Artigo de método

Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas

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DOI:

10.3791/58216

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6 de setembro de 2018

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1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um método para engenheiro um retina tecido composto de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em cima de membrana amniótica humana e sua preparação para enxertia em modelos animais.

Resumo

Diversas condições patológicas do olho afetam a funcionalidade e/ou a sobrevivência do epithelium retinal do pigment (RPE). Estes incluem algumas formas de retinite pigmentosa (RP) e degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Terapia celular é uma das estratégias mais promissoras terapêuticas propostas para curar estas doenças, com já incentivando os resultados preliminares em seres humanos. No entanto, o método de preparação do enxerto tem um impacto significativo em seus resultados funcionais em vivo. Com efeito, as células RPE enxertadas como uma suspensão de células são menos funcionais do que as mesmas células transplantadas como um tecido da retina. Aqui, descrevemos um método simples e reprodutível para engenheiro RPE tecido e sua preparação para a implantação na vivo . As células RPE derivadas de células-tronco pluripotentes humanas são semeadas sobre um suporte biológico, a membrana amniótica humana (presunto). Comparado aos andaimes artificiais, este apoio tem a vantagem de ter uma membrana basal que é perto da membrana de Bruch, onde as células RPE endógenas estão conectadas. No entanto, sua manipulação não é fácil, e desenvolvemos várias estratégias para seu cultivo adequado e preparação para enxertia em vivo.

Introdução

RPE é crucial para a sobrevivência e a homeostase dos FOTORRECEPTORES com o qual é fortemente associado1. Diversas condições patológicas alteram a sua funcionalidade e/ou sobrevivência, incluindo RP e AMD.

RP é um grupo de mutações herdadas de monogénicas que afetam as funções de fotorreceptores, células RPE ou ambos os2,3. Estima-se que as mutações que afetam especificamente o RPE células conta para 5% da RP2. AMD é outra condição onde a camada RPE é alterada, perda de visão, em última análise, a central principal. AMD é causada pelas complexas interações de fatores genéticos e ambientais e afeta os idosos4,5,6. De acordo com projeções, a AMD vai ser uma preocupação para os pacientes 196 milhões em todo o mundo por 20207. Para estes distúrbios, não existe nenhuma cura eficaz e uma das estratégias propostas é o transplante de células RPE novos para compensar mortos/não-funcionais preexistente RPE células8.

O modo de formulação do produto final a ser enxertado é essencial para garantir os melhores resultados funcionais. As células RPE injetadas como uma suspensão de células, apesar de ser um método fácil e simples de entrega, aumentar as preocupações em relação a sua sobrevivência, integração e funcionalidade9,10,11,12 , 13. cientistas desenvolvem-se mais complexas formulações para entregar engenharia tecido retinal9,13,14,15,16. Neste contexto, desenvolvemos um método original para gerar em vitro tecido RPE que poderia ser usado para transplante9.

Os bancos de células RPE derivados de células-tronco embrionárias humanas (ES) são usados no presente protocolo. No entanto, a alternativa RPE celular bancos de fontes diferentes células (células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, as células RPE primárias, etc.) e diferenciados com um método diferente também são adequados para este protocolo. Diferenciação dirigida inclui protocolos usando citocinas e/ou pequenas moléculas17,18,19,20,21,22.

Para ser transplantado, o tecido projetado deve ser preparado em um andaime. Nos últimos anos, andaimes diferentes foram desenvolvidos com base em um polímero ou em uma matriz de origem biológica13,23,24. Aqui, o substrato biológico utilizado é o presunto, mas outros substratos, como membranas de Bruch desnudas, poderiam ser implementados. O método aqui descrito tem a vantagem de usar um andaime biológico que é mais relevante para o ambiente nativo de RPE.

ES derivado de células RPE as células humanas são cultivadas pelo menos 4 semanas para ser totalmente organizado como uma monocamada de paralelepípedos. Nessa fase, o epitélio obtido é funcional e polarizada9. Finalmente, como este tecido enruga facilmente, ele é incorporado em uma camada fina de uma operadora de hidrogel para dar mais rigidez e elasticidade e para protegê-lo durante o procedimento de injeção. Este produto é então armazenado em 4 ° C até enxertia.

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Protocolo

Todos os materiais humanos utilizados neste protocolo foram utilizados em conformidade com os regulamentos da União Europeia. A linha de celular humana ES utilizada neste estudo foi derivada de um único embrião. O casal que tinha doado o embrião estava plenamente informado e deu seu consentimento para uma doação anônima. Uma linha celular do ES humana grau clínico foi derivada este embrião, bancada, qualificada e devidamente documentada por Roslin células (Reino Unido). Presuntos foram adquiridos em condições estéreis durante uma cesariana em mães que assinaram um consentimento para a doação de placenta de acordo com diretrizes do hospital (PHP, Hôpital Saint Louis).

1. preparação de reagentes e meios de cultura

  1. Preparação do meio de cultura de células RPE
    1. Para preparar o meio de cultura de células RPE, adicionar substituto 4% de soro (20 mL para um volume final de 500 mL), 1.000 x diluído 2-mercaptoetanol (500 µ l para um volume final de 500 mL) e solução de não aminoácidos essenciais em meio essencial mínimo (MEM) 1% Eagle′s (5 mL para um final volume de 500 mL) com glicose alta do médio (DMEM) da águia modificados de Dulbecco (475 mL para um volume final de 500 mL).
  2. Preparação do meio de transporte/conservação
    1. Para preparar o meio de transporte/conservação, adicione 1% de penicilina-estreptomicina (5 mL para um volume final de 500 mL) para CO2-médio independente (495 mL para um volume final de 500 mL) e mantê-lo em 4 ° C.
  3. Ressuspensão da enzima thermolysin
    1. Preparação de uma solução stock de thermolysin
      1. Para preparar uma solução stock de thermolysin, descongele o pó de thermolysin, que foi armazenado a-20 ° C, à temperatura ambiente.
      2. Como a atividade enzimática pode ser variável de lote para lote, calcule essa atividade com base no certificado de análise fornecida com o pó de thermolysin do lote a ser usado. Dividir a "atividade Protease neutro calculado = ANPC" (indicado no certificado de análise) por 181 (que é o peso molecular da tirosina). O resultado obtido corresponde a atividade enzimática total do thermolysin fornecido em pó (U/frasco).
      3. Prepare uma solução stock de 200 U/mL, adicionando o volume de água correspondente à atividade enzimática total (U/frasco) dividido por 200 (U/mL).
      4. Dissolva a enzima pipetando água que foi adicionada para cima e para baixo. Vórtice da solução por 30 s e verificar se o pó completamente foi suspenso. Pipetagem mais pode ser exigido para uma dissolução completa.
      5. Alíquota da solução estoque e armazená-lo a-20 ° C.
    2. Preparação de uma solução de trabalho de thermolysin
      Nota: A solução de thermolysin deve ser preparada no dia do tratamento presunto.
      1. Descongelar as alíquotas estoque de thermolysin a 200 U/mL armazenado a-20 ° C. Dilua a solução-mãe de 200x em tampão fosfato salino (PBS) a fim de obter uma final atividade enzimática de 1 U/mL. Prepare-se 40 mL para tratar manchas de presunto 1 – 4.
      2. Filtre a solução de thermolysin através de um antes do filtro de 0,2 µm de usar.
  4. Ressuspensão de gelatina
    1. Preparação da solução de gelatina de 20% e bloco
      Nota: A solução de gelatina de 20% e o bloco podem ser preparados até 1 semana antes da utilização.
      1. Aquecer o CO2-médio independente a 42 ° C em banho-maria por 30 min (até 1 h). Em um tubo de 50 mL, adicionar 10 g de gelatina para 40 mL de aquecido CO2-médio independente e vortex a solução.
      2. Dissolver a gelatina por 30 a 60 min a 42 ° C. Vórtice cada 10min para homogeneizar a solução.
      3. Uma vez que a solução é homogênea, adicione 4 mL de solução a 20% de gelatina para quatro pratos de cultura de 6 cm. Evite bolhas. Adicionar um filme plástico de parafina para proteger os pratos e permitir que a solução solidificar a 4 ° C.
    2. Preparação da solução de gelatina de 8%
      Nota: A solução de gelatina de 8% pode ser preparada no dia antes do uso e armazenada a 4 ° C.
      1. Aquecer o CO2-médio independente a 42 ° C por 30 min (até 1 h). Em um tubo de 50 mL, adicionar 4 g de gelatina para 46 mL de aquecido CO2-médio independente e vortex a solução.
      2. Dissolver a gelatina por 30 a 60 min a 42 ° C. Adicionar um filme plástico de parafina para proteger o tubo e mantê-lo em banho-maria a 37 ° C, se é para ser usado no mesmo dia, ou armazená-lo em 4 ° C, se é para ser usado mais tarde.

2. Thermolysin tratamento de membrana amniótica humana

  1. Lavagem de membrana amniótica
    1. Tenho presuntos fornecidos como pedaços pequenos (aproximadamente 30 x 30 mm) fixo em um andaime de nylon, ou já a 4 ° C, em PBS ou congelados. Se fornecido congelado, descongelar as membranas a 37 ° C numa incubadora por 30 min.
    2. Lave as membranas:
      1. Coloque 1 – 4 membranas em uma garrafa de 250 mL contendo 80 mL de PBS. Use tantas garrafas conforme necessário.
      2. Agite cada garrafa em um agitador de placa em alta velocidade por 5 min, em seguida, descartar a PBS. Adicione 80 mL de PBS e repetição.
  2. Tratamento Thermolysin
    1. Adicionar 40 mL da solução de trabalho de thermolysin (1 U/mL) por garrafa que contém as membranas (1 – 4 membranas por garrafas; até 3 garrafas de cada vez).
    2. Agitar os frascos durante 5 min à 450 rpm e, em seguida, vórtice por 30 s. Repita 1 x.
    3. Descartar a solução de thermolysin e adicionar 80 mL de PBS.
    4. Agite os frascos por 5 min a 450 rpm. Descartar a PBS e adicionar 80 mL de PBS. Repita 3x.

3. fixação de membrana amniótica humana por uma inserção de cultura

  1. Use pinça longa estéril (que pode atingir o fundo da garrafa) para remover os presuntos, um por um e transferir cada presunto para um prato de cultura 10 cm contendo 10 mL de PBS.
  2. Uma placa de cultura nova 10 cm contendo 10 mL de PBS, lugar de membranas com o nylon voltado para baixo. Separe dois dos quatro clips que são usados para fixar a membrana de nylon.
  3. Introduza o anel menor da inserção da cultura entre o nylon e a membrana.
  4. Certifique-se que a membrana cobre completamente o anel menor. Clip-a segunda parte da inserção da cultura em cima da membrana. A membrana basal do presunto é enfrentar a inserção da cultura interna. Separe os dois últimos clipes.
  5. Corte, com tesoura estéril, o excesso de membrana exterior a inserção de cultura, se necessário. Usando fórceps, transferir a membrana fixa na inserção da cultura para uma placa de 12, adicionar PBS e armazenar a placa em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
  6. Repita estas operações (da etapa 3.2 a 3.5) com as outras membranas.

4. descongelar e propagação das células do epitélio Retinal do pigmento na membrana amniótica humana

  1. Descongelamento das células do epitélio retinal do pigmento
    1. O banco de células RPE é congelado a 1 milhão de células por frasco criogênico em nitrogênio líquido. Descongelar como muitos frascos criogênicos como necessário (350.000 células são semeadas por membrana).
    2. Prepare um tubo de 15 mL contendo 3 mL do meio RPE por frasco criogênico. Uma vez que o frasco é descongelado, transferi as células para cada tubo. Repita esta operação para os outros frascos.
    3. Homogeneizar (pipeta para cima e para baixo algumas vezes para Ressuspender as células em meio de RPE) e levar 10 µ l da solução celular e transferi-lo para um tubo de 1,5 mL. Adicione 10 µ l de trypan azul. Lugar de 15 µ l desta solução em uma câmara de contagem, então contar o número de células viáveis (não coloridos em azul) sob um microscópio com um objetivo X 4. Repita esta operação para os outros frascos.
    4. Entretanto, centrifugar os tubos de 15 mL em 110 x g durante 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 700.000 células/mL.
  2. Semeadura de células do epitélio retinal do pigmento em membrana amniótica humana
    1. Remova a placa de 12 poços contendo as membranas da incubadora.
    2. Aspire a PBS. Adicione 500 µ l de suspensão de célula preparada na etapa 4.1.4 no centro da inserção da cultura. Adicione 1 mL de meio RPE fora a inserção de cultura (no interior do poço). Repita para as outras membranas.
    3. Coloque a placa de 12 poços contendo as membranas na incubadora.

5. manutenção de culturas de células de epitélio Retinal do pigmento na membrana amniótica humana

  1. Renovar o meio 2 x por semana, geralmente às segundas e sextas, até pelo menos dia 30 da cultura.
  2. Aspire o meio dentro e fora da inserção da cultura de cada poço e renová-lo com meio fresco (1ml fora a inserção da cultura e 500 µ l de dentro). Coloque a placa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.

6. preparação do Patch do epitélio Retinal do pigmento para transplante

Nota: A partir de dia 30, da cultura, o tecido está pronto para transplante.

  1. Quente a solução de 8% de gelatina em banho-maria a 37 ° C por 30 min. Encha a câmara interna da vibratome com frio CO2-médio independente (a 4 ° C).
  2. Coloque o bloco de 20% de gelatina para o vibratome.
    1. Leve o prato de cultura de 6cm que contém o bloco de 20% de gelatina na geladeira. Usando um bisturi, corte um bloco de 5 cm x 5 cm. Cole a parte superior do bloco para o apoio com cola de cianoacrilato ou seu equivalente.
    2. Coloque uma lâmina nova no vibratome.
    3. Ajuste o nível do bloco até que esteja no mesmo nível da lâmina de barbear.
    4. Encher a banheira em torno do apoio com frescos de CO2-médio independente a 4 ° C. Corte o bloco com a vibratome usando uma velocidade média até que o bloco é cortado uniformemente, levando a uma superfície lisa. Defina a posição 0.
    5. Aspire o meio em torno do bloco de gelatina até que esteja completamente seco e depois levar o prato de 12-poços de cultura contendo os tecidos da incubadora a 37 ° C.
    6. Usando a pinça, abra cuidadosamente a inserção da cultura em cima do bloco de gelatina. Corte, com a tesoura, todas as partes das membranas que não contêm células (fora do ringue onde células não foram cultivadas). Aspire o inteiro médio residual.
    7. Adicione 1 mL da solução de 8% de gelatina líquida a 37 ° C, a fim de cobrir as membranas. Remova cuidadosamente o excesso. Espere 5 – 8 min para permitir que a gelatina solidificar.
    8. Adicionar novo CO2-médio independente (a 4 ° C) para o banho até que a membrana é coberta.
    9. Corte, com o vibratome em uma posição de-100 µm, com uma velocidade média, permanecendo ciente de como o bloco se comporta. No final da seção, tenha cuidado para manter a orientação do tecido.
    10. Com um bisturi, corte um canto para identificar a orientação da seção.
    11. Recolher a membrana incorporada em gelatina com uma espátula e coloque-o em uma placa de 6 preenchida com o meio de conservação a 4 ° C, até enxertia aos olhos do destinatário.
    12. Na época do transplante, ajuste o tamanho do implante para o tamanho do olho destinatário sob um microscópio cirúrgico (1-3 para ratos, 10 a 15 mm2 para primatas não-humanos).

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Resultados

Presuntos contêm uma camada epitelial que deve ser removida antes da semeadura de células RPE. Um tratamento enzimático da membrana é executado com o thermolysin sob agitação. Em ordem para não perder a polaridade da membrana (o epitélio é de um lado), é fixado num suporte de composição que pode ser diferente dependendo do provedor (figura 1A). Verificar a aderência da membrana de seu apoio a este passo e adicionar clips, se necessário. Aquando da fixação na ...

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Discussão

Nós descrevemos um método para a cultura de células RPE sobre um andaime biológico e sua preparação para implantação em modelos animais. Uma das etapas críticas do protocolo é a manutenção da orientação do presunto por todo o procedimento até sua inclusão em gelatina. Com efeito, é removido o epitélio nativo da membrana e sua membrana basal torna-se exposto9. As células RPE possuem ser semeado em cima desta membrana basal. Após a preparação para a incorporação de gelatina, é crucial trabalhar com ...

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Divulgações

Olivier Goureau é o inventor na pendente patentes relacionadas com a geração de células da retina a partir células-tronco pluripotentes humanas. Os outros autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer Jérôme Larghero e Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, França) para a sua entrada durante a instauração do método descrito aqui.

Este trabalho foi apoiado por concessões do ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], o Fondation pour la Recherche Médicale [programa de Bio-Engenharia - DBS20140930777] e do LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau e Christelle Monville. Era apoiado por NeurATRIS, uma infra-estrutura de pesquisa translacional (Investissements d'Avenir) para biotherapies em Neurociências [ANR-11-INBS-0011] e INGESTEM, a infra-estrutura nacional (Investissements d'Avenir) engenharia para pluripotentes e células-tronco diferenciadas [ANR-11-INBS-000] para Christelle Monville. Karim Ben M'Barek foi apoiado por bolsas de Stempole DIM e LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. -Tronco faz parte do Instituto de doenças raras, apoiada pela Association Française contre les miopatias (AFM) Biotherapies-Téléton.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Armário de biossegurança estérilTechGen InternationalNão aplicável
Sistema de eliminação de resíduos líquidos para aspiraçãoVacuubrandBVC 21
CO2-controlado +37  ° Incubadora de células CThermo Electron CorporationBVC 21 NT
200  µ L pipeta: P200GilsonF144565
1  mL pipeta: P1000GilsonF144566
Pipet aidDrummond75001
+4  ° C geladeiraLiebherrNão aplicável
VibratomoLeicaVT1000S
Tesoura finaWPI501758
Fórceps (x2)WPI555227F
Banho-mariaGrant subaqua proSUB6
Balança de precisãoSartoriusCP225D
CentrífugaEppendorff5804
MicroscópioOlympusSC30
Agitador Horizontal RockingIKA-WERKEIKA MTS 214D
VortexVWRLAB DANCER S40
Bisturi DescartávelWPI500351
filme plásticoparafina VWRPM992
0.200 µ m filtro de seringa descartávelSARTORIUS16532
Seringa sem agulha 50 mLDutscher50012
Frascos 250 mLDutscher28024
15 mL tubos Falcon estéreisDutscher352097
50 mL tubos Falcon estéreisDutscher352098
inserção de culturaScaffdexC00001N
60  mm distribuidores de cultura de células: B6Dutscher353004
placa de cultura de células de 12 poços Placasde3512
Lâminas deCorning3506
Ted Pella, Inc121-9
Cola de cianoacrilatoCastorama3178040670105
PBS 1x (500  mL)SigmaD8537
ThermolysineRoche5339880001
DMEM, glicose alta, GlutaMAXInvitrogen61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)Invitrogen12618-013
MEM-NEAA (100x)Invitrogen11140-035
b-mercaptoetanol (50  mM)Invitrogen31350-010
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen15140122
meio independente de CO2GIBCO18045-054
GelatinaMERCK104078
membrana amniótica humanaBanco de tecidos Hospital St Louis (Paris, França)Não aplicável
de cultura 6 poços Corning barbear

Referências

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