Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar clusters de oxigênio de metal discretos, polioxometalatos (POMs), no limite de molécula única usando uma plataforma eletrônica baseada em nanoporos biológica. O método fornece uma aproximação complementar às ferramentas analíticas tradicionais da química usadas no estudo destas moléculas.
Abstract
As moléculas individuais podem ser detectadas e caracterizadas medindo o grau pelo qual reduzem a corrente iónica que flui através de um único poro da nanômetro-escala. O sinal é característico das propriedades físico-químicas da molécula e suas interações com os poros. Nós demonstramos que o nanoporo dado forma pelo Staphylococcus da exotoxina da proteína bacteriana aureus alfa hemolisina (αhl) pode detectar polyoxometalates (poms, grupos aniônicos do oxigênio do metal), no único limite da molécula. Além disso, os produtos múltiplos da degradação do ácido POM de 12 phosphotungstic (PTA, H3picowatt12O40) na solução são medidos simultaneamente. A única sensibilidade da molécula do método do nanoporo permite que os poms sejam caracterizados em concentrações significativamente mais baixas do que exigidas para a espectroscopia da ressonância magnética nuclear (RMN). Esta técnica poderia servir como uma ferramenta nova para que os químicos estudem as propriedades moleculars dos polyoxometalates ou dos outros conjuntos metálicos, para compreender melhor processos sintéticos de POM, e para melhorar possivelmente seu rendimento. Hipoteticamente, a localização de um determinado átomo, ou a rotação de um fragmento na molécula, e o estado de oxidação do metal poderiam ser investigados com este método. Além disso, esta nova técnica tem a vantagem de permitir o monitoramento em tempo real de moléculas em solução.
Introduction
A detecção de analitos biomoleculares no nível da molécula única pode ser realizada usando nanoporos e medindo modulações de corrente iónica. Tipicamente, os nanoporos são divididos em duas categorias com base na sua fabricação: biológica (automontada a partir de proteínas ou DNA origami)1,2,3, ou Solid-State (por exemplo, fabricado com ferramentas de processamento de semicondutores)4,5. Enquanto os nanoporos de estado sólido foram sugeridos como potencialmente mais robustos fisicamente e podem ser usados em uma ampla gama de condições de solução, os nanoporos proteicos até agora oferecem maior sensibilidade, mais resistência a incrustantes, maior largura de banda, melhor produto químico selectividade, e uma maior relação sinal/ruído.
Uma variedade de canais de íons proteicos, como o formado por Staphylococcus aureus α-hemolisina (αhl), pode ser usado para detectar moléculas únicas, incluindo íons (por exemplo, H+ e D+)2,3,polinucleotídeos (DNA e RNA)6,7,8, DNA danificado9, polipeptídeos10, proteínas (dobradas e desdobradas)11, polímeros (polietileno glicol e outros)12,13 , 14, nanopartículas de ouro15,16,17,18,19, e outras moléculas sintéticas20.
Nós demonstramos recentemente que o nanoporo do αhl pode igualmente facilmente detectar e caracterizar aglomerados metálicos, polyoxometalates (poms), a nível da única molécula. Poms são discretos nanoescala metal aniônico clusters de oxigênio que foram descobertos em 182621, e desde então, muitos outros tipos foram sintetizados. Os tamanhos diferentes, as estruturas, e as composições elementares dos polyoxometalates que estão agora disponíveis conduziram a uma escala larga das propriedades e das aplicações que incluem a química22,23, catálise24, ciência material25 ,26, e pesquisa biomédica27,28,29.
A síntese de POM é um processo de automontagem tipicamente realizado em água misturando as quantidades estequiometricamente exigidas de sais de metal monoméricos. Uma vez formados, os POMs exibem uma grande diversidade de tamanhos e formas. Por exemplo, a estrutura do polyanion de Keggin, XM12O40q- é compor de um heteroátomo (X) cercado por quatro oxigênios para dar forma a um tetraedro (q é a carga). O heteroátomo está centralmente localizado dentro de uma gaiola formada por 12 octaédricos MO6 unidades (onde M = metais de transição em seu estado de alta oxidação), que estão ligados uns aos outros pelos vizinhos átomos de oxigênio compartilhado. Quando a estrutura dos polyoxometalates do tungstênio for estável em circunstâncias ácidas, os íons do hidróxido conduzem ao clivagem hidrolítica de ligações do metal-oxigênio (M-O)30. Este processo complexo resulta na perda de uma ou mais subunidades octaédrica do MO6 , levando à formação de espécies monovacantes e trivagas e, eventualmente, à completa decomposição dos poms. Nossa discussão aqui será limitada aos produtos parciais da decomposição do ácido 12 phosphotungstic em pH 5,5 e em 7,5.
O objetivo deste protocolo é detectar clusters de oxigênio de metal discretos no limite da molécula única usando uma plataforma eletrônica baseada em nanoporos biológica. Este método permite a detecção de aglomerados metálicos em solução. Várias espécies em solução podem ser discriminadas com maior sensibilidade do que os métodos analíticos convencionais33. Com ele, as diferenças sutis na estrutura de POM podem ser elucidadas, e em concentrações marcadamente mais baixas do que aquelas exigidas para a espectroscopia de RMN. É importante ressaltar que essa abordagem permite até mesmo a discriminação de formas isoméricas de na8HPW9O341.
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Protocol
Nota: O protocolo abaixo é específico para o sistema de DC de Nanopatch eletrônico BioSciences (EBS). Entretanto, pode prontamente ser adaptado ao outro instrumento da electrofisiologia usado para medir a corrente através das membranas planas do BICAMADA do lipido (câmara padrão da membrana do BICAMADA do lipido, geometria do U-tubo, microcapillaries puxado, etc.). A identificação dos materiais comerciais e suas fontes é dada para descrever os resultados experimentais. Em nenhum caso essa identificação implica recomendação do Instituto Nacional de normas e tecnologia, nem implica que os materiais são os melhores disponíveis.
1. preparação da solução e do analyte
- Prepare todas as soluções de eletrólitos com água de 18 MΩ-cm de um sistema de purificação de água tipo 1 para remover espécies orgânicas de traço e depois filtre todas as soluções eletrolíticas através de um filtro de vácuo de 0,22 μm imediatamente antes das gravações de canal iônico
Nota: A qualidade da água é um fator crítico para a estabilidade e longevidade do sistema de nanoporos de membrana. - Tipo selvagem αHL.
- Siga as precauções de MSDS ao manusear a proteína de toxina αHL.
- Misture o tipo selvagem liofilizado monomérico S. aureus α-hemolysin (αhl) em pó com 18 MΩ-cm de água a 1 mg/ml. Distribuir 10 a 30 μL de alíquotas da amostra em tubos de centrifugação Cryo-safe, piscar rapidamente o congelamento em nitrogênio líquido e, em seguida, armazenar a-80 ° c. Alternativamente, use purificada pré-formada heptamérica αHL31.
- Dissolver o lipídio 1,2-Diphytanoyl-SN-Glycero-3-fosfocolina (DPhyPC) para 0,2 mg/mL em n-decano em um frasco de 4 ml de cintilação de vidro com um tampão revestido de politetrafluoroethyleneeflon. Armazene a solução a 4 ° c para uso repetido por até um mês.
- Prepare soluções de ácido fosfotúngstico.
- Siga as precauções de MSDS ao manusear o pó de ácido fosfotúngstico e prepare uma solução de ácido fosfotúngstico de 2 mM dissolvendo 57,6 mg de H3PW12O40 em 10 ml de um NaCl de 1 M e 10 mm NaH2po4 solução, que constitui a solução de ações.
- Tome 5 mL desta solução e ajuste o pH para 5,5 com NaOH de 3 M. Ajuste o pH dos outros 5 mL da solução de stock para 7,5 com NaOH de 3 M.
Nota: Em pH 5,5, o ácido 12-phosphotungstic (PTA, H3picowatt12O40) decompõe primeiramente no Anion monovacant [picowatt11O39]7-.
2. conjunto de células de teste
- Monte a célula de teste de acordo com as instruções do fabricante.
- Mergulhe um fio Ag/AgCl em lixívia (hipoclorito de sódio) por 10 minutos após raspa-lo com 600 lixa de grão. Posicione o eletrodo dentro da membrana de nanoporos de quartzo (QNM).
- Coloc um elétrodo cilíndrico da pelota de AgCl encaixado em um fio de prata fora do QNM.
- Uma vez que a célula de teste é configurada, ative a fonte de alimentação e o programa de aquisição de dados. Assegure-se de que a leitura atual DC seja 0 pA na ausência de solução na célula de teste.
- Use uma seringa conectada à célula de teste através de uma linha de fluido para adicionar solução de eletrólitos tamponada acima da face do qnm e para garantir que a corrente iónica Satula o amplificador. Se não, o QNM pode ser obstruído. Aplique uma tensão pop (± 1 V) e/ou uma pressão superior a 300 mm Hg para a limpar. Se isso funcionar, reduza a tensão e a pressão.
3. formação de bilayer lipídico
- Preencha a solução na célula de teste para que o nível da solução esteja bem acima da face do QNM. Em seguida, abaixe o nível da solução via seringa para abaixo da face, de tal forma que a corrente diminua para zero.
- Mergulhe uma ponta de pipeta de 10 μL no frasco lipídico. Empurre na extremidade traseira da ponta da pipeta e bata-a no lado do frasco para remover todo o lipido visível.
- Toque na ponta da pipeta na interface ar-água da solução na célula de teste quando o nível da solução estiver acima da face do QNM e aguarde de dois a cinco minutos para que o lipídio se espalhe uniformemente.
- Abaixe lentamente o nível da solução abaixo da cara do qnm até que a corrente saturates, e então levante lentamente o nível da solução após a cara do qnm para dar forma a uma membrana do BICAMADA do lipido.
- Uma vez que um BICAMADA parece formar-se (isto é, quando a corrente vai a zero), tente estalá-la diversas vezes aumentando a pressão e assegure-se de que o qnm não esteja obstruído. Para reformar a membrana de BICAMADA lipídico, abaixe o nível de solução abaixo da face do qnm e levante-o lentamente.
- Se a membrana de BICAMADA lipídico não se formar pela primeira vez, abaixe a solução abaixo da face e levante-a novamente. Se não se formar após 3 ensaios, adicione mais lipídios conforme descrito em 3,2 e 3,3.
- Depois de formar uma membrana, defina o deslocamento atual para zero quando o potencial aplicado é zero.
4. αHL formação de poros
- Adicionar 2,5 ng de amostra de proteína heptamérica de αHL pré-formada purificada (ou 250 ng de αhl monomérica) para a célula de teste (volume ≈ 200 μL) para permitir a formação de canais.
- Aumente a pressão sobre a BICAMADA com uma seringa estanque (Figura 1) após a formação de uma BICAMADA, para expandir a membrana do qnm e facilitar a inserção de nanoporos. Aumente a pressão de volta aplicada tipicamente entre 40 a 200 mmHg, dependendo de cada QNM.
Nota: O software EBS tem um recurso de inserção automatizada que aplica um viés maior (tipicamente 200 a 400 mV) para induzir a formação de poros e, em seguida, reduz automaticamente a tensão desejada para o viés de medição, uma vez que um único canal se forma. - Após uma forma de nanoporos, reduza a pressão de volta para cerca de 1 ⁄ 2 da pressão de inserção. Se forem observados vários canais, remova-os reduzindo significativamente a pressão.
5. cluster metálico particionamento no Nanopore
- Para compensar os desequilíbrios dos eléctrodos, defina a tensão de deslocamento DC de tal forma que, quando o potencial aplicado for definido para zero, não exista corrente medida.
- Antes de adicionar a amostra de POM, realize um experimento de controle para garantir que não haja contaminantes (por exemplo, poms de rastreamento de um experimento anterior) no reservatório. Especificamente, adquira um traço de corrente iónica um potencial aplicado de + 120 mV para-120 mV na ausência de quaisquer POMs para verificar se não há bloqueios de corrente espontânea estão presentes.
Nota: Devido à estrutura assimétrica do canal αHL (Figura 1), a magnitude da corrente iónica será diferente para os potenciais aplicados positivos e negativos. A relação da corrente medida acima desta tensão aplicada é indicativa da orientação da αHL nanoporo na membrana. - Adicione a amostra de POM liberando o reservatório com a solução metálica do conjunto na concentração de 1 a 5 milímetros. Alternativamente, carregue a amostra no capilar antes do conjunto da célula para estudar o particionamento de POMs na outra extremidade do canal αHL.
- Registre a corrente iónica usando o software do fabricante para detectar bloqueios de corrente transitórios causados pelo particionamento de POMs individuais no nanopore. Estimar as propriedades físicas e químicas da molécula a partir da profundidade do bloqueio da corrente iónica, da frequência do evento e da distribuição do tempo de permanência dos bloqueios.
6. gravações de canal iônico e análise de dados
- Adquira as medições da série temporal de corrente iónica usando um amplificador de alta impedância, baixo ruído e sistema de aquisição de dados. Realize as medições em uma tensão aplicada de-120 mV (em relação ao lado do canal cis ) para cada pH.
- Aplique um filtro Bessel de 8 pólos de passagem baixa 100 kHz ao sinal, que é posteriormente digitalizado em 500 kHz (i.e., 2 MS/ponto). Extraia eventos da série temporal e analise eventos usando o algoritmo Adept no pacote de software Mosaic 32,33.
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Representative Results
Ao longo das últimas duas décadas, os poros da nanômetro-escala de proteínas ligadas à membrana foram demonstrados como sensores versáteis de molécula única. As medições baseadas em nanopore são relativamente simples de executar. Duas câmaras enchidas com a solução do eletrólito são separadas por um nanoporo encaixado em uma membrana eletricamente isolante do lipido. Ou um amplificador da remendo-braçadeira ou uma fonte de alimentação externa fornecem um potencial eletrostático através do nanoporo através dos elétrodos Ag/AgCl imersos nos reservatórios do eletrólito. O campo elétrico conduz as partículas carregadas individuais no pore, que produz reduções transientes na corrente iónica que dependem do tamanho, da forma, e da carga das partículas. Um programa de computador controla a tensão aplicada e monitora, em tempo real, os bloqueios de corrente iónica causados por moléculas reversivelmente particionamento para o poro. A corrente é amplificada e convertida em tensão com um transistor de efeito de campo de baixo ruído e alta impedância e digitalizada usando um cartão de aquisição de dados.
Aqui, nós fornecemos um procedimento geral para detectar polyoxometalates com um nanopore biológico. Como visto na Figura 2, antes da adição de poms o canal desobstruído tem uma corrente média de canal aberto de ~ 100 PA em um potencial aplicado de-120 MV. A adição de POMs produz bloqueios transitórios e diminui a corrente iónica em aproximadamente 80%. Como esperado, porque essas partículas são carregadas negativamente, os bloqueios não são observados quando a polaridade do potencial aplicado é revertida. Note que se os POMs não interagir com a parede de poros, eles iriam difundir através dos poros em cerca de 100 NS, que é muito breve para ser detectado com um amplificador de grampo de remendo convencional. Assim, na maioria das vezes uma determinada partícula gasta nos poros é uma consequência direta da interação entre a partícula e o poro. A duração de um evento de bloqueio de corrente iónica é definida como o tempo de permanência, Tau (τ).
Para ilustrar a utilidade deste método, discutimos o uso de um nanoporo de αhl para monitorar a decomposição de ácido 12-fosfotúngstico (PTA, H3PW12O40) em pH 5,5 e pH 7,5. Esta decomposição pode ser observada com medidas de RMN de 31P, mas a concentração necessária é de 2 mm, enquanto as medidas de nanoporos necessitam de menos de 30 μm, devido à sensibilidade da medição de nanoporos. Em pH 5,5, [PW11o39]7- é a espécie predominante30.
A análise dos dados é realizada calculando-se um histograma da relação profundidade de bloqueio relativa (i.e.,<i>/<io>, onde <i> é a corrente média com o POM no poro e <io > é a corrente média do canal aberto). O histograma dos índices médios de profundidade de bloqueio atual em-120 mV e pH 5,5 apresenta um pico menor em <i>/<io> ≈ 0, 6 e pico maior em < i >/<io> ≈ 0,16 (Figura 3 , verde). Assumimos que estes picos correspondem a [P2W5o23]6- e [PW11o39]7-, respectivamente, com base em 31p RMN. 31 de dezembro Estudos de P RMN sugerem que o aumento do pH altera a concentração relativa dessas duas espécies, e isso é suportado pela mudança na área dos dois picos mostrados na Figura 3.
Quando a solução de POM é titulada para pH 7,5 ex situ, a concentração total de POM diminui devido à degradação parcial das espécies de dois principais a sais inorgânicos (ou seja, fosfato livre,H xpo4−3 + x e tungstestado, wo42− iões). O histograma da relação de profundidade do bloqueio relativo também mostra dois picos principais (Figura 3, laranja), mas com 20 vezes menos eventos (o que sugere que a concentração total de POM em pH 7,5 é aproximadamente 20 vezes menor do que a pH 5,5, se o a eficiência de captura de nanoporos para POMs é a mesma nos dois valores de pH). É interessante notar que em pH 7,5 e maior, as espécies de POM observadas aqui não foram detectadas no espectro de RMN de 31P devido à sua baixa concentração causada por sua dissociação em íons fosfato e tungstestado.
O tempo de permanência de cada evento no poro é definido pela duração dos bloqueios de corrente iónica individuais. A distribuição dos tempos de permanência proporciona uma visão das diferentes espécies presentes. Mostrou-se anteriormente que, para os bloqueios causados por um polímero de tamanho diferente de poli (etileno glicol), a distribuição do tempo de permanência para cada dimensão do mesmo é bem descrita por um único exponencial. Esse resultado sugere que a interação desse polímero é uma reação química reversível simples12,13,20.
A Figura 4 ilustra que as distribuições de tempo de permanência para os dois picos foram bem diferenciadas em pH 5,5 e 7,5. Dois recursos são claros. Em primeiro lugar, em todas as condições, múltiplos exponenciais são necessários para caber cada uma das distribuições, o que sugere que há variações dos POMs dentro de cada espécie. Em segundo lugar, os tempos de permanência dos POMs nos poros são muito mais curtos no pH 7,5 em comparação com os de pH 5,5, o que sugere um enfraquecimento da interação entre os poros e os POMs. Mostrou-se previamente que uma mudança no pH altera o número relativo de cargas fixas dentro ou perto do lúmen da canaleta do HL do α. Essas alterações alterarão diretamente as interações com poms de particionamento dentro do poro e, portanto, modificarão seus tempos de residência34,35.
Figura 1: diagrama esquemático da configuração experimental. Método para a caracterização nanopore-baseada de moléculas individuais do Polioxometalato. Um nanoporo da proteína que se monta em uma membrana grossa do BICAMADA do lipido de 4 nanômetros é banhado por soluções aquosas do eletrólito em um capilar de vidro e em um reservatório maior. Uma pressão é aplicada ao capilar de vidro com uma seringa apertada do gás para ajudar à incorporação do nanoporo. Um V potencial é aplicado através da membrana com um par combinado de elétrodos de Ag/AgCl e conduz uma corrente iónica (por exemplo, na+ e CL-) através do pore. A corrente é convertida em tensão com um amplificador de alta impedância, digitalizada com um conversor analógico para digital (ADC) e armazenada em um computador. O software de computador controla o potencial aplicado através de um conversor digital para analógico (DAC) e monitora, em tempo real, os bloqueios de corrente transitória causados por moléculas únicas que se particionam no poro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: detecção baseada em nanoporos de meto-nanopartículas individuais. Uma ilustração de traços iônicos da série do tempo atual que ocorrem antes e depois da adição de uma solução de POM ao instrumento do nanoporo. O particionamento de POMs aniônicos individuais para o poro provoca reduções transitórias de corrente na corrente média dos poros abertos, <io>. (Direita) Um evento típico, ilustrando a corrente média do bloqueio (<i>) e o tempo de permanência (τ) da partícula no poro. O potencial aplicado foi de-120 mV, e as soluções continham 1 M NaCl, 10 mM NaH2po4 at pH 5,5. O compartimento cis também continha 30 μM de ácido 12-fosfotúngstico. A relação de profundidade atual do bloqueio (<i>/<io>) e os tempos de permanência (τ) fornecem informações sobre quais espécies de POM estão presentes na solução. as condições que usamos aqui, o canal αHL não portão (espontaneamente fechar) quando POMs não estão presentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: histogramas da relação de profundidade de bloqueio atual em pH 5,5 e 7,5. Histogramas da relação de profundidade de bloqueio da corrente iónica induzida por POM em pH 5,5 (verde) e 7,5 (laranja) com potencial aplicado V =-120 MV. Os dois picos presentes em cada valor de pH correspondem às espécies de POM predominantes conhecidas em solução nessas condições. As proporções atuais de profundidade de bloqueio de 0 e 1 correspondem a um poro totalmente bloqueado e aberto, respectivamente. Os histogramas foram criados com uma largura de escaninho de 0, 1 e normalizados para contagens/s dividindo-se pelo tempo de aquisição de dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: distribuição do tempo de permanência e montagem com vários exponenciais. A distribuição dos tempos de permanência para bloqueios de corrente induzida por POM causada pelas duas principais espécies (picos 1 e 2 na Figura 4) observada em pH 5,5 e 7,5 em um lote de semilog. Para ambas as espécies, os tempos de permanência são marcadamente mais curtos com o maior valor de pH, o que sugere a interação entre os poros e os POMs alterados. As linhas sólidas são ajustes de um modelo de mistura exponencial aos dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Devido a sua carga aniônicos, os poms associam provável com as cátions orgânicas do contador através das interações eletrostáticas. Portanto, é importante identificar as condições de solução adequadas e os ambientes de eletrólitos corretos (especialmente cátions em solução) para evitar a formação complexa com POMs. Um cuidado particular é exigido na escolha do amortecedor. Por exemplo, a taxa de captura de POMs com tris (hidroximetil) aminometano e soluções tamponadas com ácido cítrico é significativamente menor do que na solução tamponada de fosfato, provavelmente porque qualquer um dos dois primeiros buffers formam um complexo com o POM que não interagir fortemente com o nanopore. Além disso, o eletrólito NaCl foi propositadamente utilizado em vez de KCl (bem como os outros metais alcalinos) para evitar a precipitação de [PW11o39]7- por K+.
Crítico para a medição exata das distribuições de tempo de residência é a capacidade de medir a corrente em uma largura de banda suficientemente alta. Por exemplo, com tempos de permanência distribuídos exponencialmente, há muito mais bloqueios com tempos de permanência curtos e longos, e uma estimativa precisa das distribuições de tempo de permanência é melhor alcançada coletando uma grande quantidade de dados (ou seja, adquirindo-o em tão altamente quanto uma largura de banda a capacitância elétrica do sistema permite). Para atingir essa condição na espectroscopia de nanoporos, a capacitância do sistema (membrana e capacidade perdida) deve ser minimizada. A capacitância perdida é reduzida diminuindo o comprimento de todos os cabos de conexão e usando contatos elétricos da alta qualidade. A capacidade da membrana é minimizada diminuindo a área de superfície do bilayer, aumentando a espessura de materiais de apoio (isto é, quartzo, Polytetrafluoroethylene, etc.), e diminuindo a área de materiais de apoio expor ao eletrólito. Na prática, a capacitância perdida de um instrumento típico (≈ 2 pF) limitará o ruído para as membranas ≈ 1 mícron a 5 mícron de diâmetro. Isso constitui a limitação do método. Por exemplo, a detecção de pequenas e altamente carregadas moléculas únicas pode ser desafiador devido aos seus tempos de residência relativamente curtos.
O mecanismo pelo qual a pressão permite o controle da inserção do canal não é completamente compreendido. Os microcapilares de quartzo têm um diâmetro muito pequeno em que a membrana é formada. Aplicando pressão fará com que a membrana a protuberância (aumentando assim a área de superfície da membrana) e possivelmente diluir a membrana. Ambos os efeitos aumentariam a taxa em que os canais se formarão na membrana. Quando um único canal espontaneamente forma, reduzir a pressão para evitar a inserção de canais adicionais. A remoção de αhl não inserida da fase aquosa a granel não é necessária se a concentração de αHL for suficientemente baixa.
As estruturas e cargas de polioxometalatos são atualmente estudadas utilizando técnicas tradicionais de química analítica, incluindo RMN, espectroscopia ultravioleta-visível, infravermelho e Raman, espectrometria de massas e difração de raios-X. Esperamos que as medições de nanoporos complementem a caracterização dessas e outras propriedades físicas dos POMs, bem como o estudo de sua especiação em baixa concentração, o que ajudará a compreender melhor a via sintética dos polioxometalatos Formação. Também foi demonstrado anteriormente que o poro αHL pode até distinguir entre 2 isómeros do formulário de Keggin Trivago na8hpw9o3430.
Em resumo, mostramos que um nanoporo proteico ligado à membrana pode ser usado para detectar e caracterizar clusters metálicos de óxido de tungstênio (heteropolitungestados) em solução usando uma medição elétrica de alta resolução simples. A sensibilidade proporcionada por esta nova abordagem permite o rastreamento de diferenças sutis na estrutura de POM que surgem em diferentes valores de pH em concentrações que são substancialmente inferiores (> 70 vezes) do que o necessário para métodos tradicionais, como RMN Espectroscopia. Devido à única capacidade de detecção de moléculas de nanoporos, o limite real de detecção no método pode ser feito muito menor medindo a corrente por tempos mais longos (as escalas de taxa de captura em proporção à concentração de POM).
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio financeiro da Organização Europeia de biologia molecular para uma bolsa de pós-doutorado (a je) e uma subvenção da NIH NHGRI (a J.J.K.). Agradecemos a ajuda dos professores Jingyue Ju e Sergey Kalachikov (Universidade de Columbia) para fornecer αHL heptamérica, e para discussões inspiradoras com o Professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
References
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