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Artigo de método

Antigênicos lipossomas para a geração de anticorpos específicos de doença

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DOI:

10.3791/58285

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25 de outubro de 2018

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1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrito, é a preparação de nanopartículas lipossomas antigênicas e seu uso em estimulando células B ativação in vitro e em vivo. Respostas consistentes e robustas anticorpo levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de alergia ao amendoim. O protocolo para a geração de lipossomas antigênicos pode ser estendido para antígenos diferentes e modelos de imunização.

Resumo

Respostas de anticorpos fornecer imunidade protetora crítica para uma grande variedade de agentes patogénicos. Ainda há um grande interesse na geração de anticorpos robustos para a vacinação, bem como entender como patogênico anticorpo respostas desenvolvem alergias e doenças auto-imunes. Gerar respostas robusto anticorpos antígeno-específicos não é sempre trivial. Em modelos do rato, muitas vezes requer várias rodadas de vacinas com adjuvante que leva a uma grande variabilidade nos níveis de anticorpos induzidos. Um exemplo é em modelos do rato de alergias do amendoim onde modelos mais robustos e reprodutíveis que minimizam o rato números e o uso de adjuvantes seria benéficos. Apresentado aqui é um modelo de mouse altamente reprodutível de anafilaxia alergia ao amendoim. Esse novo modelo baseia-se em dois fatores principais: (1) antígeno-específicas splenocytes enviaram são transferidos de um rato de amendoim-sensibilizados para um rato de destinatário ingênuo, normalizando o número de memória antígeno-específicas e T-células B através de um grande número de ratos; e (2) destinatários ratos são posteriormente impulsionou com um forte immunogen multivalentes na forma de nanopartículas lipossomas exibindo o alérgeno amendoim principal (Ara h 2). A grande vantagem deste modelo é sua reprodutibilidade, que em última análise, reduz o número de animais utilizados em cada estudo, minimizando o número de animais recebendo injeções múltiplas de adjuvante. A montagem modular destes lipossomas imunogênicas fornece adaptabilidade facile relativamente a outros modelos alérgicas ou auto-imune que envolvem anticorpos patogênicos.

Introdução

Alergia alimentar afeta 8% das crianças nos Estados Unidos e tem aumentado em prevalência nos últimos década1. Alergia a amendoim afeta 1% das crianças e não é tipicamente Superdimensonada2. Embora vários ensaios clínicos promissores estão em andamento para o tratamento de alergias alimentares, incluindo imunoterapia oral (OIT), imunoterapia sublingual (fenda) e imunoterapia epicutâneos (EPIT), existem actualmente sem estratégias de tratamento aprovado pela FDA para a dessensibilização alérgica a amendoim indivíduos3,4,5,6,7,8. Portanto, indivíduos alérgicos estritamente devem evitar alérgenos para evitar a anafilaxia. Muitas questões permanecem sobre rotas de sensibilização e subjacente mecanismos de desenvolvimento de alergia alimentar.

Modelos de mouse são uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos da alergia, bem como desenvolver novo tolerogenic e dessensibilização terapias9,10,11,12. Isto é especialmente verdadeiro porque o principal alérgeno de amendoim (Ara h 2; Ah2) em humanos é também o alérgeno dominante em vários descrito rato modelos13,14. Enquanto modelos de rato de alergia são inestimáveis no estudo de mecanismos de sensibilização e tolerância, uma desvantagem é que pode ser variável e requerem o uso de adjuvantes. Imunogenos mais potentes seria uma maneira de minimizar a variabilidade intrínseca de tais modelos. Uma vez que as células B são fortemente ativadas por antígenos multivalentes, lipossomas antigênicos exibindo o alérgeno são uma boa opção, devido à sua capacidade de potencialmente ativar as células B através do receptor de células B (BCR), enquanto também ter a propriedade de forma eficiente escorva do compartimento de células T através de ser usada por não-especificamente apresentadoras células.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para antígenos da proteína de nanopartículas lipossomas usando uma estratégia fácil e modular de conjugação. Usando um antígeno substituto, fragmento Fab anti-IgM, demonstramos como potente tais lipossomas antigênicos podem ser na ativação de células B estimulante. Antigênicos lipossomas exibindo Ah2 antígeno foram usados para desenvolver um novo modelo de rato de sensibilidade conferida. Neste modelo, splenocytes de verificadas amendoim ratos alérgicos, contendo memória de amendoim específicas células B e T, são transferidos para o ingênuo congenic ratos. Respostas de anticorpos de memória são induzidas pela injeção de lipossomas conjugados com Ah2 em ratos os destinatários, a fim de induzir anticorpos contra Ah2. Seguido por apenas um impulso com Ah2 solúvel, anticorpos específicos Ah2 dão origem a uma forte reação anafilática quando estes ratos posteriormente são desafiados com Ah2. Como ratos submetidos a reação alérgica respondem de uma forma altamente uniforme e não tem recebido um adjuvante, esta abordagem é um modelo desejável de alergia e os resultados sugerem que pode ter utilidade em outros modelos de rato conduzidos por antígenos dirigidos a alérgenos e possivelmente auto-antigénios.

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Protocolo

O método geral de acoplamento proteína lipídios e incorporação em lipossomas é amplamente baseado em anterior trabalho15. Todos os procedimentos de animais descritos abaixo foram aprovados pela Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC). Todos os ratos usados no modelo de alergia são fêmeas BALB/cJ compradas em 3 semanas de idade. A Universidade de Alberta cuidados com animais e usar Comité (ACUC) aprovou experimentos envolvendo o uso de spleens do rato para análise ex vivo de camundongos C57Bl/6 pelo menos 6 semanas de idade.

1. a conjugação do antígeno de proteína para peguilado lipídico

  1. Adicione 3 g de grânulos do gel de dextrano reticulado com uma gama de fracionamento de 1.500 – 30.000 Daltons (Da) para um balão de vácuo de 250 mL. Adicione 60 mL de salina tamponada fosfato (PBS) e mexa continuamente com uma barra de agitação magnética. Feche o frasco e anexar a um vácuo para iniciar a desgaseificação em uma placa de agitação por um período mínimo de 1 h.
  2. Em uma coluna de cromatografia de vidro 1,0 cm x 30 cm com a rolha de volume de negócios fechada, adicione PBS para a coluna para lavar. Abra a tampa do volume de negócios e drenar a coluna. Lavagem, a seguir adicione o chorume de grânulos de intoxicar à coluna. Adicione continuamente o slurry até que a coluna está cheia de aproximadamente 24 cm altura do grânulo.
  3. Uma vez que a coluna tem uma 'cabeça' de aproximadamente 4 a 5 cm de PBS acima os grânulos embalados, tem as seguintes etapas prontas.
    1. Crie um sifão de fluxo de gravidade medindo um pedaço de tubo de tempo suficiente para chegar a uma prateleira 1 – 2 pés acima da parte superior da coluna e criar um loop que cai na parte inferior da coluna e retorna para o topo da coluna. Adicione uma rolha de volume de negócios de uma das extremidades do tubo, deixando um lado do tubo aberto. Coloque a extremidade aberta do tubo em uma garrafa de 500 mL de PBS e coloque na prateleira acima da coluna.
    2. Pegue a extremidade com o bujão do volume de negócios e anexar uma seringa de 10 mL. Abra a válvula de rolha de volume de negócios na linha de tubos e desenhar PBS através do tubo. Uma vez que o PBS alcançou três quartos do caminho através da tubulação, rapidamente, retire a seringa e adicionar o bujão do volume de negócios na parte superior da coluna — líquido deve estar em execução para a coluna.
      Nota: A quantidade de 'cabeça' de PBS deixada no topo da coluna deve ser entre 1 e 3 cm. A quantidade mínima para lavar a coluna é 3 volumes de coluna.
  4. Determine a quantidade de proteína (moles) ser ligada à lipídios com base em seu peso molecular (MW).
    Nota: O fragmento Fab de anti-rato de cabra IgM (em si um IgG) é usado aqui como um antígeno substituto universal para estimulação policlonal de células B. Nesse sentido, o fragmento Fab de cabra IgG tem um MW de aproximadamente 48 kiloDalton (kDa) e está disponível comercialmente em uma quantidade total de 1,3 mg. Assim, a quantidade de proteína a ser vinculado é 27,1 µmol.
  5. Determine o coeficiente de extinção da proteína de interesse. Se desconhecido, medir a absorvância de proteína em 280 nm, utilizando um espectrofotômetro e divide o valor pelo número de moles280 calculado na etapa 1.4.
    Nota: A extinção coeficiente de Fab de cabra IgG em 280 nm é 64.600 M-1.
  6. Para garantir esse rastreamento quantidades de amina, contendo tampão são removidos, do desalt a proteína na coluna criada nas etapas 1.1 – 1.3 e coletar frações proteicas em tubos de microcentrifuga de 1,5 mL (~ 500 µ l por fração).
    1. Feche a válvula de rolha de volume de negócios ligada à parte superior da coluna e remover o topo da coluna. Se não já abrir, abra a válvula de batente de volume na parte inferior da coluna e esperar até que a 'cabeça' de PBS atinge o topo dos grânulos.
    2. Adicione lentamente na proteína de interesse para o topo dos grânulos usando um copo pipeta Pasteur, tendo o cuidado de minimizar a perturbação ao topo dos grânulos.
    3. Uma vez que a 'cabeça' da solução da proteína alcançou o topo dos grânulos, adicionar 1 mL de PBS lentamente através de uma pipeta Pasteur. Repeti três vezes. Adicione PBS para criar uma cabeça de 4 a 5 cm e repita a etapa 1.3 para lavar a coluna.
      Nota: Esta etapa pode ser ignorada, se é certo que nenhum buffer contendo amina está presente.
  7. Determinar as frações que contêm a proteína medindo A280 valores e piscina as frações que dão cerca de 90% de recuperação da proteína.
    Nota: Isto tipicamente dilui a proteína 1,5-2-fold. Determine a concentração de proteína depois de pool. Concentre a proteína neste passo, se necessário, utilizar um concentrador de centrifugação.
  8. Adicione 2,5 equivalente molar da heterobifunctional agente reticulante à proteína.
    1. Primeiro, pesa cerca de 5 mg de grufo 3-(2-pyridyldithio) propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) em um tubo de microcentrifugadora. Para determinar o volume a dissolver o SPDP, tirar a concentração molar de proteína e multiplique-o por 250 x para gerar uma solução de 100 x que dará um 2,5 molar excesso na reação.
      Nota: por exemplo, se a concentração de proteína é de 50 µM, uma solução de SPDP em 12,5 milímetros é necessária. Para 5 mg de SPDP, isto corresponde a 1,27 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO).
  9. Adicione SPDP à proteína de interesse a uma diluição de 1: 100. Coloque a reação em um agitador oscilação na temperatura de quarto (RT) para cerca de 1 h.
  10. Para remover o excesso SPDP e proteger o bond(s) de bissulfeto endógena, na proteína na etapa subsequente redução, equilibrar e lavar a coluna criada em passos 1.1-1.3 em 100 mM acetato de sódio (NaOAc) pH de 5,5 ou criar uma coluna idêntica exclusivamente para uso no presente Reserva.
  11. Após incubação de 1 h com SPDP, do desalt a proteína na coluna 100mm NaOAc equilibrada. Efectuar este passo de forma idêntica como passo 1.6 Exceto usando 100 mM NaOAc (pH 5,5) como eluente. Recolher as frações, determinar a um280e as frações superiores da piscina. Lave a coluna em PBS.
  12. Preparar uma solução de 2,5 M de TDT (MW = 154 g/mol) em dobro destilada água (ddH2O). Adicione 25 mM DTT as frações em pool de proteínas por 5-10 min.
  13. Medir a um280 da proteína e dividir isto pelo coeficiente de extinção. Além disso, determine o A343. Calcule a relação de vinculação baseada a molaridade de proteína (280) e vinculador (343).
    Nota: Desligue o A340 autocalibração se usando um espectrofotômetro nanodrop. A medição de343 A representa a absorvância do grupo 2-thione piridina (coeficiente de extinção = 7550 M-1) que é retirado o cross-linker SPDP pela TDT. Uma relação molar de vinculador: proporção de proteína de 1,2 – 1,5 geralmente é conseguida ao realizar a reação com um 2,5 molar excesso de polícia em uma ampla gama de proteínas.
  14. Atropelar as frações em pool a coluna lavada em PBS, como descrito acima. Recolher as frações, determinar a um280e frações superiores da piscina. Determine a concentração de proteína por A280 depois pool as frações.
  15. Preparar DSPE-PEG (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Isto será adicionado à proteína em uma relação molar de 1:10. Prepare um estoque de 100 x de DSPE-PEG (2000)-Maleimide para obter a concentração desejada.
    1. Por exemplo, se a concentração de proteína é 10 µM após etapa 1.14, prepare um estoque de DSPE-PEG (2000)-Maleimide a 10 mM. Pesar cuidadosamente DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) e adicionar a quantidade apropriada de DMSO. Várias rodadas de suave num Vortex e sonicating podem obtê-lo totalmente dissolvido.
  16. Determinar o volume total das frações da etapa 1.14 e transferir a solução cuidadosamente em um pequeno (10-25 mL) redonda (RBF) do balão de fundo. Adicionar a quantidade apropriada de 100 x DSPE-PEG (2000)-Maleimide para a proteína para alcançar um 1x, 10 vezes concentração molar de excesso, final. Agite suavemente a solução para garantir que o DMSO é totalmente disperso.
  17. Execute a reação durante a noite sob nitrogênio em uma selada RBF. Use um septo de borracha e coloque em uma capa das emanações.
    1. Remova a atmosfera, perfurando o septo com uma agulha 20g anexada a uma seringa de 3 mL na extremidade de tubos ligados a um vácuo e ative a vácuo para 3-5 s.
    2. Substitua a atmosfera com nitrogênio. Encha um balão ligado a uma seringa de 3 mL, corte ao meio com azoto e anexar uma agulha 20g. Perfuração do septo para preencher a atmosfera dentro do balão de fundo redondo com nitrogênio. Repita a remoção da atmosfera e substituição com nitrogênio mais uma vez e deixar o balão de azoto ligado durante a noite.
  18. Prepare uma coluna de grânulo de gel de dextrano reticulado separado com uma gama de fracionamento de 4.000 – 150.000 em uma coluna de cromatografia de vidro 1,0 cm x 50 cm (de acordo com passos 1.1-1.3).
  19. No dia seguinte, retire o balão de fundo redondo preparado no passo 1.17 e gerência (siga o método usado na etapa 1.6) da proteína sobre a coluna de grânulo de gel reticulado dextran (da etapa 1.18).
    Nota: O montante total a carga na coluna deve ser não mais de 2 mL. Se utilizou-se uma reação maior, dividido em dois e executado em colunas separadas ou executar em uma coluna de diâmetro maior.
    1. Recolher as frações, determinar a um280, frações superior de piscina e determinar a concentração de proteína. A presença dos lipídios não afetará as medições.
  20. Armazene as frações em pool finais da proteína lipídios ligados a 4 ° C até que esteja pronto para uso.

2. em lipossomas preparação

  1. Pesar os lipídios: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; Colesterol (3b-hidroxi-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; e DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/Astyanax criar uma solução de 5 mg/mL de DSPC, 4 mg/mL solução de colesterol e 2 mg/mL de solução de DSPE-PEG(2000) em clorofórmio.
  2. Certifique-se de que a relação molar de lipídios nos lipossomas é: 57% DSPC, 38% de colesterol e 5% DSPE-PEG(2000), conforme representado na tabela 1.
    Nota: É importante controlar a quantidade de antígeno no lipossoma, que geralmente varia de 0,01 – 0,1%. Na tabela 1, 0,1% de anticabra rato, fragmento IgM Fab ligado à peguilado lipídica é usado. É fundamental ter em conta do 10 vezes molar excesso de DSPE-PEG (2000)-Maleimide que foi adicionado à proteína em passo 1.15, para garantir que a quantidade total de lipídios peguilado não exceda 5%.
  3. Considere os montantes finais lipídico (µmol) ao criar lipídios para extrusão. Consulte a tabela 1 para obter um exemplo de cálculo de concentrações de lipídios molar para a criação de lipossomas em uma concentração de lipídios totais 1,25 µM.
  4. Uma vez que foi calculada a quantidade correta de cada lipídio a serem adicionados juntos, combinam-se em um tubo de ensaio de vidro de borosilicato de 12 mL.
  5. Cuidadosamente explodir o clorofórmio.
    1. Use o tubo e uma seringa de 3 mL com agulha, preparada na etapa 1.17.1, que cuidadosamente explodir clorofórmio no tubo com nitrogênio. Soprar suavemente um fluxo de nitrogênio na solução enquanto girando o tubo com a outra mão. Tenha cuidado para minimizar os salpicos ou fazendo com que o líquido executar o caminho até o lado do tubo que seja mais difícil conseguir isso em solução na próxima etapa.
  6. Adicione 100 µ l de DMSO a cada tubo e lyophilize esta solução durante a noite. Cubra a parte superior do tubo com uma limpeza de laboratório não-estático, seguro com um elástico e congelar a-80 ° C.

3. lipossoma extrusão

  1. Adicione 1 mL de PBS contendo a proteína lipídios-ligada ao tubo de 12 mL contendo os lipídios. Proceda à sonicação a solução para cerca de 30 s a 1 min em um banho de água sonication. Descanse por 5 min ou mais entre cada rodada e repita 3 a 4 vezes.
  2. Prepare uma extrusora como indicado pelo fabricante.
    1. Adicionar o filtro oferece suporte para o suporte de membrana interna, coloque algumas gotas (10 µ l cada) de PBS na película de parafina. Usando uma pinça, pegue uma ponta do suporte do filtro e mergulhá-lo no drop-10 µ l.
    2. Coloca o filtro dentro do-Ring. Faça isso para ambos os lados. Usando uma pinça, pegue um filtro de 0,8 µm na borda e mergulhe no drop-10 µ l e revestimento exterior do-Ring com PBS. Coloque o filtro de 0,8 µm suavemente sobre o-ring para que o filtro faz não por pendurar o suporte de membrana interna.
  3. Coloque o bloco de aquecimento da extrusora em uma chapa quente para pré-aquecer a extrusora. Ligue a placa baixa e permitir que o bloco de aquecimento da extrusora chegar à temperatura desejada. Para evitar possíveis problemas com a agregação da proteína, não aqueça o bloco passado 37 ° C.
  4. Carrega a amostra lisada em uma das seringas de extrusão colocadas na extrusora. Coloque a seringa de extrusora na outra extremidade da extrusora. Certifique-se que o êmbolo da seringa vazia é definido como zero. A seringa vazia irá preencher como o lipídeo é extrudado através de membrana de policarbonato 0,8 µm. Tente evitar a passagem de bolhas e para trás através da membrana.
  5. Lugar da extrusora totalmente montada no bloco de aquecimento. Empurre suavemente o êmbolo da seringa preenchida com lipídios para a seringa vazia. Dependendo da concentração de lipídios, isso será difícil de ultrapassar. Repita 20 vezes.
  6. Retire o bloco de aquecimento da extrusora totalmente montada. Lentamente, remova a seringa da extrusora, certifique-se coletar qualquer lipídios que poderá vazar quando retirar. Coloque os lipossomas em um frasco limpo. Repita os passos usando o 3.4-3.6 policarbonato 0,2 µm e 0,1 µm de membranas.
  7. Crie uma coluna de grânulo de agarose reticulado de2 0,7 x 50 cm com intervalo de separação de 0.7-10 Mega Daltons (MDa) incubados em PBS. Adicione os lipossomas e executar etapa 1.6. Frações que contêm lipossomas serão diminuíram a transmissão da luz na faixa de 250 a 400 nm.
  8. Armazenar os lipossomas em 4 ° C e não congelar.

4. cálcio fluxo para monitorar a ativação de células B por lipossomas antigênicas

  1. Eutanásia em ratos por dióxido de carbono (CO2) ou overdose de isoflurano, de acordo com institucional de procedimentos operacionais padrão. Confirme a eutanásia de ratos por deslocamento cervical.
  2. Esterilize instrumentos cirúrgicos e carcaça de ratos usando etanol a 70%. Uso 10 cm de comprimento, dica de 0,8 mm, curvo fórceps de íris para separar a pele cobrindo a cavidade torácica da caixa torácica. Use 10 cm longo, reto dissecando a tesoura para fazer uma incisão distal com uma incisão bilateral.
  3. Use íris curva fórceps e a tesoura de dissecação para extrair o baço da cavidade abdominal. Remover tecido adiposo em torno de baço e coloque-o em um tubo cônico poliestireno 15ml, repleto de RPMI1640 médio com 1% bezerro fetal soro (FCS) e penicilina-estreptomicina.
  4. Transferência de baço e meios de comunicação sobre um coador de célula de 40 µm, montado sobre um tubo cónico de 50 mL. Usando a extremidade de borracha de um êmbolo de seringa de 3 mL, delicadamente esmaga o baço. Lave o filtro de célula de 40 µm com a mídia. Repita este processo até que apenas o tecido adiposo é deixado no 40 µm filtro célula. Enxágue o crivo com 3-5 mL de mídia para aumentar a recuperação celular.
  5. Centrifugue a célula homogenate a 300 x g durante 5 min à RT Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e adicionar 10 mL de tampão de lise de RBC x 1 para a pelota. Pipetar para cima e para baixo, deixar por 2 – 3 min em RT e centrifugar a 300 x g durante 5 min à RT
  6. Desprezar o sobrenadante e ressuspender splenocytes de células vermelhas do sangue empobrecida em 10 mL de mídia. Determine o número de células totais usando um hemocytometer ou outras dispositivo de contagem de células. Granule as células por centrifugação, como descrito acima.
    Nota: A concentração final ideal necessária para carregamento Indo-1 de splenocytes é 10-20 x 106 células/mL, mas uma menor concentração de células pode ser usada.
  7. Resuspenda splenocytes 15 x 106 células/ml no fluxo de cálcio carregando buffer (meio RPMI1640 contendo 1% FCS, ácido de 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), (glicol de etileno-bis de 1 mM Éter de β-aminoetil)-N, N, N', N'-tetraacetic ácido (EGTA) e 5% penicilina-estreptomicina). Adicionar em 1,5 µM Indo-1 de uma solução stock de DMSO de 1mm, inverta o tubo várias vezes para misturar. Proteger da luz e incube as células em banho de água a 37 ° C por 30 min.
  8. Após a incubação de 30 min, adicione 5 x a quantidade de fluxo de cálcio, tampão de carregamento. Centrifugar x g por 7 min em RT.
  9. Para retenção de células B, mancha células com 1: 200 anti-rato CD5-PE e anti-rato 1: 200 B220-PE/Cy7 em 0,5 mL de carregamento de buffer no 4 ° C por 20 min, protegido da luz.
  10. Lave os splenocytes no fluxo de cálcio carregando buffer e centrifugar x g por 7 min em RT. Ressuspender as células em 10 – 20 x 106 células/mL em fluxo de cálcio executando o tampão (Hank está equilibrada solução salina (HBSS) contendo 1% FCS, 1 mM MgCl2 e 1 mM cloreto de cálcio (CaCl2)). Armazenar no gelo, protegido da luz, até que esteja pronto para ser executado no citômetro de fluxo.
  11. Instalação de citometria de fluxo com controles de mancha imaculado e único para a compensação.
    1. Execute as células coradas para configurar as portas adequadamente (ver Figura 2A). Configuração de Indo-1 (violeta) contra enredo Indo-1 (azul), ajustar as tensões nos canais Indo-1 para colocar as células em uma inclinação de 45-60 ° para maximizar o sinal de coloração: ruído da Indo-1 violeta: azul mudança na relação após estimulação de células B.
      Nota: Certifique-se que as tensões não são demasiado elevadas, tal que uma percentagem significativa das células (> 5%) são contra o topo da trama.
    2. Criar um portão diagonal que encapsula a parte superior esquerda (Violet+azul–), do enredo, tal que sem estimulação < 10% das células estão no portão, que idealmente deve aumentar para > 75% após a estimulação.
  12. Adicionar 0,5 mL de células para um tampado 5 mL redondo fundo tubo poliestireno (fluorescência-ativado da pilha tubo (FACS) de classificação) e aquecer as células a 37 ° C por 3 – 5 min em um banho de água. Coloque o tubo de FACS na câmara water-jacketed de 37 ° C que é conectada a um banho de água de re-circulação.
    1. Executar o tubo water-jacket sobre o citômetro de fluxo e iniciar a aquisição, sem armazenar os dados, a aproximadamente 5.000 – 10.000 eventos/s. Uma vez que as células têm estabilizado (15 – 30 s), iniciar a aquisição e coleta de dados pelo menos 10 s para estabelecer o plano de fundo.
    2. Na marca de 10 s, rapidamente Retire o tubo do citômetro de fluxo, adicionar a estimulação (lipossomas antigênica 5-50 mM em 2 a 20 mL), pulso vortex e retornar o tubo de FACS sobre o citômetro de fluxo. Manter a aquisição de dados e armazenamento através desta vez e coletar dados para 3-5 min.
  13. Analise os dados no software de análise adequada sob as funções de cinética.

5. preparação do extrato de amendoim

  1. Extraia o amendoim proteínas através da mistura de farinha de amendoim em uma relação de 1:5 (wt:vol) de soro de tampão fosfato (PBS) com 1m de cloreto de sódio (NaCl). Misture a solução na placa de agitação magnética para 2h em RT, mantendo a pH 8,5.
  2. Solução de centrifugação a 3.000 x g durante 45 min a 4 ° C. Decantar e filtro-esterilizar sobrenadante sequencialmente através de um filtro de 0,4 µm, seguido por um filtro de 0,2 µm. Determine a concentração de proteína por bicinchoninic ácido (BCA) do ensaio usando albumina de soro bovino (BSA) como padrão.
  3. Reduzir e desnaturar uma amostra das proteínas de amendoim com 50mm ditiotreitol (DTT) em um buffer contendo Dodecil sulfato de lítio a um pH de 8,4, o que permite a máxima atividade do agente redutor e calor a 70 ° C por 10 min.
  4. Execute 10 µ g de proteína de amendoim desnaturada em um gel de polyacrylamide precasted de 4 – 12% Bis-Tris projetado para dar separação ideal gradient gel com peso molecular pre-manchado padrão.
  5. Manchar o gel com disulfonated trifenilmetano e destain com DDQ2O. Identify conhecido principais alérgenos amendoim Ara h 1, 2 e 3 em preparações de extrato. Ara h 1 aparece em 63 kDa, Ara h 2 deve aparecer como duas isoformas em 17 e 19 kDa e Ara h 3 aparece em 37 kDa (subunidade ácida).

6. sensibilização de ratos para amendoim

  1. Resuspenda toxina da cólera 1 mg em 1 mL de água ultrapura. Prepare-se 200 µ l diluída amendoim extrato contendo 2 mg proteína de amendoim e toxina da cólera 10 µ g em PBS.
  2. Administre 200 µ l de extracto de amendoim que contenha cólera toxina (2 mg de proteína de amendoim e 10 µ g toxina da cólera) via oral gavagem para cada rato fêmea BalB/cJ de 4-5 semanas. Repita uma vez por semana durante três semanas (ou seja, nos dias 0, 7 e 14).
  3. Administre 300 µ l diluída extrato de amendoim (contendo 5 mg de proteína de amendoim e 10 µ g toxina da cólera) via oral gavagem para cada rato na quarta semana (ou seja, dia 21).

7. desafio camundongos com extrato de amendoim

  1. No dia 28, prepare extrato de amendoim para uma concentração final de 1 mg/mL em PBS. Medir a temperatura do corpo da linha de base usando um termômetro retal (aproximadamente 37,5 a 38,5 ° C). Administre 200 µ l (200 µ g) de extrato de amendoim através de injeção intraperitoneal (i.p.).
  2. Medir a temperatura corporal com termômetro retal cada 15 min por 1h após a injeção. Um mergulho na temperatura corporal indica alergia a amendoim.
    Nota: A hipotermia é uma marca registrada de anafilaxia em camundongos. Este desafio irá demonstrar que os ratos são alérgicos a amendoim. Normalmente, 90% dos camundongos Balb/cJ que submeter-se o protocolo de sensibilização desenvolver reações alérgicas durante o desafio, caracterizado pelo menos uma diminuição de temperatura de 2 – 3 ° C.

8. isolamento dos Splenocytes de ratos alérgicos e transferência adoptiva

  1. Isole os splenocytes de amendoim ratos alérgicos e ingênua.
    1. No dia 30, eutanásia tanto ingênua e ratos alérgicos amendoim confirmados através da administração de 3 L/min de CO2 em uma câmara de gás. Confirme a eutanásia de ratos por toracotomia bilateral. Esterilize instrumentos cirúrgicos e carcaça do mouse usando o etanol a 70%. Use fórceps para separar a pele cobrindo a cavidade torácica da caixa torácica. Use tesoura reta de dissecação para fazer uma incisão bilateral quebrando as costelas esquerdas e direita.
    2. Usar o fórceps e a tesoura de dissecação para extrair o baço da cavidade abdominal. Remova tecido adiposo circundante baço antes de colocar em tubo cônico de poliestireno 15ml, preenchido com meio RPMI 1640 de 10 mL.
    3. Em uma capa de estéril de fluxo laminar, despeje baço e mídia um poliestireno 35 mm placa de Petri. Manter ingênua e splenocytes alérgica em separado de Petri e mídia durante o isolamento da célula. Use a pinça esterilizada e dissecando tesoura para cortar o baço em três pedaços e retornar à caixa de Petri.
    4. Usando a borda áspera, fosco de duas lâminas de microscópio, delicadamente homogeneizar (em RPMI) as peças do baço até tecido branco permanece entre os slides. Alterar slides entre grupos.
    5. Transferi homogenate de célula do prato de Petri através de um filtro de célula 70 µm montado em um tubo cónico de 50 mL. Passe os restantes fragmentos de baço através do filtro com um êmbolo de uma seringa de 1 mL. Enxágue o crivo com 5 mL de RPMI para maximizar a recuperação celular. Transferi o filtrado para um tubo cônico de poliestireno 15 mL e centrífuga (450 x g, 10 min, RT).
    6. Aspire o sobrenadante e ressuspender centrifugado, adicione em 2 mL de tampão de Lise células vermelhas do sangue (cloreto de amónio de 0,83% em tampão Tris de 10 mM, pH 7,2). Misturar e incubar a RT por 2 – 3 min. adicionar 10 mL de PBS - 2% FBS e centrifugar x g por 7 min em RT
    7. Lavar as células novamente com 12 mL de PBS - 2% FBS completamente remover qualquer residual de cloreto de amónio e centrifugar a 300 x g durante 7 min na célula RT. Ressuspender pelotas em 2 mL de meio RPMI 1640. Contar as células usando um hemocytometer ou analisador automático de hematologia.
  2. Usando um 27 G, 5/8-polegada agulha uma seringa de insulina 1 mL, por via intravenosa injectar 15 x 106 alérgica ou ingênuo splenocytes extraído como descrito acima (em 200 µ l) através da cauda da veia em camundongos ingênuo (unsensitized).

9. injeção de ratos com Ara h 2 antigênica lipossomas

  1. Prepare Ah2 lipossomas contendo 0,1% Ah2 em lipídios de 2,5 mM. Para calcular a concentração de proteína, o coeficiente de extinção de Ah2 é 15.000 M-1. Dilua os lipossomas para 300 µM em PBS estéril.
  2. Um dia depois da transferência adotiva (dia 31) do alérgico ou ingênuo splenocytes, injetar por via intravenosa 200 µ l de PBS ou os lipossomas antigênicos Ah2 (300 µM) contendo um total de 1,38 µ g de Ah2 através da veia da cauda de camundongos BALB/cJ que recebeu os splenocytes na etapa 8.2.

10. impulso e desafio de ratos com Ara h 2

  1. Duas semanas após a injeção com lipossomas Ah2, no dia 45, usar uma lanceta de animais de 4 mm para coletar 50 – 200 µ l de sangue da junção da submandibular do rato. Colheita de sangue em um tubo separador de soro sem heparina; separado o soro por centrifugação a 6.000 x g durante 15 min. Use o soro coletado mais tarde para anticorpos antígeno-específicos de medida.
  2. No dia 46, duas semanas após a injeção de ratos com lipossomas (passo 9.2), impulsionar os ratos por uma injeção i.p. de 200 µ l de PBS ou 200 µ g de solúvel Ah2 (purificado conforme descrito anteriormente,16).
  3. Em 60 dias, coletar 50-200 µ l de sangue da junção da submandibular do rato e processar o sangue, conforme descrito anteriormente.
  4. Dia 61, desafiar cada grupo de ratos com uma injeção i.p. de 200 µ l de 300 µ g Ah2 solúvel. Medir a temperatura do corpo com sonda rectal cada 15 min como na seção 7.

11. quantificação de Ara h 2 específico IgE e IgG1 por ELISA

  1. Revestir um ensaio de 96 poços imunoenzimático (ELISA)-placa compatível com 100 µ l HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl hapteno conjugados ao ser humano soro albumina, 20 µ g/mL) para a curva padrão ou Ah2 (5 µ g/mL) para amostras de soro coletadas nas etapas 10.1 e 10.3, diluído em buffer de revestimento (tampão de carbonato de bicarbonato de 50 mM, pH 9,6) no 4 ° C durante a noite ou a 37 ° C para > 1 h.
  2. Lavar três vezes com 200 µ l PBS-T (PBS com 0,05% Tween-20) e bloquear poços com 200 µ l PBS-T contendo BSA de 2% a 37 ° C para > 2 h.
  3. Para Ah2 específicos IgE ELISA, adicionar padrões de IgE-anti-DNP 50 µ l (2 – 0,002 µ g/mL, preparado a partir de diluições em série 1:2) ou amostras de soro de rato (01:20 diluição) e incubar durante a noite a 4 ° C. Para ELISA de IgG1 Ah2 específicas, adicionar 100 µ l purificado padrões IgG1-anti-DNP (2 – 0,002 µ g/mL, preparado a partir de diluições em série 1:2) ou mouse (diluição 1: 500) de amostras de soro e incubar durante a noite a 4 ° C ou 1 h a 37 ° C.
  4. Lavar três vezes com 200 µ l PBS-T. Para Ah2 específicos IgE ELISA, adicionar 100 µ l ovelhas anti-rato IgE (0,5 µ g/mL) e incubar a 37 ° C, durante 1 h. Para ELISA de IgG1 Ah2 específicas, adicionar 100 µ l HRP cabra anti-rato IgG1 (diluído 1:40,000 em PBS-T - 2% BSA). Incube a 37 ° C, durante 1 h.
  5. Lavar três vezes com 200 µ l PBS-T. IgE específico Ah2 ELISA, adicionar 100 anti-ovelhas da biotinilado-burro µ l IgG (0,5 µ g/mL) e incubam a 37 ° C, durante 45 min. Para ELISA de IgG1 Ah2 específicos, pule para a etapa de 11,7.
  6. Lavar três vezes com 200 µ l PBS-T. Para Ah2 específicos IgE ELISA, adicionar 100 µ l neutra carregadas com peroxidase de rábano-avidina (por exemplo, NeutrAvidin-HRP, 0,3 µ g/mL) e incubar a 37 ° C por 30 min.
  7. Adicionar 100 µ l 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) substrato, incube 10-15 min ou até as amostras fiquem azul escuro, em seguida, adicionar solução de paragem TMB 100 µ l. Leia a placa a 450 nm.

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Resultados

Conjugação da proteína de interesse com DSPE-PEG(2000) pode ser demonstrada através da execução de um redutor mostrando um aumento no peso molecular em comparação com a proteína unconjugated. Figura 1A mostra um gel representativo de conjugação de fragmento de F(ab) de IgM antirato para PEG-DSPE, que mostra um bandshift de kDa 2-3 para a proteína desnaturada. Note-se que aproximadamente 50% da proteína parece ser modificado, que é esperado, dado que a estequi...

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Discussão

Os métodos descritos aqui são um protocolo geral para a conjugação de uma proteína para um lipídio que permite a exibição da proteína sobre nanopartículas lipossomas. Para grandes subunidade várias proteínas, este protocolo pode ter limitado utilitário. O método ideal seria a introdução de uma marca específica do site que permite que uma estratégia de ligação química biorthogonal ser usado. Se expressar as proteínas recombinantes, isto pode ser possível usando estratégias específicas disponíveis17...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do departamento de defesa (W81XWH-16-1-0302 e W81XWH-16-1-0303).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Coletor de Frações Modelo 2110BioRad7318122
CholestrolSigmaC8667Sigma grau 99%
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti880126
ExtrusoraAvanti610000Seringa de 1 mL com suporte/bloco de aquecimento
Filtros 0.1 µ m610005Avanti
0.8 µ mAvanti610009 Suportes de
filtro de 10 mmAvanti6100014
Frasco de fundo redondo de vidroSigmaZ100633
Rolhas de volume de negóciosThermo Fisher ScientificP-301398
TubulaçãoThermo Fisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Contas Sephadex G50 GELife Sciences17004201
Contas Sephadex G100GE Life Sciences 17006001
CalorThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
1x Tampão de lise de hemáciasThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112sem cálcio e magnésio
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab anti-rato IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 anti-rato IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
Farinha de amendoimGolden Peanut Co.52127112% de gordura torrada leve, 50% de proteína
Agulhas de alimentação animalCadence Science792022g x 1,5", 1,25 mm - reto
Termômetro MicroprobePhysitempBAT-12
Sonda retal para camundongosPhysitempRet-3
Toxina da cólera, de Vibrio choleraList Biological Laboratories, Inc.100BAzide livre
BCA Protein Assay KitPierce23225
Tampão de carbonato-bicarbonatoSigmaC3041
TMB Stop SolutionKPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL5120-0077
96 poços Immulon 4HBX placaThermo Scientific3855
Ara solúvel purificado h 2N / AN / Apurificado como em: Sen, et al.< / em>, 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE anti-DNPQuímico PrecisoBYA60251
Ovelhas anti-Mouse IgEO local de ligaçãoPC284
Burro biotinilado anti-ovelha IgGQuímico precisoJNS065003
Proteína NeutrAvidina, HRPThermoFisher Scientific31001
Mouse IgG1 anti-DNPQuímico PrecisoMADNP105
HRP Cabra anti-mouse IgG1Southern Biotech1070-05
Seringas de insulina de 1 mLBD329412U-100 Insulina, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")
Lâminas de microscópio SuperfrostFisher Scientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1.0 mm
ACK Lysing Buffergibco da Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500 mL
Cell StrainerCorning35235070 μ m Nylon, Branco, Estéril, Embalado individualmente
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsInvitrogenNP0322BOX10 géis
NuPAGE LDS buffer, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 Padrão pré-manchadoInvitrogenLC5925500 µ L
NuPAGE MES/SDS tampão de corrida, 20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 mL
Filtros Soro de Bezerro Fetal Inativado por

Referências

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