Artigo de método

Avaliação global da eficácia e segurança de entrega de droga Placenta-alvo usando três métodos complementares

DOI:

10.3791/58219

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10 de setembro de 2018

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1Laboratory for Reproductive Health, Institute of Biomedicine and Biotechnology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, 3Key Laboratory of Chemical Engineering Process and Technology for High-efficiency Conversion, College of Chemistry and Material Sciences, Heilongjiang University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um sistema que utiliza três métodos para avaliar a segurança e a eficácia da entrega da droga placenta-alvo: no vivo de imagem para monitorar o acúmulo de nanopartículas, ultra-som de alta frequência para monitorar o desenvolvimento placentário e fetal e HPLC para quantificar a entrega da droga ao tecido.

Resumo

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Não há tratamentos eficazes existem, atualmente, por complicações de gravidez associada a placenta, e desenvolver estratégias para a entrega de alvo de drogas para a placenta, minimizando efeitos colaterais fetais e maternos continua a ser um desafio. Transportadoras de nanopartículas alvo proporcionam novas oportunidades para tratar anormalidades da placenta. Recentemente demonstramos que um peptídeo sintético placentária sulfato de condroitina A ligação (plCSA-BP) poderia ser usado para guiar as nanopartículas para entregar drogas para a placenta. Neste protocolo, descrevemos detalhadamente um sistema para avaliar a eficiência da entrega da droga para a placenta pela plCSA-BP que emprega três métodos distintos, usados em combinação: na vivo de imagem, ultra-som de alta frequência (HFUS) e alto desempenho cromatografia líquida (HPLC). Usando na vivo da imagem latente, plCSA BP-guiada por nanopartículas foram visualizadas nas placentas de animais vivos, enquanto HFUS e HPLC demonstraram que nanopartículas plCSA-BP-conjugados com eficiência e especificamente entregues metotrexato da placenta. Assim, uma combinação desses métodos pode ser usada como uma ferramenta eficaz para a entrega de alvo de drogas para a placenta e desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para várias complicações na gravidez.

Introdução

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Complicações da gravidez placenta-mediada, incluindo pré-eclâmpsia, perda de gravidez, descolamento prematuro da placenta e pequena idade gestacional (SGA), são comuns e levam a substancial morbidade fetal e materna e mortalidade1,2, 3e muito poucas drogas têm provado ser eficaz para tratar a gravidez distúrbios4,5. O desenvolvimento de estratégias para a entrega da droga placenta-alvo mais seletivo e segura durante a gravidez permanece desafiador em terapia com drogas modernas.

Nos últimos anos, vários relatos têm focado a alvo entrega de drogas aos tecidos uteroplacentária por nanopartículas de revestimento com peptídeos ou anticorpos como ferramentas de placenta-alvo. Estes incluem um anticorpo de6 do fator de crescimento epidérmico anti receptor (EGFR), tumor-homing peptídeos (CGKRK e iRGD)7, peptídeos de placenta-alvo8, peptídeos placentários vasculatura-alvo9 e anticorpos contra a receptor de ocitocina10.

Aqui, demonstramos que um peptídeo sintético placentária sulfato de condroitina A ligação (plCSA-BP) pode ser usado para a entrega de alvo de nanopartículas e suas cargas de drogas para a placenta11. As nanopartículas plCSA-BP-guiadas são complementares a uteroplacentária relatada visando métodos porque alvo o trofoblasto da placenta.

Como um método não-invasivo, na vivo a imagem tem sido usada para monitorar a expressão gênica de placenta específicas em ratos12e indocianina verde (ICG) tem sido amplamente utilizada para rastrear nanopartículas usando fluorescência de imagem sistemas13, 14,15. Assim, por via intravenosa injetamos nanopartículas plCSA-BP-conjugados, carregadas com o ICG (plCSA-INPs) para visualizar a distribuição de plCSA-INP em ratos grávidas com um gerador de imagens de fluorescência. Nós, em seguida, por via intravenosa injetado metotrexato (MTX)-carregado plCSA-NPs em ratos grávidos. Ultra-som de alta frequência (HFUS), outro não-invasiva, em tempo real de imagens ferramenta16,17 foi usado para monitorar o desenvolvimento fetal e placentário nos ratos. Finalmente, usamos a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para quantificar a distribuição de MTX na placenta e fetos.

Neste protocolo, descrevemos em detalhe o sistema de três-método usado para avaliar a eficiência da entrega da droga placenta-alvo por nanocarriers plCSA-BP-guiada.

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Protocolo

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Todos os experimentos de rato rigorosamente os protocolos (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232), aprovados pelo cuidado Animal e uso Comissão de Shenzhen institutos de tecnologia avançada, da Academia Chinesa de Ciências.

1. síntese de nanopartículas de lipídios-polímero direcionados A placentária sulfato de condroitina

  1. Sintetizar a nanopartículas de lipídios-polímero MTX e ICG-carregado (MNPs e INPs respectivamente) e plCSA-BP-conjugados de nanopartículas (plCSA-MNPs e plCSA-INPs) conforme descrito em detalham em outro lugar18.

2. in vivo da fluorescência Imaging

  1. Preparação de ratos grávidas
    1. Coloque a fêmeas ratos CD-1 (8-12 semanas) com um macho fértil da mesma estirpe em uma gaiola (masculino: feminino = 1:2) na tarde e verifique o vaginal conecta o seguinte manhã. Se for observado um plug vaginal, defina o mouse como embrionário dia 0,5 (E0.5).
    2. Ciclo de ratos grávidas casa sozinhos em um quarto livre de patógeno animal com luz/10 h 14 h escuro e fornecem o acesso livre à comida e água até E14.5.
  2. Injeção intravenosa de nanopartículas
    1. Antes do procedimento, esterilize as nanopartículas por filtração através de um filtro de seringa 0,22 μm. Pese o mouse grávido no E11.5 para determinar a quantidade e volume de injeção de nanopartículas.
      Nota: O volume de injeção de nanopartículas deve ser inferior a 1% (volume/peso) do peso do corpo do mouse grávido. Por exemplo, o volume de injeção de nanopartículas deve ser menos de 0,25 mL em um rato de 25 g.
    2. Para dilatar a veia da cauda, aquecer a cauda por 5-10 min com uma almofada de aquecimento.
    3. Antes da injeção, Aspire o INPs ou plCSA-INPs em uma seringa de insulina de 28 g.
    4. Transferi o mouse grávido para um dispositivo de exploração que restringe o mouse ao permitir o acesso para a veia da cauda. Limpe o rabo com um algodão embebido em álcool. Em seguida, insira a seringa na veia da cauda. Lentamente injete o INPs ou plCSA-INPs (equivalente a 5 mg/kg ICG) com pressão durante 5 a 10 s.
      Nota: Pare de injetar se uma bolha aparece na cauda, porque este resultado indica que a agulha não está na veia. As seringas não devem ser compartilhadas entre ratos para minimizar a transmissão da doença e a contaminação cruzada.
    5. Registrar o tempo de injeção. Enquanto isso, exerça uma ligeira pressão para o local da injeção até o sangramento parar, que normalmente demora 30-60 s.
  3. Imagem latente na vivo
    1. 30 min após a injeção, os ratos grávidas usando a fluorescência na vivo , sistema de imagem da imagem.
    2. Anestesiar os ratos grávidas com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min e isoflurano em 2-4% em uma câmara de associado da unidade de anestesia e verificar completa anestesia pelo lento e respiração regular. Em seguida, movê-los para a câmara de imagem. Coloque os ratos anestesiados grávidos dentro da câmara de imagem, mantendo os animais em posição supina.
    3. Coloque um cone de nariz sobre a boca e o nariz para permitir que a inalação de 1-2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min para manter a anestesia.
    4. Selecione parâmetros 2D-fluorescência e fotográficos para os sinais de fluorescência ICG da imagem. Definir a exposição a auto e os comprimentos de onda de excitação/emissão de 710/820 nm.
    5. No final do processo de imagem, desligue o influxo de isoflurano para parar a anestesia e voltar os ratos grávidas cuidadosamente suas gaiolas.
    6. 48 h após a injeção de nanopartículas, anestesiar os ratos grávidos com isofluorano e então sacrificar a represa por deslocamento cervical. Recolha os fetos e placentas usando pinça Graefe, Graefe fórceps do tecido e tesouras de dissecação.
    7. Coloque as placentas e fetos na câmara de imagem e imagem usando o método descrito na etapa 2.3.4.

3. HFUS avaliação do desenvolvimento embrionário

  1. Modelos animais
    1. Obter e preparar os ratos grávidas, conforme descrito no passo 2.1.
    2. Use HFUS para ratos grávidas imagem no E 6.5 (protocolos 3.2 e 3.3.3). Primeiro, confirmar a gravidez através da visualização de embriões no dia E6.5 e em seguida, alocar aleatoriamente os ratos grávidas em três grupos: o grupo MNP, grupo plCSA-MNP e grupo fosfato-salino (PBS).
    3. Injete PBS, MNPs ou plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX equivalente) as veias de cauda dos ratos grávidas todos os dias, começando em E6.5, conforme descrito no passo 2.2.
  2. Preparação para a imagem latente
    1. 24 h após a injeção de nanopartículas, os ratos grávidas usando o HFUS sistema de imagem da imagem.
    2. Anestesia os ratos grávidas conforme descrito na etapa 2.3.2. Ativar os controles de temperatura integrado da plataforma de geração de imagens e pré-aqueça a plataforma-37-42 ° C. Fixe os ratos grávidas em posição supina na plataforma utilizando a fita.
    3. Lugar do cone de nariz ligado à unidade de anestesia sobre o focinho. Aplica 2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min para manter constante anestesia.
    4. Quimicamente, remova pelos do abdômen usando um creme depilatório. Acabar com o creme residual cuidadosamente com gaze embebida em água e depois revestir o abdômen com acústico acoplamento gel.
  3. Procedimento de imagem
    1. Coloque o transdutor de 40 MHz no braço mecânico.
    2. Ajuste a posição do transdutor para obter imagens longitudinais do feto e placenta com a região de interesse localizado na zona focal.
    3. Análise e imagem modo-B
      Nota: Ver filme 1.
      1. Clique no botão Modo-B e abaixe o transdutor sobre o abdômen até o feto e a placenta entram em vista. Pressione Scan/Freeze para iniciar/parar de imagem, pressione Cine armazenar para armazenar o laço da cinematografia e pressione Frame armazenar para armazenar imagens do quadro.
      2. Clique no botão de medida para analisar o comprimento do saco gestacional (GS), comprimento de garupa fetal coroa (CRL), diâmetro biparietal (DBP), circunferência abdominal (AC), diâmetro da placenta (PD) e espessura placentária (PT).
    4. Análise e imagens Doppler PW
      Nota: Ver filme 1.
      1. Usando o mesmo digitalizar projeção, clique no botão PW , coloque a caixa de volume de amostragem no centro da artéria umbilical e pressione Scan/Freeze para iniciar a geração de imagens. Clique em armazenar Cine para coletar imagens de artéria umbilical.
      2. Clique no botão de medida para calcular a velocidade de pico de artéria umbilical (UA).
    5. Análise e imagem latente de modo Doppler cor
      1. Usando a mesma projeção de digitalizar, clique no botão cor e ajustar a posição do transdutor para obter imagens do coração fetal. Pressione Scan/congelamento para iniciar a imagem latente e Cine armazenar para coletar imagens.
      2. Clique no botão de medida para calcular a frequência cardíaca fetal (HR).

4. HPLC análise

  1. Preparação do tecido
    1. Injetar os ratos grávidas com uma única dose de MNPs ou plCSA-MNPs (equivalente MTX de 1 mg/kg) no final da gravidez (ex., E14.5) conforme descrito na etapa 3.1.3.
    2. Após 24h, anestesia os ratos por uma injeção intraperitoneal de avertin em 240 μg/peso (g). Não certifique-se de nenhuma resposta para uma pitada de pé para verificar que os ratos são totalmente anestesiados.
    3. Pulverize a área do peito com 75% de etanol. Executar a perfusão cardíaca (cortar os átrios direito e perfundir através do ventrículo esquerdo) conforme descrito em detalhe19,20 com 50 mL de soro fisiológico 0,9% gelada por 10 min remover nanopartículas desacopladas.
    4. Eutanásia em barragem. Realizar uma cesariana para recolher os fetos e placentas usando pinça Graefe, dissecando a tesoura e pinça de tecido Graefe e armazenar os tecidos a-80 ° C, antes da análise.
    5. Preparar a solução de homogeneização (ácido perclórico a 10%) e manter-se no gelo. Coletar aproximadamente 200 mg de tecido e adicionar 500 μL de solução de homogeneização para cada amostra. Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador a toda a velocidade para 30 s e repita este procedimento duas vezes.
    6. Centrifugar as amostras a 14.000 × g por 20 min a 4 ° C. Filtrar o sobrenadante (aproximadamente 300 μL) através de um filtro de seringa 0,45 μm e transferir o líquido resultante para um frasco HPLC. Coloque os frascos de amostra em uma bandeja de mostruário para injeção.
  2. Elaboração de normas
    1. Prepare a seguinte solução para a fase móvel: 40mm potássio Fosfato dibásico (pH 4.5) e acetonitrila (88:12, v/v). Filtrar a solução através de um filtro de seringa de tamanho de poros de 0,45 μm e transferir o líquido resultante para uma garrafa de reservatório limpa HPLC.
      Nota: Ajuste o pH com ácido fosfórico a 0,1 M. Use vibração ultra-sônica por 15 min para desgaseificar a fase móvel cada vez antes de usar.
    2. Pese 10 mg de MTX em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 1 mL de hidróxido de sódio 1 M.
    3. Vórtice em alta velocidade até o MTX se dissolva completamente.
      Nota: Este é o estoque principal e pode ser armazenado a-20 º C durante vários meses.
    4. Para criar o estoque MTX secundário (500 μg/mL), dilua 50 μL do regulador primário em 950 μL da fase móvel.
      Nota: Guarde no gelo até o uso e preparar fresca diariamente. É importante usar a fase móvel para a elaboração de normas para evitar picos resultantes da mistura de diferentes soluções após a injeção da amostra.
    5. Fazer mais diluições para criar as normas (tabela 1). Armazenar as normas no gelo e preparar fresca diariamente. Execute as normas em série com as amostras experimentais.
NúmeroConcentração final (μg/mL)Padrão, μL 500 μg/mLPhase(μL) móvel
10,51999
212998
32.55995
41020980
52550950
650100900
7100200800

Tabela 1. Preparação da curva de calibração para MTX. A concentração final da solução padrão de MTX é de 0,5-100 μg/mL.

  1. Instrumentação de HPLC e parâmetros de operação
    Nota: As amostras foram analisadas em um sistema HPLC equipado com uma bomba de solvente, um detector espectrofotométrico UV (313 nm) e uma coluna C18 (250 × 4. 6mm, tamanho de partícula 5 μm).
    1. Ligue o desgaseificador HPLC para retirar o ar do sistema. Ative o fluxo, desenroscada a coluna com a fase móvel por 30 min reduzir o ruído da linha de base.
    2. Regule a temperatura da coluna, a 25 ° C, injetar 20 volumes de amostra μL em uma taxa de fluxo de 1 mL/min e clique no Método execute para iniciar a análise.
    3. Quando as pistas estiverem completas, altere manualmente a fase móvel para acetonitrila grau HPLC. Executado por aproximadamente 15 min proteger o sistema.
      Nota: Execute esta etapa após o tempo de execução recomendado pode resultar em danos à coluna.
    4. Para análise quantitativa, calcule as áreas sob os picos MTX padrão de interesse usando o software de sistema HPLC.

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Resultados

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Neste manuscrito, carregado com MTX (plCSA-MNPs) ou ICG (plCSA-INPs) plCSA-BP-conjugados de nanopartículas foram injetadas por via intravenosa ratos grávidas. Imagem latente na vivo revelou sinais ICG fortes na região do útero 30 min após a injeção de plCSA-INP. O INPs foram localizado principalmente na região do fígado e baço (figura 1A). A 48 h após a injeção de plCSA-INP, ratos grávidas foram sacrificados, revelando sinais ICG somente na placenta,...

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Discussão

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Neste manuscrito, descrevem um sistema de três-método para determinar se plCSA BP-guiada por nanopartículas são uma ferramenta eficiente para o direcionamento a entrega de drogas para a placenta. O uso do na vivo de imagem para monitorar o sinal infravermelho de ICG fluorescente confirmou a especificidade de direcionamento da placenta de plCSA-BP usando HFUS e HPLC, demonstrámos que nanopartículas plCSA-BP-conjugados com eficiência podem entregar MTX apenas para o células da placenta, não para o feto.

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Divulgações

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X.F. e B.Z. são inventores no pedido de patente PCT/CN2017/108646 enviado por SIAT que abrange um método de entrega de drogas específicas de placenta e sua aplicação. Todos os outros autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais (81771617) e a ciência Natural Fundação da província de Guangdong (2016A030313178) concedido a X.F.; uma concessão da Shenzhen básica fundo de investigação (JCYJ20170413165233512) atribuído a X.F; e a Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil & desenvolvimento humano do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R01HD088549 (o conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, o funcionário vista para o National Institutes of Health) de N.N.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos CD-1Beijing Vital River201Fêmea (8-12 semanas)
Seringa de insulinaBD328421para injeção intravenosa
Etanol absolutoSinopharm 10009218 químicopara síntese de nanopartículas
Lecitina de sojaAvanti Polar Lipids441601para síntese de nanopartículas
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125para síntese de nanopartículas
PLGASigma-Aldrich719897para síntese de nanopartículas
Processador ultrassônicoSonicsVCX130para síntese de nanopartículas
Metotrexato (MTX)Sigma-AldrichV900324para síntese de nanopartículas
Verde de indocianina (ICG)Sigma-Aldrich1340009para in vivo imagem de imagem
com solução salina tamponada com fosfato (PBS)HycloneSH30028.01
Instrumento de espectro IVISPerkin Elmerpara imagens in vivo
Gel de transmissão de ultrassomGuanggongZC4252418para imagens de ultrassom
IsofluranoLunan PharmaceuticalI0040para manter a anestesia
Creme depilatórioNairTMG001para remoção
pele transdutor de 40 MHzVisualSonicsMS550Spara imagem de ultrassom
Sistema de imagem de ultrassom de alta frequênciaVisualSonicsVevo2100para imagem de ultrassom
AvertinSigma-AldrichT48402para anestesia
Bomba de seringaMindraySK-500IIIpara perfusão cardíaca
Solução salina a 0,9%MeilunbioMA0083para perfusão cardíaca
1,5 mL Tubos de polipropilenoAXYGENMCT-150-C-80
° C freezerThermo Fisher Scientific88600V
CentrigugeCenceH1650R
Ácido perclóricoSigma-Aldrich311421para precipitação de proteína
HomogeneizadorSCIENTZSCIENTZ-48para homogeneização de tecido
Filtro de seringa (0,45 μ m)MilliporeSLHV033RS01
hidróxido de sódioSinopharm10019763química para resolver
frascos de HPLCÁguas670650620para HPLC
fosfato de potássio dibásicoSinopharm20032117químico para HPLC
AcetonitrilaJK 932537química para HPLC
C18 colunaÁguas186003966para HPLC
Sistema de HPLCShimadzupara HPLC
de MTX

Referências

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