Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).

Resumo

CRISPR/Cas9 tecnologia está acelerando a engenharia do genoma em muitos tipos de células, mas até agora, entrega do gene e modificação genética estável ter sido desafiador no primárias células NK. Por exemplo, entrega de transgene usando transdução Lentivirus ou retroviral resultou em um rendimento limitado de geneticamente modificadas as células NK devido a apoptose celular NK substancial procedimento associado. Descrevemos aqui um método livre de DNA para edição de genoma de células humanas primárias e expandidas NK usando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permitiu eficiente nocaute do TGFBR2 e HPRT1 de genes em células NK. Dados de RT-PCR mostram uma diminuição significativa no nível de expressão do gene, e um ensaio de citotoxicidade de um produto representativo da célula sugeriu que as células NK RNP-modificado tornou-se menos sensíveis a TGFβ. Células geneticamente modificadas podem ser expandido post-eletroporação por estimulação com mbIL21-expressando irradiado células do alimentador.

Introdução

Imunoterapia tem sido avançada nos últimos anos. As pilhas de T do receptor (carro) de antígeno quimérico geneticamente modificados são um excelente exemplo de células do sistema imunológico engenharia implantado com sucesso em imunoterapia. Estas células foram recentemente aprovadas pelo FDA para o tratamento contra CD19 + B de células malignas, mas sucesso até agora tem sido limitado a doenças tendo alguns antígenos targetable e direcionamento de tais repertórios antigênicos limitados é propenso ao fracasso pela fuga imune. Além disso, as células T de carro foi centraram-se sobre o uso de células autólogas T devido ao risco de enxerto versus doença-- host causada po....

Protocolo

Casacos de buffy de doadores saudáveis foram obtidos como fonte de materiais de Central Ohio região Cruz Vermelha americana. Esta pesquisa foi determinada como sendo pesquisa isenta por Review Board Nationwide Hospital infantil da institucional.

1. expansão e purificação de célula NK humana

1. Isole PBMCs do Buffy Coat¹².
   1. 35 mL de amostra de buffy coat em 15 mL de Ficoll-Paque de camada.
   2. Centrifugar a 400 x g por 20 minutos sem freio e coletar o PBMC através da interface.
   3. Lavar os PBMCs recuperados três vezes adicionando pelo menos um volume igual de PBS, centrifugação a 400 x g p....

Resultados

Eficiência de eletroporação

Para otimizar a eletroporação de Cas9/RNPs, testamos 16 programas diferentes com transdução de siRNA de direcionamento-GFP e plasmídeo de DNA em células NK. Ensaio de citometria de fluxo mostrou que o pt-138 teve a maior porcentagem de viabilidade e transdução eficiência da célula (35% GFP positivas células vivas) para ambas as partículas (Figura 1 e

Discussão

Modificação de dependente de DNA das células NK tem sido desafiador^4,9. Portanto, introduzimos diretamente um complexo ribonucleoprotein sinteticamente pré-formadas (RNPs) e proteína Cas9 como proteína purificada no de células NK primárias e expandida⁸. Este método permitiu-na eliminar tampando, seguindo, e outros processos transcricionais e translacionais começaram pela RNA polimerase II, que pode causar apoptose de células NK associados .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RosetteSep™ Coquetel de Enriquecimento de Células NK Humanas	STEMCELL Technologies	15065	A RosetaSep™ O coquetel de enriquecimento de células NK humanas foi projetado para isolar células NK do sangue total por seleção negativa.
Ficoll-Paque® PLUS	GE Healthcare - Ciências da Vida	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	Tecnologias integradas de DNA	1072532	TracrRNA que contém modificações químicas proprietárias que conferem maior resistência à nuclease. Hibridiza em crRNA para ativar a enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA		de DNA integradas	Produzido sinteticamente como Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, baseado na sequência de gRNA projetado visando o gene de intrest
Alt-R® Kit de Detecção de Edição de Genoma	Tecnologias de DNA Integradas	1075931	Cada kit contém endonuclease T7EI, tampão de reação T7EI e controles de ensaio T7EI.
Platina® Taq DNA Polimerase Alta Fidelidade	Invitrogen	11304-011
4D-Nucleofector™ Sistema	Lonza	AAF-1002B
Proteína IL-2 recombinante humana	Novartis	65483-0116-07
P3 Célula Primária 4D-Nucleofector™ Kit X	Lonza	V4XP-3032	Contém pmaxGFP™ Vetor Nucleofector™ Solução, Suplemento, 16-well Nucleocuvette™ Tiras
Não-alvo: SiRNA personalizado, Padrão 0.05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS	Integrated DNA Technologies	1074181	Cas9 Nuclease
DNeasy® Sangue & Manual de Tecidos	Qiagen	69504
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Calcein AM	ThermoFisher	C3099
TGFβ	Biolegend	580706
Alt-R® Kit de controle CRISPR-Cas9,	tecnologias de DNA integrado	humano 1072554	Inclui tracrRNA, crRNA de controle positivo HPRT, crRNA de controle negativo # 1, HPRT Primer Mix e tampão duplex livre de nuclease.
IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)	Integrated DNA Technologies	11-01-02-02
Alt-R® Tecnologias integradas de DNA do intensificador de eletroporação Cas9		1075915	intensificador de eletroporação Cas9

Tecnologias