No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

Resumo

O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.

Resumo

O objetivo do método a ser apresentado é para mostrar, pela primeira vez, o transplante de recém-nascido thymi na câmara anterior do olho do isogénicas ratos adultos na vivo longitudinal monitoramento em tempo real da dinâmica de thymocytes´ dentro de um vascularizado segmento de timo. Após o transplante, laser, microscopia (LSM) através da córnea permite na vivo não invasiva imagens repetidas no nível celular resolução. Importante, a adiciona a maturação de células T intravital anterior modelos de imagem a possibilidade de recrutamento de células progenitoras contínua e gravações de egresso de células T maduras no mesmo animal. Vantagens adicionais do sistema são a transparência da área enxertada, permitindo monitoramento rápido macroscópico do tecido implantado, e a acessibilidade ao implante permitindo localizadas além de tratamentos sistémicos. A principal limitação, sendo o volume do tecido que se encaixa no espaço reduzido da câmara do olho que exige para o aparamento de lobo. Integridade do órgão é maximizada dissecando lobos do timo em padrões mostrados anteriormente para ser funcional para a produção de células T madura. A técnica é potencialmente adequada para interrogar um meio de clinicamente relevantes questões relacionadas com a função do Timo que incluem auto-imunidade, imunodeficiência e tolerância central; processos que permanecem mecanicamente mal definidos. A dissecação bem dos mecanismos orientadores timócitos migração, diferenciação e seleção deve levar a novas estratégias terapêuticas, visando o desenvolvimento de células T.

Introdução

Diferenciação de células T intratímica e seleção de subpopulação de células T constituem processos-chave para o desenvolvimento e a manutenção da imunidade mediada por células de vertebrados¹. Esse processo envolve uma sequência complexa de eventos firmemente organizados, incluindo o recrutamento de progenitores da corrente sanguínea, migração e proliferação celular, expressão diferencial de proteínas de membrana e morte celular programada maciça para subconjuntos seleção. O resultado é a liberação de T-células maduras reativas para um amplo espectro de antígenos estranhos ao exibir respostas minimizadas para autopeptídeos, que acabar-se coloni....

Protocolo

O cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Miami aprovaram todos os experimentos de acordo com as diretrizes IACUC.

1. isolamento e corte de recém-nascido Thymi

1. Prepare todos os reagentes e instrumentos por autoclavagem ou outros métodos, garantindo condições estéreis.
2. Para minimizar as contaminações, execute todos os procedimentos cirúrgicos sob uma capa de fluxo laminar.
3. Antes da eutanásia ratos doador, encha um prato estéril de 60 mm com estéril prechilled 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) e coloque-o no gelo. Ele irá ser usado para enxaguar e armazenar o thymi....

Resultados

Timo de camundongos recém-nascidos foram isoladas a partir B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratos, conforme descrito no presente protocolo (etapas 1,1-1,9). Nestes ratos transgénicos, o promotor do frango beta actina direciona a expressão da variante da proteína fluorescente vermelha DsRed. MST sob a influência do realçador início imediato citomegalovírus (CMV), facilitando o rastreamento dos implantes.

Para evitar re.......

Discussão

Devido a importância do processo de maturação de células T de competência imunológica individual⁴ e o presumível impacto da dinâmica de célula precursora na T-células maduras, produzidas pela Timo^2,3, grandes esforços foram investidos desenvolver alternativas para a abordagem de instantâneo clássico tecido fixo.

Apesar de fatias de tecido e outros explantes são claramente superiores em reproduzir a arquitetura d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vaporizador de isofluorano com isofluorano	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Escopo de dissecação com fonte de luz	Zeiss	Stemi 305
Pinça de dissecção fina	WPI	500455
Pinça de dissecção média	WPI	501252
Pinça de dissecação fina de ponta curva	WPI	15917
Tesoura Vannas	WPI	503371
Tesoura de dissecação	WPI	503243
Bisturi	WPI	500353
40 mm Agulhas 18G	BD	304622
Pipeta de transferência descartável	Thermofisher	201C
Almofada térmica e lâmpada de calor	Kent Scientific Corp	Infravermelho
Etanol 70%	VWR	83.813.360
Prato estéril de 60 mm	SIGMA	CLS430166
Estéril 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Toalhetes estéreis	Kimberly-Clark	LD004
Medicamentos para o controle da dor	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Solução salina ou Viscotears	Novartis	N/A
Estereomicroscópio	Leica	MZ FLIII
Adaptador de fixação da cabeça	Narishige	SG-4N-S
Máscara de gás	Narishige	GM-4_S
Microscópio confocal	Leica	TCS SP5 II
Capuz de fluxo laminar	Telstar	BIO IIA