Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

Resumo

Canais de íon Mechanosensitive muitas vezes são estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com gravação de remendo-braçadeira. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados no fluxo fluidos-regulamentos de canais iônicos pode ser errôneo. Aqui, nós fornecemos métodos de prevenção e corrigir esses erros com uma base teórica.

Resumo

Fluxo de fluido é um importante estímulo ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo fluido/não são totalmente compreendidos, fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon pode contribuir criticamente. Portanto, sensibilidade de força fluido fluxo/tesoura de canais iônicos tem sido estudada usando a técnica patch-clamp. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados e a interpretação dos dados podem ser errôneas. Aqui, apresentamos a evidência experimental e teórica para erros relacionados ao fluxo fluidos e fornecer métodos para estimar, prevenindo e corrigindo esses erros. Alterações na junção potencial entre o eletrodo de referência Ag/AgCl e banho líquido foram medidas com uma pipeta aberta cheia de 3 M KCl. escoamento de fluidos pode, em seguida, deslocar o mV de potencial de aproximadamente 7 junção metal líquido. Por outro lado, medindo-se a mudança de tensão induzida pelo fluxo de fluido, estimamos a concentração do íon na camada limite unstirred. Na condição estática, as concentrações de íon real adjacentes para a entrada do canal eletrodo ou íon da referência do Ag/AgCl na superfície da membrana celular podem chegar tão baixo como aproximadamente 30% do que na condição de fluxo. Colocando um agarose 3M ponte de KCl entre o eléctrodo de referência e fluido banho pode ter evitado este problema de deslocamento potencial de junção. No entanto, o efeito de camada unstirred adjacente à superfície da membrana celular não poderia ser fixado desta forma. Aqui, nós fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta, enfatizando a importância do uso de um sal de agarose-ponte enquanto estudava fluido Regulamento induzida pelo fluxo de correntes de íon. Portanto, esta nova abordagem, que leva em consideração a concentração real de íons na camada limite unstirred, pode fornecer uma visão útil no delineamento experimental e interpretação de dados relacionados ao regulamento de tensão de cisalhamento fluido de canais iônicos .

Introdução

Fluxo de fluido é uma importante sinalização ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido e fluido cisalhamento força dependente vascular remodelação e desenvolvimento^{1,2, 3,4,5}. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo de fluido não são totalmente compreendidos, acredita-se que o fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon criticamente pode contribuir para ....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais da Universidade de Konkuk.

1. Agarose pontes de sal entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl

Nota: Agarose 3M KCl pontes de sal são produzidos como anteriormente descrito¹² com pequenas variações.

1. Formação de pontes
   1. Dobre os tubos capilares de vidro de fogo para formar uma U-forma conforme apropriado. O diâmetro interno dos capilares deve ser grande o suficiente para reduzir a resistência série, durante a gravação de correntes grandes do íon. Tubos de 2 a 5 mm de diâm....

Resultados

Toda célula dependentes de voltagem Ca L-tipo^{2 +} canal (VDCC_L) correntes foram gravadas nos rato enzimaticamente dispersos miócitos de arterial mesentérica, como descrito anteriormente,¹¹. Os miócitos arteriais foram diálise com uma solução de pipeta Cs-rica sob a configuração de nistatina perfurado com solução de banho livre de cátion divalente, para facilitar o fluxo de corrente através de de^11,VDCC_L

Discussão

Neste estudo, temos demonstrado um método para medir a concentração de Cl^– real na camada unstirred adjacente para o eletrodo de referência Ag/AgCl, determinando a potencial de junção metal líquido com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta preenchida com um alto KCl concentração. A mudança na concentração de Cl^– na camada limite pode resultar em uma mudança de potencial de junção quando mudar de estática para condições de fluxo de fluido. Simplesmente usar um ponte de KCl entre o eléctrodo de refe.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara de banho aberta RC-11	Warner instruments, EUA	W4 64-0307
Pellet de eletrodo Ag / AgCl	World Precision Instruments, EUA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, EUA	A9793
Amplificador de grampo de tensão	HEKA, Alemanha	EPC8
Amplificador de grampo de tensão	Molecular Devices, EUA	Axopatch 200B
Bomba para líquidos	KNF Flodos, Suíça	FEM08