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Artigo de método

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

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DOI:

10.3791/58222

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20 de setembro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Neste artigo

Resumo

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Resumo

Regulamento de compactação da cromatina é um processo importante que regula a expressão gênica em eucariontes superiores. Embora a compactação da cromatina e regulação da expressão gênica são comumente interrompidos em muitas doenças, tem faltado um locus específico, endógeno e reversível método para estudar e controlar esses mecanismos de ação. Para resolver este problema, desenvolvemos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais gene-regulação. Um componente da molécula bifuncional vincula uma âncora de ADN-proteína assim será recrutado para um locus alelo-específico. O outro componente envolve endógena cromatina-modificando maquinaria celular, recrutamento destas proteínas para um gene de interesse. Estas pequenas moléculas, chamadas químicas epigenéticas modificadores (CEMs), são capazes de controlar a expressão do gene e o ambiente de cromatina de forma dose-dependente e reversível. Aqui, detalhamos uma abordagem CEM e sua aplicação para diminuir a expressão dos genes e acetilação de cauda em um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) localizado no locus de Oct4 em células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Podemos caracterizar o chumbo CEM (CEM23) usando microscopia fluorescente, citometria de fluxo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP), seguido de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Enquanto o poder deste sistema é demonstrado no locus a Oct4 , conceitualmente, a tecnologia CEM é modular e pode ser aplicada em outros tipos de células e em outros loci genômicos.

Introdução

Cromatina consiste de DNA enrolado ao redor de proteínas octamer de histona que formam a partícula nucleosome do núcleo. Regulamento de compactação da cromatina é um mecanismo essencial para a adequada DNA expressão, replicação e reparo1,2,3. Uma maneira em que as células controlam o nível de compactação é através da adição ou remoção de várias modificações de cauda de histona borne-translational. Dois tais modificações incluem acetilação de lisina (1), que é mais comumente associada com a ativação do gene, e metilação de lisina (2), que pode ser associada com ativação do gene ou repressão, dependendo do contexto de aminoácido. A adição das marcas de acetilação e metilação é catalisada por histona acetiltransferases (chapéus) e histona metiltransferases (HMTs), respectivamente, Considerando que a remoção da marca é feita por histona deacetilases (HDACs) e demethylases de histona (HDMs ), respectivamente,4,5. Embora a existência destas proteínas tem sido conhecida há décadas, muitos mecanismos de máquinas como cromatina-modificando obras devidamente regular expressão do gene continuam a ser definido. Uma vez que processos regulatórios de cromatina são prejudicado em muitas doenças humanas, novos insights mecanicistas podem levar a futuras aplicações terapêuticas.

O cromatina na vivo ensaio (CiA) é uma técnica recentemente descrita que usa um indutor químico de proximidade (CIP) para controlar a cromatina-modificando o recrutamento de maquinaria para um locus específico6. Esta tecnologia tem sido costumava estudar uma lista em expansão da dinâmica de cromatina, incluindo proteínas histonas-modificando, empresas de reestruturação da cromatina e transcrição fatores6,7,8,9. CIP-baseado da cromatina tethering de proteínas expressas exogenamente também foi estendido passado CiA para modular loci genéticos não modificado pela utilização com uma proteína associada agrupados regularmente intercaladas curta palíndromo repete CRISPR desativada (dCas9) 10 , 11. no sistema da CiA, mESCs foram modificados para expressar um gene repórter GFP no locus de Oct4 , uma área estritamente regulamentado e altamente expressa do genoma mESC. Anteriormente, este sistema tem sido aplicado para descrever o recrutamento dose-dependente e reversível da proteína de heterocromatina exogenamente expressa 1 (HP1), uma enzima que vincula o H3K9me3 e propaga marcas repressivas (por exemplo, H3K9me3) e DNA metilação de6. Para realizar este tipo de estratégia de recrutamento, os mESCs estão infectados com um plasmídeo que expressa uma proteína de ligação FK506 (FKBP) ligada a um Gal4, que é uma âncora de ADN-proteína que se liga a uma matriz de ligação Gal4 montante do repórter GFP. As células são infectadas também com um domínio de ligação-FKBP-rapamicina (FRB) conectado ao HP1. Quando os mESCs são expostos a concentrações baixas nanomolar do PIC, rapamicina, ambos FRB e FKBP, estão reunidos no locus de alvo. Dentro de dias de tratamento de rapamicina, expressão do gene do alvo é reprimido, como evidenciado por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência e acetilação da histona é diminuída, mostrado pelo ChIP e sequenciamento de bissulfito. Enquanto o desenvolvimento e a validação desta abordagem foram significativos avanços no campo da pesquisa de cromatina e regulação, uma desvantagem é a necessária expressão exógena de cromatina-modificando máquinas.

Para tornar a tecnologia baseada no recrutamento de enzimas fisiologicamente relevantes apenas endógenas e fazer um sistema mais modular, projetamos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais, denominadas CEMs (Figura 1)12. Um componente das CEMs inclui FK506 que, semelhante a rapamicina, liga-se firmemente e especificamente para FKBP. Assim, os CEMs ainda serão recrutados para o locus de Oct4 em mESCs da CiA. O outro componente das CEMs é um agrupamento que vincula a maquinaria de cromatina-modificando endógena. Em um estudo piloto, testamos CEMs que contêm inibidores HDAC. Enquanto o conceito de usando um inibidor para recrutar HDACs parece contra-intuitivo, o inibidor, no entanto, é capaz de recrutar atividade HDAC para o gene de interesse. Isso é realizado por (1) redirecionando o HDAC para o locus, liberando a enzima e aumento da densidade das HDACs un-inibidas na área e inibição de HDAC (2) manutenção no locus, mas recrutar complexos repressivos que ligam para as HDACs inibidas, ou (3) uma combinação de ambos. No estudo anterior, mostramos que o CEMs foram capazes de reprimir com sucesso a repórter GFP de forma dose - e tempo-dependente, bem como de uma maneira que era rapidamente reversível (ou seja, dentro de 24 horas)12. Nós caracteriza a capacidade da tecnologia CEM apresentada aqui a expressão de gene de controle usando microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e a capacidade para controlar o ambiente de cromatina usando ChIP-qPCR6. Aqui, descrevemos um método para usar e caracterizando os CEMs, que facilitarão a adaptação deste sistema para responder perguntas adicionais relacionadas à biologia da cromatina.

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Protocolo

1) cultura de linha celular para a produção de Lentivirus

  1. Crescer fresco, passagem baixa (inferior a passagem 30) células de rim humano embrionário (HEK) 293T em alta-glicose Dulbecco modificada do águia é a mídia de base médio (DMEM) suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 10 mM HEPES, 1 x não aminoácidos essenciais (timina), caneta / Estreptococo, 2-mercaptoenthanol em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2. Dividir as células a cada 3-5 d... e antes que se tornem > 95% de Confluencia.
  2. Células HEK de passagem 293T com 18 x 106 por placa de 15 cm (uma placa de 15 cm para cada vírus produzido).
    1. Para um formato de 15 cm, aspirar a velha mídia, adicionar 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x, Aspire a PBS e adicionar 3 mL de tripsina 0,05%. Incube as celulas em tripsina durante 8 min a 37 ° C, balançando e batendo no meio da incubação das células.
      Nota: O objetivo desta etapa é conseguir as células em uma suspensão de célula única.
  3. Quando as células tiverem chegado a confluência de 60-80% no dia seguinte, realizar uma transfecção o polyethylenimine (PEI) com 13,5 µ g do plasmídeo psPAX2, 4,5 µ g do plasmídeo pMD2.G, 18 µ g do vetor de Lentivirus compatível com entrega com o gene de interesse (ou seja, , FKBP-Gal4), 108 µ l de PEI e 1,8 mL de mídia do transfection.
    1. Delicadamente misturar o DNA, PEI e transfecção de mídia em um tubo cônico de 15 mL, incubar a amostra em temperatura ambiente por 15 min e adicioná-lo gota a gota para a placa de 15 cm.
      Nota: Por favor, uso apropriado de segurança mede e siga todos os institucional e os procedimentos de segurança de laboratório após este passo, como todos os reagentes irão conter um vírus vivo.
  4. Após 16 h de transfecção e incubação numa incubadora 37 ° C com 5% de CO2, aspirar a mídia e adicione delicadamente fresca mídia HEK 293 (pré-aquecido em banho maria a 37 ° C) para as placas de 15 cm. Incube as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 por 48 h após muda a mídia. O vírus está pronto para ser colhido.

2) infecção do Mouse as células estaminais embrionárias (mESC) com Lentivirus

  1. Crescer passagem baixa (menos de passagem, 35), livre de alimentador adaptado CiA mESCs base midiático DMEM alta-glicose suplementado com 20% ESC-série FBS, 10 mM HEPES, inibidor de leucemia x NEAA, caneta/Strep, mercaptoenthanol-2 e 1: 500 1 fator (LIF) em uma incubadora de 37 ° C com 5% CO2.
    Nota: O LIF é obtido a partir do sobrenadante de células produtoras de LIF COS, que são coletados em lote e congelado a-80 ° C.
    1. Desenvolvem-se células em placas que foram pré-incubada para 1-3 h com gelatina de 0,1% em 1X PBS e posteriormente lavadas com PBS 1x. Alimentar as células diariamente e dividi-los a cada 2-3 d, dependendo de sua densidade.
      Nota: Morfologicamente, colônias de células-tronco embrionárias (ES) devem ser pequeno, redondo e distintos uns dos outros.
  2. Passagem mESC em um formato de placa 12 (100.000 células/poço) 1D antes da infecção.
    1. Conte as células com um hemocytometer. Para as células cultivadas em um formato de 10 cm, aspirar a velha mídia, adicionar 5 mL de 1X PBS, Aspire a PBS e adicione 1 mL de tripsina 0,25%. Incube as celulas em tripsina durante 8 min a 37 ° C, balançando e batendo no meio da incubação das células. O objetivo desta etapa é conseguir as células em uma suspensão de célula única.
  3. 48 h após mudar a mídia de 293T15-cm viral embalagem células da etapa 1.4, remover e transferir o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL.
  4. Centrifugue o sobrenadante a 300 x g por 5 min para detritos de célula de Pelotas.
  5. Filtre o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 µm.
    Nota: Certifique-se de utilizar membranas de surfactante livre de acetato de celulose (SFCA), como alguns outros materiais podem reter vírus e reduzem significativamente a produtividade.
  6. Concentrar o vírus com ultracentrifugação, utilizando uma centrífuga com um rotor de SW32 e girá-lo a 20.000 rpm (~ 72.000 x g) para 2,5 h a 4 ° C.
  7. Enquanto o vírus concentra-se sob ultracentrifugação, trate os mESCs CiA na placa de 12 com media de ES fresco contendo 5 µ g/mL de polybrene.
  8. Quando a concentração de vírus tiver terminado, cuidadosamente, aspirar o sobrenadante e suspender o sedimento do vírus em 100 µ l de PBS 1x (evitar bolhas em excesso).
  9. Adicione o vírus e 1X PBS para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Vórtice/agitar o tubo a 300 x g (ou na posição mais baixa) para suspender totalmente o vírus. Girar o tubo em uma centrífuga mini mesa para 5-10 s para remover as bolhas.
  10. Adicione 30 µ l do vírus a cada poço de uma placa de 12. A placa do redemoinho e centrifugar a placa a 1.000 x g por 20 min.
    Nota: A quantidade de vírus adicionado pode ser variada dependendo do título viral, que é inversamente relacionado ao tamanho de construção de entrega.
    1. Alternativamente, flash congelar o vírus com nitrogênio líquido e armazená-lo a-80 ° C. No entanto, congelar o vírus irá diminuir o título viral.
  11. Coloque a placa de 12 em incubadora a 37 ° C e mudar os meios de comunicação na manhã seguinte (~ 16 h) mais tarde com mídia de ES fresca (conforme descrito no passo 2.1).
  12. Após 48 h de infecção, selecione para células que integrado o plasmídeo viral adicionando o antibiótico apropriado (ou seja, 1,5 µ g/mL de puromicina, 10 µ g/mL de blasticidin, etc.). Mudar a mídia diariamente e lavar as células com PBS 1x, se a maioria das células são flutuantes/mortos. Manter os meios de seleção sobre as células para 72-96 h em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.

3) tratamento e preparação de s de modificadores epigenéticas química (CEM)

  1. Suspenda o CEM em pó em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração das ações de 1 mM e uma concentração de trabalho de 100 µM.
  2. Depois que as células foram submetidas a seleção para 72-96 h, dividir os mESCs em um formato de 12-poços com 100.000 células/poço. Incubar as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 por 24 h. posteriormente, preparar uma solução de mídia de 100 nM CEM com mídia do ES. Use esta mídia para alimentar a CiA mESC com 1ml/bem. Para servir como um controle, manter um poço de células sem qualquer CEMs adicionados.
    1. Mude a mídia por aspiração mídias antigas e adicionando 1ml/bem de mídia contendo CEM ou livre de CEM ES preparadas cada 24 h para a duração de um experimento.

4) a análise da expressão por microscopia e citometria de fluxo

  1. Após 48 horas de tratamento CEM, imagem das células sem tratamento CEM e as células tratadas com 100 nM CEM usando um microscópio de fluorescência. Levar imagens representativas, usando fase ou brightfield registro a morfologia mESC na ampliação de 20 X; as células devem ter se formado colônias redondas, com algumas células diferenciadas. Sob o canal de fluorescência FITC, imagem tanto condições de célula.
  2. Isole o controle e tratados com CEM células por citometria de fluxo por aspiração a mídia, lavar as células com 1 mL de 1X PBS, aspirando a PBS e adição de 0,25 mL de tripsina 0,25% com EDTA para 8-10 min.
  3. Confirme que as células não estão mais em grandes aglomerações, olhando no microscópio. Use uma ampliação de 20 X. Se as células não parecem estar em uma suspensão de célula única, pipete delicadamente acima e para baixo com uma pipeta P1000 para trypsinize totalmente as células.
  4. Saciar a tripsina com 1 mL de mídia fresca e ressuspender as células em alta velocidade com uma pipeta sorológica (ou usando uma pipeta P1000 e ponta) até que as células estão em uma suspensão de célula única.
  5. Gire para baixo as células em 300 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante. Lavagem com PBS 1x e Recentrifugue as células. Aspire o sobrenadante de PBS.
  6. Ressuspender as células em 200 mL de tampão de FACS (ácido etilenodiaminotetracético de 1 mM [EDTA], 1X PBS e 0,2% albumina de soro bovino [BSA]).
    1. O volume total do buffer de FACS será dependente de quantas células estão presentes, mas a concentração deve ser 1.000-3.000 células / µ l. contar o número de células em 3 amostras e média da concentração de células. Adicione mais buffer de FACS, se necessário.
  7. Execute a citometria de fluxo em > 50.000 células com as células suspensas, mantendo as células no gelo, quando eles não estão sendo analisados. Use um filtro de 530/40 (FITC, AF488, as boas práticas agrícolas, etc.) para gravar as alterações na expressão. Determinar a tensão fluorescente apropriada usando uma amostra de células controle não tratados e definir a tensão de ter o pico fluorescente estar no meio do espectro de intensidade gravada. Execute as amostras a uma velocidade de bainha de cerca de 5.000 células/s.
  8. Exportar os dados e analisar os arquivos do FCS em um programa de citometria de fluxo (isto é, FlowJo) pelo gating primeiro na dispersão direta vs lado dispersão de células vivas e, em seguida avançar dispersão altura vs área para camisolas. Em seguida, Visualizar os dados de canal GFP em um histograma para determinar a expressão relativa de GFP no alvo e controlar as populações.

5) a análise da cromatina por cromatina imunoprecipitação (ChIP) seguido por qPCR

  1. Dividir os mESCs em uma placa de 10 cm, com 3 milhões de células e 10 mL de mídia do ES (uma placa de 10 cm para cada experimental ou controlar a doença). No dia seguinte, adicione 10 mL de mídia contendo CEM ou CEM-livre. Após 48 horas de tratamento CEM, Aspire a velha mídia. Lavar e aspirar as células com 5 mL de 1X PBS. Em seguida, dissociar as células com tripsina 0,25% e saciar a tripsina com 10 mL de mídia do ES. Conte e isolar uma amostra de 10 milhões de células por condição.
  2. Spin para baixo de cada uma das amostras de 10 milhões de células a 300 x g por 5 min.
  3. Ressuspender em 10 mL de 1X PBS a cada e Recentrifugue as células a 300 x g por 5 min.
  4. Cada Ressuspender em 10 mL de tampão de correção de CiA (pH 50mm 8, pH de 1 mM EDTA 8, 0.5 mM glicol de etileno-bis [ß-aminoetilo éter]-N, N, N', N'-tetraacetic acid [EGTA] pH 8 e 100 mM de cloreto de sódio [NaCl]). Adicione 1 mL de solução de formaldeído de 11% e inverter imediatamente as amostras de 5 - 10 x. Incube a amostra em temperatura ambiente por 10 min.
  5. Adicione 0,5 mL de glicina de 2,5 M. Inverter as amostras imediatamente e incubar a amostra no gelo por 5 min.
  6. Centrifugar a amostra a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante.
  7. Resuspenda o pellet em 10 mL de CiA enxágue 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM de NaCl, pH de 1 mM EDTA 8, 10% de glicerol, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] e 0,25% Triton X100). Incubar a amostra no gelo por 10 min.-centrifugar a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C.
  8. Resuspenda o pellet em 10 mL de CiA enxaguar 2 (10 mM tris [hidroximetil] aminometano [Tris] pH 8, pH de 1 mM EDTA 8, 0.5 mM EGTA pH 8 e 200 mM NaCl). Centrifugar a amostra a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C.
  9. Delicadamente, adicione 5 mL de CiA tosquia tampão (0,1% SDS, EDTA 1 mM e 10 mM Tris pH 8) ao longo dos lados do tubo cónico de lavar qualquer sal sem interromper a pelota. Centrifugar a amostra a 1.200 x g durante 3 min a 4 ° C. Repita a etapa de lavagem.
  10. Resuspenda o pellet em 90 µ l de tampão corte CiA e inibidores de protease fresco (uso uma mistura de leupeptin, pepstatin A e chymostatin juntos dissolvida em 10mg/mL cada em DMSO tornar um 1.000 x solução-mãe, fazendo uma concentração final de 10 µ g/mL). Adicione 10 µ l de nanodroplets reforço sonication mantendo tudo no gelo13,14.
  11. Transferir 100 µ l da solução para um tubo de vidro e a tampa do tubo.
  12. Proceda à sonicação amostras para 3,5 min (determinado com base na linha celular e no número de células). Para evitar o superaquecimento das amostras, processa as amostras em tempos de ciclo 2-min-máximo se o tempo total sonication excede 2 min.
    Nota: O ultrasonicator concentrado aqui funções usadas em alta-frequência (500 kHz). Executar a máquina em uma potência acústica de 55 w. A duração do sonication deve ser predeterminada por cada laboratório individual.
  13. Transferi cada amostra de cromatina lisados para um novo tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Girar os tubos a 8.000 x g por 2 min a 4 ° C.
  14. Para analisar a eficiência de corte e de quantificar a quantidade relativa de cromatina, segui o protocolo do fabricante do ChIP.
    Nota: Determinar a concentração de DNA espectrofotometricamente (por exemplo, usando um instrumento de nanodrop DNA), e executar ~ 200 ng de DNA em um gel de agarose 1% para verificar que a cromatina é lisada para cerca de 200-500 basepairs (bp) em tamanho.
  15. Para realizar a imunoprecipitação e isolar a cromatina, seguir o protocolo do fabricante do ChIP.
    Nota: Para a imunoprecipitação de amostras com concentrações mais elevadas de DNA, aquecer o tampão de eluição, a 37 ° C e eluir as amostras 2 x com 30 µ l de tampão de eluição (fiação para 1 min cada vez).
  16. Para executar o qPCR, carrega os reagentes em uma placa de 384. Adicionar 5 µ l de mistura mestre de tintura de cianina assimétrico de 2x, 2.5 µ m de cada primer, água e 0.1 - 10 ng de DNA para cada reação.
    1. Projeto primers para amplificar amplicons bp 50-100 e os valores de CT são normalizados para um gene de manutenção da casa, as partículas de um tipo de intracisternal (IAP).
      Nota: Para mais qPCR métodos, consulte protocolo do fabricante kit. Conjunto de primer usado para direcionar o locus de Oct4 foi: CACATGAAGCAGCACGACTT (F); (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. A cartilha de controle conjunto usada para IAP alvo foi: ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (F); (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Baseado nos primers e o produto desejado, execute o qPCR com 40 ciclos de uma temperatura do recozimento de 60 ° C por 1 min.
      Nota: Os dados resultantes foi quantificados usando as delta-delta Ct comparações entre as amostras, com CiA:Oct4 normalizado ao longo do IAP. Os resultados da análise final são exibidos como médias de amostras experimentais triplicadas, com o erro representado como o desvio padrão da média.

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Resultados

Recentemente desenvolvemos CEMs e demonstrou que esta tecnologia pode ser aplicada para regular a expressão dos genes e o ambiente de cromatina em um locus de repórter de forma dose-dependente e reversível. Na Figura 1, é mostrado um modelo de liderança, CEM, CEM23. Máquinas HDAC é recrutada para o locus de repórter por que, neste caso, é o repórter GFP inserido no locus de Oct4 inibidor HDAC.

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Discussão

Aqui, descrevemos o recentemente desenvolvido sistema CEM sendo aplicado para regular a expressão de gene e ambiente de cromatina em um gene específico de forma dose-dependente. Nós fornecemos um método preciso para estudar a dinâmica envolvida na regulação da expressão gênica através do recrutamento seletivo das proteínas reguladoras específicas cromatina endógena. Esta é uma tecnologia altamente modular que pode ser aplicada para investigar como diferente proteínas e cromatina-modificação de complexos trabalham em conj...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer aos membros dos laboratórios Hathaway e Jin para suas discussões úteis. Os autores também agradecer Dan Crona e Ian MacDonald por sua leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte por Grant R01GM118653 de os E.U. National Institutes of Health (para N.A.H.); e por subsídios R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 de o E.U. National institutos de saúde (JJ). Este trabalho também foi apoiado por um nível 3 e um estudante concedem da UNC Eshelman Instituto de inovação (N.A.H e A.M.C, respectivamente). Financiamento adicional de um GM007092 de T-32 (a A.M.C) com suporte a este trabalho. Obteve-se dados de citometria de fluxo na UNC Flow Cytometry Core instalação financiado por um P30 CA016086 Cancer Center núcleo apoio Grant para o UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMCorning10-013CV
NEAAGibco11140-050
HEPES (para cultura de tecidos)Corning25-060-Cl
BME (2-mercaptoetanol)Gibco21985-023
FBSAtlantic BiologicalsS11550Lotes individuais testados para
tubos Covarisde qualidadeThermoScientificC4008-632R
Covaris capsThermoScientificC4008-2A
PEI (polietilenomina)Polysciences23966-1
Meios de transfecção (Opti-mem)TubosGibco 31985070
VirusBeckman Coulter344058
Membrana de filtro de vírusCorning431220
PolybreneSanta Cruz BiotechnologySC134220
0,25% TripsinaGibco25200-056com EDTA
0,05% TripsinaGibco25400-054com EDTA
PuromicinaInvivoGenant-pr
BlasticidinaInvivoGenant-bl
SYBR Green Master Mix (corante de cianina assimétrico)Roche4913914001
anticorpo H3K27acAbcamab4729
(kit ChIP) Kit de alta sensibilidade ChIP-ITActive Motif53040
SonicatorCovarisE110
UltracentrifugeOptimaXPN-80
SW-32 rotor de centrífugaBeckman Coulter14U4354
Baldes de centrífuga SW-32 TiBeckman Coulter130.2
LentiX 293 Rim Embrionário HumanoClontech632180
PBSCorning46-013-CM
BSAFisherBP9700
EGTASigmaE3889
EDTAFisherS311-100
NaClFisherS271-1
GlicerolFisherG33-1
TrisFisherBP152
NP40Roche11754599001
TritonMP Biomedicals807426
GlicinaFisherBP381-500
TE tampãoFisherBP2474-1
HEPES (para ChIP)FisherBP310-100
GelatinaSigmaG1890
Citômetro de fluxo, Attune NxTThermo FisherA24858
FKBP-Gal4 plasmídeoAddgene44245
psPAX2 plasmídeoAddgene12260
pMD2.G plasmídeoAddgene12259
NanodropletsMegaShearN / A
DNA NanodropThermo FisherND1000
Inibidores de Protease (Leupeptina)Calbiochem / EMD108975
Inibidores de Protease (Quimostatina)Calbiochem / EMD230790
Inibidores de Protease (Pepstatina)Calbiochem / EMD516481
CiA: Oct4 mESCO gentil presente de G. Crabtree
Lif-1C-alfa - produzindo células CosO gentil presente de J. Wysocka
de centrífuga

Referências

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
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