 250 mL runda botten kolv och Indunsta med en rotationsindunstare (vatten bad temperatur: ~ 35 ° C).
Obs: TLC analys används för att avgöra detta och utförs av analogi till anvisningarna i steg 1.2. - Prover av de isolera föreningarna analyseras med hjälp av NMR spektroskopi. 11
Obs: NMR spektroskopi experiment utförs av en laboratorietekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PHWE av kryddnejlika. När du försöker utföra steget vätska-vätska utvinning, stött studenter ofta emulsioner (tillägg av saltlake vanligtvis inte var effektivt). I detta skede instruerades studenter att Låt blandningen stå i separertratten medan de utforskade effekterna av eluenten sammansättning på separation av eugenol och acetyleugenol av TLC. Det bör noteras att hexan kan ersättas med antingen heptan eller diklormetan i vätska-vätska utvinning steg. 9 studenter tilldelades förhållandet TLC lösningsmedel aceton och cyklohexan och tillhandahålls med ren standarder av eugenol och acetyleugenol och sedan utförs TLC analys (figur 3). Deras resultat var i tabellform på en whiteboard, och effekterna av lösningsmedel sammansättning på bibehållande faktorn (Rf) och optimal eluenten ansågs i en Gruppdiskussion (tabell 1). Optimal lösningsmedel sammansättningen identifieras av studenter vanligtvis varierade från 5-20% aceton/cyklohexan med en ΔRf mellan 0,1-0,2.
Efter TLC eluenten optimering, studenter återvände till sin eugenol extraktioner. Den rå nejlika extrakt (bestående främst av eugenol och acetyleugenol) isolerades i 4-9 viktprocent. I den andra sessionen av detta experiment utnyttjade studenter olika syra-bas egenskaper de två stora organiska molekylerna att separera dem med vätska-vätska utvinning. Typiskt, eugenol var isolerad i en avkastning av 45-65 viktprocent av den råa extraktet medan acetyleugenol var isolerad i en direktavkastning på 5-10 viktprocent av den råa extraktet. Eleverna sedan utnyttjas optimerad eluenten (identifieras enligt ovan) att avgöra framgången för deras vätska-vätska utvinning genom jämförelse av deras utdrag till de rena referensprover av TLC (figur 3). Studenter analyseras också deras rå nejlika extrakt och deras renat eugenol och acetyleugenol prover av utför Fourier-transform infraröd (FTIR) spektroskopi. 9 lösningsmedel eller vatten toppar ibland hos IR spectra på grund av dåligt utförda arbete upp förfaranden (eller dålig provpreparering).
Avancerade studenter begås cirka hälften av deras isolerade råolja till vätska-vätska utvinning ovan och underkastas flash kolonnkromatografi (mer information ges i den stödjande informationen) den andra delen. Trots att fylla vätska-vätska utvinning och flash kolumn kromatografi steg under en fyra timmars session kan tyckas ganska ambitiösa var detta möjligt för de flesta av de avancerade studenter som genomför detta experiment. Fullständig separation av eugenol från acetyleugenol av flash kolonnkromatografi uppnåddes sällan på grund av deras nära kvarhållande faktorer (figur 4). Eleverna kunde dock generellt att samla några fraktioner som innehåller ren eugenol. Avancerade studenter ombads sedan att kommentera de två olika rening teknikerna som en del av deras rapport.
PHWE av Correa reflexa. Eleverna utfört PHWE av Correa reflexa med minimal hjälp av laboratoriet instruktör. Under vätska-vätska utvinning steg varit emulsioner bildas vanligtvis studenter ofta och låt blandningen stå i separatory tratten (~0.25 h) med periodiska agitation av blandningen med en glasstav. Kromatografisk rening av den råa extraktet slutfördes bekvämt inom fyra timmars laborationens av studenter. Seselin och (+)-epoxysuberosin isolerades i avkastning upp till 1,1% w/w och 0,9% w/w, respektive och isolerade prover av båda föreningarna analyserades av 1H och 13C NMR och FTIR spektroskopi (figur 2). Medan studenter åtog sig den FTIR spektroskopi experiment och beredda proverna för NMR spektroskopi, utförs laboratorieassistenter NMR spektroskopi experiment. De resultat som erhållits av studenter överensstämde med tidigare publicerade arbete. 11
Trots detta inte har presenterats i betänkandet, i praktiken dragen detta experiment också en andra del som utmanar eleverna att utföra extraktionen en växtart som inte studerats anställa PHWE (mer information ges i stöd information).
Figur 1. PHWE av kryddnejlika. 9 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. PHWE av Correa reflexa. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . En representativa TLC-platta som utarbetats av en student. (10% aceton / cyklohexan eluering). Lane 1 E: eugenol standard; Lane 2 (rå): råolja nejlika extrakt; Lane 3 A: acetyleugenol standard). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| aceton / cyklohexan (%v/v) | menar acetyl-eugenol Rf | acetyl-eugenol Rf (σ) | menar eugenol Rf | eugenol Rf (σ) | menar ΔRf | antal TLC analyser |
| 0 | 0,06 | 0,08 | 0,04 | 0,06 | 0,02 | 12 |
| 5 | 0,34 | 0,11 | 0,27 | 0,09 | 0,07 | 15 |
| 10 | 0,45 | 0,07 | 0,34 | 0,05 | 0,12 | 20 |
| 20 | 0,51 | 0,07 | 0,41 | 0,06 | 0,10 | 20 |
| 30 | 0,58 | 0,10 | 0,49 | 0,12 | 0,10 | 19 |
| 40 | 0,63 | 0,08 | 0,56 | 0,08 | 0,07 | 16 |
| 50 | 0,76 | 0,08 | 0,73 | 0,08 | 0,03 | 17 |
| 60 | 0,77 | 0,13 | 0,73 | 0,15 | 0,04 | 12 |
| 70 | 0.84 | 0,13 | 0,81 | 0,13 | 0,03 | 11 |
| 80 | 0,90 | 0,06 | 0,87 | 0,08 | 0,02 | 10 |
| 90 | 0,88 | 0,06 | 0,87 | 0,05 | 0,01 | 11 |
| 100 | 0,87 | 0,13 | 0,86 | 0,14 | 0,02 | 6 |
Tabell 1. Tabell över kvarhållande faktorer beskriver effekten av eluenten sammansättning på Rf.
Figur 4 . Representativa TLC plattor utarbetats av studenter. Vänster: En TLC-plattan har analysera resultatet av det vätska-vätska utvinning steget (10% aceton / cyklohexan eluering). Lane 1 E: eugenol referensstandard; Lane 2 (JPB): eugenol som innehåller organiska extrakt; Lane 3 A: acetyleugenol referensstandard; Lane 4 (LEN): acetyleugenol-innehållande organiska extrakt. Höger: En TLC-plattan har analysera resultatet av flash kolumn kromatografi steg (10% aceton / cyklohexan eluering). Nummer på TLC plattan avser antalet provrör bråkdel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det klassiska förfarandet för att isolera eugenol från kryddnejlika ångdestillation har varit en del av det mellanliggande kemi laboratorie programmet vid University of Sydney i decennier men moderniserades för att anställa PHWE metodik under 2016 (figur 1). 9 , 18 detta gett ett antal förmåner. För det första, utnyttja hushållens espressomaskiner i laboratoriemiljö omedelbart fascinerad och engagerade studenter genom att illustrera tillämpningen av en icke-klassisk, alternativa metod att genomföra en traditionell vetenskaplig studie. Dessutom, denna nya metod minskar den tid det tar att slutföra utvinning och aktiverat införlivandet av ytterligare övningar i denna nya iteration av experimentet. Specifikt, tillät detta tunnskiktskromatografi (TK) att införas (och flash kolonnkromatografi för avancerade studenter).
Experimentet med fokus på PHWE av kryddnejlika utformades som ett inledande laboratorium upplever för andra året grundutbildningsprogram kemi studenter och av denna anledning det funktioner populärvetenskapliga undervisningsmetoder. 9 denna mer normativ, recept-stil förfarande tillåter studenter med något begränsad erfarenhet i organisk kemi att effektivt slutföra utvinning av eugenol från kryddnejlika. I detta experiment, är begrepp som syra-bas utvinning av sura föreningar, utnyttja TLC för att identifiera lämpliga eluenten sammansättning för kromatografi och användningen av en rotationsindunstare infört eller förstärkas genom en kombination av on-line pre lab video utbildning och i-person demonstrationer. I kompletterande komponenter som genomförs under två tilldelade sessioner, studenter i avancerade strömmen av förmedlande kemi också åtskilda eugenol och acetyleugenol genom kolonnkromatografi och bestämmas identiteten för de extraherade komponenterna använda TLC. I den andra sessionen, kunde eleverna kritiskt jämföra de två separationsmetoder. Eleverna var i allmänhet kunna slutföra det övergripande experimentet inom de tilldelade två fyra timmars perioderna med minimal instruktion.
Experimentet med fokus på PHWE och isolering av seselin och (+)-epoxysuberosin från Correa reflexa utvecklades för mer erfarna studenter tredje år grundutbildningsprogram kemi studenter. Noterbart var här inlärningsövning ett resultat av en studie med ursprung i forskningslaboratorium. 11 den första iterationen av experimentet införlivades det tredje år grundutbildningsprogram kemi laboratorie programmet vid University of Tasmania under 2015. Efter två år av revideringar och ny utvärdering utfördes detta experiment av en tredje året grundutbildningsprogram klass för tredje gången 2017.
Detta experiment utformades som en guidad-undersökande verksamhet som strävar efter att simulera några av de metoder som används i forskningslaboratorier för naturliga produkter och funktioner minimal skriftliga instruktioner. Detta är en student-regisserad inlärning och laboratorium instruktören spelar en viktig roll i att hjälpa elever som de arbetar genom experimentet genom att ge riktning som krävs. I detta experiment, studenter utveckla viktiga laboratorium färdigheter i kromatografi och anställa NMR spektroskopi att utföra struktur klargörande. Detta laboratorium erfarenhet förstärker begreppet Bioprospektering som presenteras för eleverna i klassrummet och detta kan utökas till studier på tidigare outforskat växtmaterial att ge en mer representativ upplevelse av naturliga produkter Bioprospektering. C. reflexa är en endemisk australiska växtarter, dock detta prov kan ersätta lämpliga blad material från andra markbundna växtarter i detta experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner skola av naturvetenskap - kemi, University of Tasmania och skolan för kemi, The University of Sydney för ekonomiskt stöd. B.J.D. och J.J. tackar den australiska regeringen för forskarstipendier Utbildning Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| espresso machines | Breville/Sunbeam | Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II | |
| rotary evporators | Buchi and Heidolph | ||
| cloves (plant material) | Dijon Food Pty Ltd | Cloves must be ground in a food processor for students. | |
| Correa reflexa (plant material) | sample obtained in Tasmania | Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania | |
| sand | Ajax | 1199 | |
| ethanol | Redoc Chemicals | E95 F3 | |
| hexanes | Ajax | 251 | |
| magnesium sulfate | Ajax | 1548 | |
| diethyl ether | Merck | 1009215000 | |
| silica on aluminium TLC plates | Merck | 1055540001 | |
| eugenol | Merck | 1069620100 | |
| eugenyl acetate | Aldrich | W246905 | |
| acetone | Redox Chemicals | Aceton13 | |
| cyclohexane | ChemSupply | CA019 | |
| silica gel 60 | Trajan | 5134312 | 40 - 63um (230-400mesh) |
| Congo red paper | ChemSupply | IS070-100S | |
| 32% hydrochloric acid | Ajax | 256 |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
- Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
- DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
- Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
- Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
- Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
- Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
- Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
- Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
- Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
- Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
- Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
- Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
- Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
- Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
- Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
- Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
- Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. , 2923-2925 (1978).
