Aqui, nós apresentamos um protocolo da mancha elástica para identificar fibras elásticas em tecidos pT3N0M0 do cancro gastric em seções formalin-fixadas, parafina-encaixadas. Subseqüentemente, nós descrevemos um método para determinar se as pilhas do tumor invadem além do lamina elástico.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Coloração elástica em lâminas de parafina-Embedded de pT3N0M0 tecido de câncer gástrico
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O lamina elástico, que é localizado geralmente na camada secundário-Mesothelial, adjacente às pilhas Mesothelial do peritônio, é anfifílico na coloração do hematoxilina e do eosina (H & e) mas pode ser visualizado com a mancha elástica. Um dos benefícios importantes da mancha elástica é que faz fácil determinar se as pilhas do tumor invadiram além do lamina elástico. Isto ajuda em examinar a extensão da invasão peritonealny da superfície, assim distinguindo os estágios de pT3 e de pT4 no cancro gastrintestinal. Neste estudo, nós apresentamos um protocolo para identificar fibras elásticas nas seções formalin-fixadas, parafina-encaixadas pT3N0M0 do tecido do cancro gastric. Nós preparamos seções de parafina de 5 μm fixadas em lâminas e, em seguida, todas as lâminas são desparaffinadas e rehidratados durante o procedimento de coloração. Posteriormente, todas as secções são oxidadas por permanganato de potássio, branqueada por ácido oxálico, manchada por coloração elástica, e contracorada por Van Gieson. Finalmente, examinamos o efeito da coloração; a lâmina elástica é manchada azul-preto e as fibras do colagénio são manchadas vermelhas, quando as pilhas cancerosas forem manchadas em máscaras de variação do amarelo. Também descrevemos detalhadamente os métodos utilizados para determinar a relação posicional entre as células cancerosas e a lâmina elástica. Este método é simples, de baixo custo, e amplamente aplicável na identificação da invasão de superfície peritoneal no cancro gastrintestinal por causa de sua seletividade proeminente para fibras elásticas e resultados autênticos.
Introdução
De acordo com o sistema de estadiamento do câncer de tumor, linfonodo e metástase (TNM), o prognóstico do câncer gástrico no estágio patológico pT4 é significativamente pior do que no pT3 (8º UICC/AJCC)1. Com o câncer gástrico, a classificação do tumor primário (pT) geralmente depende da profundidade da invasão tumoral2. O cancro gastric do pT3 do estágio patológico é definido como o cancro que invade através do própria dos muscularis em tecidos subserosal, visto que pT4 o cancro gastric é definido como o cancro que penetra à superfície do peritoneum visceral. A presença da invasividade da superfície peritoneal é a chave para distinguir os dois estágios2. No entanto, como a camada celular Mesothelial peritoneal é muito fina, pode ser danificada durante a cirurgia, o tratamento pós-operatório e a fixação3. Além disso, alterações inflamatórias relacionadas ao tumor e fibrose podem prejudicar a anatomia normal do peritônio, o que torna muito difícil julgar com precisão a invasão da superfície peritoneal usando apenas a coloração de H & E4. Os métodos auxiliares atuais do diagnóstico tais como a citologia e immunohistochemistry são do valor diagnóstico limitado5,6 porque são falso-positivos ou têm um baixo cost-efetividade.
A membrana serosal inclui o peritônio, a pleura e o pericárdio, e é composta pelo mesothelium, uma membrana basal e uma camada submesothelial7. Uma característica histológica comum da membrana serosal é a presença de uma lâmina elástica na camada submesotelial, adjacente às células mesotheliais8,9. O lamina elástico tem uma habilidade antiprejudicial forte e pode serir como um marcador prognóstico alternativo se as pilhas Mesothelial são destruídas pela inflamação ou pela fibrose tumor-relacionada severa3. A lâmina elástica compreende principalmente do elastina e do Microfibril10, que pode ser visualizado pela mancha elástica. A principal razão por trás do uso da coloração elástica é que a elastina forma uma ligação de hidrogênio com o grupo fenólico de resorcinol na solução de elastina, fazendo com que as fibras elásticas sejam manchadas de cor azul-preta. Após a coloração contrastante de Van Gieson (VG), as fibras colágenas podem ser manchadas de vermelho e as fibras musculares e glóbulos vermelhos podem ser manchadas de amarelo8,11,12,13.
A oitava edição do estadiamento TNM do câncer de pulmão define a invasão pleural visceral (T2) como uma invasão tumoral além da lâmina elástica ou uma invasão na superfície da pleura visceral2. Estudos sobre o cancro colorretal demonstraram que a invasão da lâmina elástica no cancro colorretal pT3 pode ser a razão para prognoses pobres. A taxa de sobrevida total e livre de doença de 5 anos do câncer colorretal também foi comprovada como pT4a,13,14,15. Baseado em nossos estudos precedentes na mancha elástica, a invasão elástica do lamina foi encontrada para ter uma influência negativa significativa no prognóstico do cancro gastric de pT3 e deve ser tratada a mesma maneira que o cancro gastric pT4a12. Assim, este método simples e rentável pode ajudar a eliminar a incerteza nos resultados obtidos através da coloração de H & E, e outras limitações comuns associadas a outros métodos auxiliares de diagnóstico, incluindo citologia e imunoistoquímica, entre Outros. Este método pode ser usado eficientemente para diagnosticar invasões de superfície peritonealny do cancro gastrintestinal, especial em alguns casos ambíguos. É conveniente desde que a mancha de H & e e outras manchas fazem geralmente difícil identificar tais invasões. Este método também garante uma confiabilidade dos resultados, uma vez que é muito seletivo, especialmente para fibras elásticas. Aqui, nós conduzimos a mancha elástica para determinar se as pilhas do tumor invadiram a lâmina elástica em pT3N0M0 o cancro gastric12.
Este método é usado para identificar fibras elásticas nos tecidos em formalin-fixo, seções parafina-encaixadas, e pode ser usado para seções congeladas também. Aqui, nós escolhemos seções parafina-encaixadas para a melhor manutenção da morfologia celular e do tecido. Todas as etapas deste protocolo acontecem à temperatura ambiente. Um kit de coloração comercial que inclui uma solução de permanganato de potássio, uma solução de ácido oxálico, uma solução de elastina e uma solução de Van Gieson é usada no estudo apresentado.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Entre 1994 e 2005, as amostras de pacientes foram selecionadas por dois patologistas gastrintestinais experientes no hospital de câncer afiliado da escola de medicina de Xiangya, Universidade Central do Sul, de doentes que sofreram gastrectomia de Neoplasias do estômago, com um diagnóstico patológico postoperative do cancro gastric no estágio de pT3N0M0 (de acordo com o sétimo estadiamento de TNM). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em revisão.
1. seccionamento
- Coloc o bloco da parafina em um suporte fixo do micrótomo do Sledge, que pode se mover para trás e para a frente através da lâmina. Ajuste o ângulo ideal entre o bloco e a faca do micrótomo.
Nota: o ângulo ideal não depende apenas da geometria da lâmina, mas também da velocidade e da técnica de corte. - Aparar o bloco de parafina conforme necessário e cortá-lo em secções transversais de 5 μm de espessura.
- Coloc as seções da parafina 5-μm em um banho de água em aproximadamente 40-45 ° c e monte-a, subseqüentemente, da água na corrediça de vidro, uma seção por a corrediça.
- Pressione a seção montada com cuidado contra uma toalha de papel para remover qualquer água residual e potenciais bolhas de ar.
- Permitir que as secções para secar ao ar por 30 min e, em seguida, assar-los em um forno a 45-50 ° c para 2 h.
2. desparaffinização e reidratação de todas as lâminas
- Mergulhe as lâminas em xileno em um frasco de Coplin por 10 min.
- Tire os slides do primeiro frasco de xileno e mergulhe-os em xileno em outro frasco por 10 min.
- Agora, mergulhe os slides em 100% de etanol em um frasco de Coplin por 5 min.
- Mergulhe as lâminas em 100% de etanol em outro frasco de Coplin, também por 5 min.
- Mergulhe as lâminas em 95% de etanol em um frasco de Coplin por 2 min.
- Mergulhe as lâminas em 70% de etanol em um frasco de Coplin por 2 min.
Observação: Certifique-se de que os slides estão completamente imersos nas soluções ao executar as etapas acima. - Enxague brevemente as lâminas com água destilada num novo jarro.
3. coloração
- Antes de prosseguir para a coloração, limpe fora de todas as soluções excedentes em torno do tecido na corrediça com um papel de tecido.
- Coloc as corrediças a temperatura do inroom e as condições da umidade da sala para evitar a secagem do tecido na corrediça durante todo o processo de coloração inteiro.
- Oxidize as lâminas com algumas gotas de permanganato de potássio por 5 min. Assegure-se de que o volume de permanganato de potássio seja suficiente para cobrir a seção de tecido em cada slide.
- Enxágüe as lâminas oxidadas com água destilada em um frasco de Coplin com 2-3 mudanças. Observe a cor azul do tecido.
- Agora, Bleach estes slides, adicionando algumas gotas de ácido oxálico por 5 min. Assegure-se de que o volume de ácido oxálico é suficiente para cobrir completamente a seção de tecido em cada slide.
- Enxague as lâminas mergultando-as no frasco de Coplin preenchido com água destilada. Realize o enxágüe 2x-3x.
- Agora, lave estes slides brevemente em 95% de álcool e, em seguida, mergulhe as lâminas em uma solução de elastina (5 g/L) para 8-24 h.
Nota: a solução de elastina é volátil, e seu tempo de coloração é relativamente longo, por isso é melhor mergulhar as lâminas com coloração elástica em um recipiente selado, como uma garrafa de vidro transparente com uma tampa de vedação. A capacidade do recipiente e o volume da solução de elastina dependem do número de lâminas imersas, desde que possibilitem a imersão completa de todas as lâminas. - Mergulhe esses slides diretamente no etanol 95% por 1-2 min para diferenciar bem cada seção de tecido.
Nota: a diferenciação refere-se à mudança na carga da seção de tecido, que remove o excesso de coloração absorvida pelo tecido e torna as cores mais claras. Após a coloração da solução de elastina, as amostras não devem ser lavadas com água destilada para evitar qualquer dificuldade de diferenciação. Verifique microscopically, conforme necessário, para coloração azul-preta das fibras elásticas e fundo cinzento. É melhor para ligeiramente underdiferenciar o tecido desde a subsequente contratura de Van Gieson também pode extrair um pouco a mancha elástica. - Enxágüe inteiramente estas corrediças com água destilada após a diferenciação.
- Contratura os slides em uma solução de Van Gieson por 1 min.
Nota: o volume da solução de Van Gieson precisa ser suficiente para ser capaz de mergulhar a seção de tecido em cada slide completamente. - Rapidamente gota 95% etanol sobre estas fatias por alguns segundos para diferenciar cada seção de tecido bem.
Nota: Não enxague as lâminas com água após a contrcoloração de Van Gieson, pois isso pode enfraquecer ou até mesmo eluir a cor da contrcoloração de Van Gieson.
4. desidratação e montagem
- Mergulhe as lâminas em álcool 95% por 5 min para deixá-los desidratar rapidamente.
- Continue a desidratar estas fatias por 2 alterações de 100% de álcool, cada vez que mergulhe os slides por 5 min.
- Mergulhe as lâminas em 2 alterações de xileno, cada vez por 3 min.
- Adicione uma gota de meio de montagem resinoso ao slide e coloque a lamínula na parte superior.
5. observação microscópica das lâminas
- Encontre o sentido serosal e observe os resultados da mancha elástica: as fibras elásticas (lamina) são manchadas azul-pretas, as fibras do colagénio são manchadas vermelhas, e as fibras de músculo são manchadas amarelas.
- Procure as células cancerosas em todo o slide: as células cancerosas são manchadas amarelo12.
- Determine a relação posicional entre as células cancerosas e a lâmina elástica.
Nota: haverá duas situações aqui. Contanto que haja uma pilha do tumor que invadisse além do lamina elástico na corrediça inteira, a seguir este caso poderia ser considerado como a invasão elástica do lamina. De um lado, somente quando não há nenhuma pilha do tumor que invadiu além do lamina elástico na corrediça inteira, este caso poderia ser considerado como a não-invasão elástica do lamina.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Uma coloração elástica bem sucedida revela claramente A lâmina elástica e as células cancerosas em pT3 cancro gástrico. Figura 1 -campo de baixa potência, verificado microscopicamente após coloração da solução de elastina, antes da contratura de Van Gieson de acordo com o protocolo mencionado-mostra que a lâmina elástica está próxima das células mesotheliais serosais e é manchada de cor azul-preta na forma de filamentos, e ainda há uma certa distância entre a...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este método proposto fornece uma abordagem precisa para identificar a lâmina elástica subserosal. O método pode ser usado para avaliar se as células tumorais invadiram a lâmina elástica em pT3N0M0 câncer gástrico12. O lamina elástico é avermelhado em seções H & e-manchadas, que não poderiam facilmente ser distinguidos das fibras do colagénio, e outros métodos auxiliares existentes do diagnóstico, tais como a citologia e Immunohistochemistry, igualmente exercida o valor diagnóstico limitado. O acha...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio em parte da Fundação Nacional de ciências naturais (NO. 81401902 e NO. 81501992) e da Fundação de ciência natural de Hunan (NO. 2017SK2134, NO. 2018JJ2238). O manuscrito foi escrito por Guang lei. Todo o experimento é realizado por Guang lei e Haiyan Yang. Os autores agradecem a assistência de patologistas e de companheiros que acompanham os dados dos pacientes.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de coloração Elastin-Van Gieson | Baso | BA4083B | Usado para coloração de fibras elásticas, fibras de colágeno e miofibras |
| Meio de Montagem Permount TM | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Usado para montagem |
| de Etanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xileno | LMAI Bio |
Referências
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179(2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. Mills, S. E. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin--a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert's resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
