Artigo de método

Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9

DOI:

10.3791/58237

⸱

14 de junho de 2018

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1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).

Resumo

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CRISPR/Cas9 tecnologia está acelerando a engenharia do genoma em muitos tipos de células, mas até agora, entrega do gene e modificação genética estável ter sido desafiador no primárias células NK. Por exemplo, entrega de transgene usando transdução Lentivirus ou retroviral resultou em um rendimento limitado de geneticamente modificadas as células NK devido a apoptose celular NK substancial procedimento associado. Descrevemos aqui um método livre de DNA para edição de genoma de células humanas primárias e expandidas NK usando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permitiu eficiente nocaute do TGFBR2 e HPRT1 de genes em células NK. Dados de RT-PCR mostram uma diminuição significativa no nível de expressão do gene, e um ensaio de citotoxicidade de um produto representativo da célula sugeriu que as células NK RNP-modificado tornou-se menos sensíveis a TGFβ. Células geneticamente modificadas podem ser expandido post-eletroporação por estimulação com mbIL21-expressando irradiado células do alimentador.

Introdução

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Imunoterapia tem sido avançada nos últimos anos. As pilhas de T do receptor (carro) de antígeno quimérico geneticamente modificados são um excelente exemplo de células do sistema imunológico engenharia implantado com sucesso em imunoterapia. Estas células foram recentemente aprovadas pelo FDA para o tratamento contra CD19 + B de células malignas, mas sucesso até agora tem sido limitado a doenças tendo alguns antígenos targetable e direcionamento de tais repertórios antigênicos limitados é propenso ao fracasso pela fuga imune. Além disso, as células T de carro foi centraram-se sobre o uso de células autólogas T devido ao risco de enxerto versus doença-- host causada por pilhas de T alogênico. Em contraste, as células NK são capazes de matar alvos de tumor de forma independente de antigénio e não causam GvHD, que os torna um bom candidato para câncer imunoterapia6,7,8,9.

CRISPR/Cas9 tecnologia tem sido usada recentemente em engenharia células do sistema imune, mas geneticamente reprogramar células NK com plasmídeos sempre foi um desafio. Isto foi devido a dificuldades na entrega do transgene em uma maneira dependente de DNA como transdução de Lentivirus e retroviral causando substancial associada a procedimento NK apoptose celular e a produção limitada da engenharia genética de células NK4 , 9.

Muitas células do sistema imune inatas expressam altos níveis de receptores para padrões moleculares associados patógeno como gene induzida em ácido retinoico eu (RIG-eu), que permitem maior reconhecimento de DNA estranho. Supressão destas vias permitiu maior eficiência de transdução em células NK quando usando métodos baseados em DNA por modificação genética10.

Descrevemos aqui o método para usar um genoma DNA livre edição de primárias e expandidas NK células humanas utilizando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs é composto de três componentes, recombinante Cas9 proteína complexada com RNA de single-guia sintético composto de um complexado crRNA e tracerRNA. Estes Cas9/RNPs são capazes de clivagem genômicos alvos com maior eficiência em comparação com abordagens de DNA-dependente estrangeiras devido a sua entrega como complexos funcionais. Além disso, liberação rápida de Cas9/RNPs das células pode reduzir os efeitos de fora do alvo como a indução da apoptose. Assim, eles podem ser usados para gerar nocautes, ou bater-ins quando combinado com o DNA para o recombination homologous6,7. Nós mostramos que eletroporação de Cas9/RNPs é um método fácil e relativamente eficiente que supera as limitações anteriores de modificação genética em células NK.

TGFβ é uma principais citocinas imunossupressoras, que inibe a ativação e funções das células NK. Tem sido sugerido que o direcionamento da via TGFβ pode aumentar funções de células imunes. Escolhemos a região de codificação TGBR2 ectodomínio que vincula TGFβ11. Os resultados representativos mostram uma diminuição significativa no nível de expressão de RNAm de um gene e ainda demonstram que as células NK modificadas se tornam resistentes aos TGFβ. Além disso, as células modificadas mantém viabilidade e potencial proliferativo, como eles são capazes de ser expandido post-electroporation usando células irradiadas alimentador. Portanto, o método a seguir é uma abordagem promissora para manipular geneticamente células NK para qualquer mais clínico ou fins de investigação.

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Protocolo

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Casacos de buffy de doadores saudáveis foram obtidos como fonte de materiais de Central Ohio região Cruz Vermelha americana. Esta pesquisa foi determinada como sendo pesquisa isenta por Review Board Nationwide Hospital infantil da institucional.

1. expansão e purificação de célula NK humana

  1. Isole PBMCs do Buffy Coat12.
    1. 35 mL de amostra de buffy coat em 15 mL de Ficoll-Paque de camada.
    2. Centrifugar a 400 x g por 20 minutos sem freio e coletar o PBMC através da interface.
    3. Lavar os PBMCs recuperados três vezes adicionando pelo menos um volume igual de PBS, centrifugação a 400 x g por 5 minutos e aspirando o PBC lavagem. Células NK podem ser isoladas nesta fase por RosettesSep,13.
  2. Expandir as células NK, estimulando com irradiados 10x106 mbIL21-expressando células alimentador em dias 0, 7 e 14. Substituir a mídia com RPMI fresco contendo 10% FBS, 1% glutamina, 1% penicilina estreptomicina e 100 UI/mL de Il-2 para o volume de toda a mídia todos os dias.

2. gRNA Design e seleção

  1. Escolha o locus genômicos específicos para o alvo, usando ferramentas on-line, por exemplo, NCBI, Ensemble.
    Exemplo.
    Descrição: Transformando o receptor de fator de crescimento beta 2 (TGFBRR2) ectodomínio
    Exibir registro: PF08917
    Ver os InterPro: IPR015013
    Cargo: 49-157 aa
    Sequência alvo: Exon 4 do gene TGFBR2 (ENSG00000163513)
  2. Para projetar o gRNAs, usar ferramentas de web design CRISPR tais como http://crispr.mit.edu e 'Benchling'.
    1. Digite na sequência do DNA escolhida no passo 2.1. Escolha humano (hg 19) como um genoma alvo. CRISPR guias (20 nucleotídeos seguiram por uma sequência de PAM: NGG) serão digitalizados da sequência inserida anteriormente. Ele também mostra possíveis correspondências o alvo durante todo o genoma selecionado.
    2. Escolha os melhores três gRNAs que têm a maior pontuação, com base em suas taxas no alvo e o alvo. Por exemplo, a tabela 1 mostra os RNAs CRISPR projetado alvejar exon 4 do gene TGFBR2 sugerido por ferramentas de web design CRISPR.
  3. Ordem a RNAs CRISPR como sintética crRNAs sequência-específicos.
  4. Encomendar uma conservada, transactivating do RNA (tracrRNA) para interagir através de homologia parcial com o crRNA.

3. projeto exclusão Primers de triagem

  1. Cartilhas do projeto abrangendo os locais de clivagem de gRNA para ensaio de mutação T7E1.
  2. Uso as primeiras demão de pelo menos 100 bp longe do local de clivagem previsto para assegurar pequena inserção-exclusão (puntuais) no local de destino de sgRNA aparecerá em gel de agarose 1,5%, após o ensaio de mutação. A tabela 2 mostra os primers que são usados para amplificar o ectodomínio TGFBR2.

4. transdução de células humanas primárias e expandida NK

Nota: Transdução de elementos Cas9/RNPs em NK é feita por eletroporação usando sistema 4D como segue.

  1. Celular Preparação
    1. Para primárias células NK, incubar recém isoladas células NK em meio RPMI na presença de 100 UI/mL de Il-2 por 4 dias e realizar a eletroporação no dia 5. Substitua a mídia todos os dias, conforme descrito anteriormente e no dia anterior a transdução.
    2. Para expandido células NK, estimulam as células no dia 0 com células irradiadas alimentador na proporção de 1:1 e executar o electroporation no dia 5 ou 6 ou 7. Substitua a mídia todos os dias, conforme descrito anteriormente e no dia anterior a transdução.
    3. No dia da eletroporação, prepare um frasco T25 preenchido com 8 mL de RPMI fresco contendo 100 UI/mL de Il-2 para células passando por eletroporação e pre-incubate frascos numa umidificado 37 ° C e 5% CO2 incubadora.
      Nota: Nas células descongeladas ou que foram submetidos a 2nd ou 3rd estimulação pode ser electroporated a qualquer momento após a sua recuperação, conforme descrito.
    4. Tome 3 a 4 × 106 células por condição para 26 µ l do mix de transdução.
      Nota: Concentração muito elevada de células NK em solução de eletroporação aumenta a taxa de transdução.
    5. Lave as células 3 vezes com PBS para remover todos os FBS, que geralmente contém atividade RNase. Girá-los para baixo cada vez a 300 x g durante 8 minutos.
      Nota: Considere 7 condições electroporation Cas/RNPs como único gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) e uma combinação de dois gRNAs (gRNA1 + gRNA2 + gRNA3, gRNA1, gRNA2 + gRNA3) e um controle com nenhum Cas9/RNPs.
  2. Formar o crRNA:tracerRNA / complexo
    1. Resuspenda crRNAs (gRNA1, gRNA2 e gRNA3) e tracerRNA em 1 x solução de TE para concentrações finais de 200 μM. 2.2 Mix μL de cada gRNA de 200 μM com 200 μM tracerRNA, conforme mostrado na tabela 3.
    2. As amostras a 95 ° C por 5 min do calor e deixe arrefecer no topo do banco para a temperatura ambiente (15-25 ° C). Loja resuspended RNAs e crRNA: tracerRNA/complexo a-20 ° C para uso posterior.
  3. Formam o complexo RNP
    Nota:     para poupar tempo, formar complexo durante a lavagem da RNP passo 4.1.5.
    1. Para crRNA:tracrRNA única reação frente e verso, dilua Cas9 endonuclease de 36 μM, como mostra o exemplo na tabela 4.
    2. Para a transdução de combinação de crRNA:tracrRNA duplex, diluir Cas9 endonuclease de 36 μM como mostrado pelo exemplo no tabela 5.
    3. Adicionar Cas9 endonuclease para crRNA:tracrRNA duplex lentamente enquanto rodando a ponta da pipeta, mais de 30 s a 1 minuto.
    4. Incube a mistura à temperatura ambiente por 15-20 min. Se não estiver pronto para usar a mistura após a incubação, manter a mistura no gelo até o uso.
  4. Electroporation
    1. Adicionar o suplemento de todo a solução de eletroporação P3 e mantê-lo em temperatura ambiente.
    2. Ressuspender as células (3-4 × 106 células da etapa 4.1.5) em 20 μL de solução de eletroporação 4D primária P3. Evite bolhas de ar durante a pipetagem.
      Nota: as pilhas não devem ser deixadas por um longo tempo na solução de P3.
    3. Imediatamente Adicione 5 µ l de complexo RNP (passo 4.3) para a suspensão de eritrócitos.
    4. Adicione 1 μL de 100 μM Cas9 electroporation realçador à Cas9/RNPs/célula misturar.
    5. Transferi a mistura Cas9/RNPs/celular em 20 μL electroporation tiras.
    6. Bata levemente as tiras para certificar-se que a amostra cobre a parte inferior das tiras.
    7. Iniciar sistema de eletroporação de 4D e escolher o programa EN-138 .

5. post transdução

  1. Deixe descansar por 3 minutos nas tiras que as células.
  2. Adicione 80 µ l dos meios de cultura pré-equilibrado para a cubeta e suavemente, transferir a amostra para frascos.
  3. 48 horas depois de transdução, extrai DNA genômico de 5 × 105 células para as exclusões de gene de triagem.
  4. Amplifica o gene de interesse usando as primeiras demão projetadas no passo 3.2 com kits de Taq DNA polimerase.
  5. Formar PCR amplicons heteroduplexes para T7EI digestão e incubar o produto por 30-60 minutos com uma enzima de T7EI em 37 ° C.
    Nota: O T7EI assay é preferencial para a seleção como ele é rápido, simples e fornece limpar resultados de electroforese em relação ao uso do ensaio de agrimensor. No entanto, esse método não é possível detectar inserções e deleções de < 2 bases que são geradas pela não-homóloga final ingressar na atividade (NHEJ) em experimentos de Cas9 RNPs14.
  6. Executar o DNA digerido em 1,5% gel de agarose em 110 V por 30-45 minutos, a cada 15 minutos visualize o gel.
  7. Estimular o resto das células com o mbIL21-expressando células alimentador na proporção de 1:1.
  8. Cinco dias após estimulação extrair o RNA para nível de expressão do gene usando qPCR.
  9. Realizar ensaios de calceína como relatado anteriormente,12. Brevemente, carrega nas células-alvo com calceína AM (no exemplo mostrado, utilizou-se 3 µ g/mL/1.000.000 células DAOY). Prepare as células NK para ensaios de citotoxicidade, descansando durante a noite no IL2 (100 UI/mL) mais ou menos 10 ng/mL TGFβ solúvel. Realizar ensaios de calceína nas mesmas citocinas como as células NK foram descansou durante a noite.

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Resultados

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Eficiência de eletroporação

Para otimizar a eletroporação de Cas9/RNPs, testamos 16 programas diferentes com transdução de siRNA de direcionamento-GFP e plasmídeo de DNA em células NK. Ensaio de citometria de fluxo mostrou que o pt-138 teve a maior porcentagem de viabilidade e transdução eficiência da célula (35% GFP positivas células vivas) para ambas as partículas (Figura 1 e

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Discussão

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Modificação de dependente de DNA das células NK tem sido desafiador4,9. Portanto, introduzimos diretamente um complexo ribonucleoprotein sinteticamente pré-formadas (RNPs) e proteína Cas9 como proteína purificada no de células NK primárias e expandida8. Este método permitiu-na eliminar tampando, seguindo, e outros processos transcricionais e translacionais começaram pela RNA polimerase II, que pode causar apoptose de células NK associados ...

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Divulgações

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DAL serve/serviu como consultor por Courier Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, laboratórios de pesquisa da Merck e Miltenyi Biotec e tem participações/liderança em CytoSen Therapeutics.

Agradecimentos

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Reconhecemos o Brian Tullius por sua gentil ajuda em editar o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RosetteSep™ Coquetel de Enriquecimento de Células NK HumanasSTEMCELL Technologies15065A RosetaSep™ O coquetel de enriquecimento de células NK humanas foi projetado para isolar células NK do sangue total por seleção negativa.
Ficoll-Paque® PLUSGE Healthcare - Ciências da Vida17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNATecnologias integradas de DNA1072532TracrRNA que contém modificações químicas proprietárias que conferem maior resistência à nuclease. Hibridiza em crRNA para ativar a enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNAde DNA integradasProduzido sinteticamente como Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, baseado na sequência de gRNA projetado visando o gene de intrest
Alt-R® Kit de Detecção de Edição de GenomaTecnologias de DNA Integradas1075931Cada kit contém endonuclease T7EI, tampão de reação T7EI e controles de ensaio T7EI.
Platina® Taq DNA Polimerase Alta FidelidadeInvitrogen11304-011
4D-Nucleofector™ SistemaLonzaAAF-1002B
Proteína IL-2 recombinante humanaNovartis65483-0116-07
P3 Célula Primária 4D-Nucleofector™ Kit XLonzaV4XP-3032Contém pmaxGFP™ Vetor Nucleofector™ Solução, Suplemento, 16-well Nucleocuvette™ Tiras
Não-alvo: SiRNA personalizado, Padrão 0.05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1074181Cas9 Nuclease
DNeasy® Sangue & Manual de TecidosQiagen69504
RNeasy Mini KitQiagen74104
Calcein AMThermoFisherC3099
TGFβBiolegend580706
Alt-R® Kit de controle CRISPR-Cas9,tecnologias de DNA integradohumano 1072554Inclui tracrRNA, crRNA de controle positivo HPRT, crRNA de controle negativo # 1, HPRT Primer Mix e tampão duplex livre de nuclease.
IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)Integrated DNA Technologies11-01-02-02
Alt-R® Tecnologias integradas de DNA do intensificador de eletroporação Cas91075915intensificador de eletroporação Cas9
Tecnologias

Referências

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