Method Article

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

DOI:

10.3791/58298

⸱

January 23rd, 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenético regulamento tem um papel central na expressão gênica. Desde que a modificação do histone foi descoberta na década de 1960, suas funções fisiológicas e patológicas têm sido muito estudadas. Com efeito, o advento da próxima geração sequenciamento profundo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP) através de anticorpos de modificação de histona específico tem revolucionado o nosso ponto de vista do Regulamento epigenético através do genoma. Por outro lado, tecidos tipicamente consistem em tipos de diversas células, e sua mistura complexa coloca desafios analíticos para investigar a Epigenoma em um tipo específico de célula. Para resolver o estado de cromatina de tipo específico de célula em uma forma de todo o genoma, desenvolvemos recentemente em tandem da cromatina imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq), que se baseia a purificação seletiva da cromatina de proteínas de histona marcados do núcleo da célula tipos de interesse, seguido de ChIP-Seq O objetivo do presente protocolo é a introdução de melhores práticas de tChIP-Seq Esta técnica fornece uma ferramenta versátil para a investigação de tecido-específica Epigenoma em modificações do histone diversificada e organismos modelo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tecidos de animais consistem em tipos de células diferentes. A regulação dos genes em cada célula define o tipo de célula. Modificações da cromatina - DNA metilação e histona modificação - fundamentam a especificidade do tipo de célula da expressão do gene. Assim, a medição do Regulamento epigenética em cada tipo de célula tem sido desejada, mas tem sido um desafio técnico.

Para investigar a epigenética em um tipo específico de célula, sequenciamento de imunoprecipitação da cromatina em tandem (tChIP-Seq) foi recentemente desenvolvido (Figura 1)1. Em tChIP, proteína de núcleo com tag epítopo histona H2B é expressa de um promotor de célula tipo-específico. Este recurso permite o isolamento de chromatins partir de células de interesse, embora o material começa a partir de uma mistura de vários tipos de células. ChIP-Seq seguir — purificação da cromatina, através de um modificado-histona marca e geração de sequenciamento profundo de isolado DNA — pode monitorar o status epigenético o tipo de células alvo de forma todo o genoma.

Usando esta técnica, investigamos recentemente neurônio específico trimethylation de histona H3 proteína em lisina (H3K4me3) de 4 marcas. Nesse estudo, nós desenvolvemos um rato bate-no qual C-terminal bandeira-tag H2B proteína foi expressa sobre recombinação mediada por Cre (Rosa26Floxed-pA CAG H2B-bandeira). Por cruzamento com um rato, possuindo o Cre-endoplasmic gene endoplasmático (ER) sob o controle do promotor CamK2a, a linha obtidos rato induzido H2B-bandeira nos neurônios ativos sobre tamoxifeno injeção (Camk2aH2B-bandeira)1. A partir do cérebro da linha estabelecida rato, realizamos tChIP-Seq com anticorpo anti-H3K4me3. Desde que H3K4me3 marcas muitas vezes correspondem a regiões do promotor, poderia descobrir centenas de mRNAs especificamente expressados em neurônios1.

Aqui, descrevemos um método típico tChIP-Seq que cobre as etapas de dissecção de tecidos para a construção da biblioteca (Figura 1). O objetivo final do presente protocolo é compartilhar nossas melhores práticas para o desempenho de tChIP-Seq e a aplicação futura deste método para outros tipos de células e modificações do histone.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pela divisão de segurança da RIKEN (H27-EP071) e conduzidos com normas e diretrizes relevantes.

1. dissecção de tecidos

  1. Dissecar os tecidos de interesse em pedaços pequenos (aproximadamente < 3 mm2) com uma tesoura de primavera.
    Nota: Fragmentos de tecido maiores demoram mais para congelar, e pedaços menores vão transitar por maiores volumes de tampão, ambos os quais podem afetar os resultados.
  2. Adicionar os fragmentos de tecido dissecado para um recipiente limpo com nitrogênio líquido e recolhê-los em tubos de 2 mL (1 parte por tubo) preenchido com nitrogênio líquido.
    Nota: Os tubos com uma superfície hidrofílica são recomendados para esta etapa.
  3. Coloque os tubos a-80 ° C para > 5 minutos com a tampa aberta para evaporar o nitrogênio líquido restante.
    Nota: Depois de fechar a tampa, fragmentos de tecido podem ser armazenados a-80 ° C durante um mês antes do uso.

2. fixação da pilha

Nota: Usamos um moedor criogênico útil para esta etapa. Um aparelho alternativo pode ser usado.

  1. Tubos de ligação de baixo lugar a 2 mL-proteínas contendo as amostras de tecido em uma cremalheira do metal gelo refrigerados em nitrogênio líquido.
  2. Coloque uma bala de metal em um 1,5 mL-tubo e resfriado com nitrogênio líquido. Coloque-o na prateleira do gelo de metal.
  3. Abra o tubo 2 mL e coloque a bala de metal prechilled para dentro do tubo. Feche a tampa, definir os 2 mL-os tubos no suporte do tubo de um moedor criogênico útil e mergulhe imediatamente o titular tubo montado em nitrogênio líquido por 1 min.
  4. Encaixe o suporte de tubo congelado a gaveta exterior do moinho criogênico útil e agitar vigorosamente 60 vezes por 30 s.
  5. Desmontar o suporte de tubo, remover a bala de metal e coloque o 2 mL-o tubo numa amostra refrigerador prechilled a-20 ° C.
  6. Coloca a amostra mais frio a-20 º C por 15 min evitar o congelamento do fixador na próxima etapa.
  7. Levar a amostra mais fresca para o banco, abrir a tampa do tubo e imediatamente gotejamento 900 µ l de formol 1% disso. Após várias vezes de pipetagem, transferir a suspensão nova 2 mL-tubo contendo 900 µ l de formol 1% e correção para 10 min com suave rotação na incubadora, situado a 23 ° C.
    Atenção: O formaldeído é tóxico e prejudicial.
  8. Para parar a reação de fixação, adicionar 100 µ l de glicina de 2,5 M a cada tubo e centrifugar por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
  9. Adicionar 1 mL de gelado fosfato salino (PBS), centrifugar por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes (3 lavagens no total).
    Nota: Amostras fixas podem ser congelado por nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C.
  10. Adicionar 500 µ l do Lysis Buffer 1 (ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 50mm 4 (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM de NaCl, 1 mM etilenodiaminotetracético ácido (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v glicerol, 0,5% w/v NP-40, inibidor de protease 0,25% w/v Triton x X-100 e 0.1 coquetel) ao pellet, pipetar várias vezes e gire por 10 min a 4 ° C.
    Nota: Lise 1 deve ser filtrado e armazenado a 4 ° C antes do uso.
  11. Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
  12. Adicionar 1 mL de Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM de NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA e 0.1 x coquetel de inibidor de protease) ao pellet, vórtice e gire por 10 min a 4 ° C.
    Nota: Lise 2 deve ser filtrado e armazenado a 4 ° C antes do uso.
  13. Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
  14. Adicionar 800 µ l de buffer de ensaio (RIPA) radioimmunoprecipitation com inibidor de protease 1x cocktail ao pellet e resuspenda o pellet pipetando.
  15. Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
  16. Adicione 500 µ l de buffer RIPA com 1 x inibidor da protease cocktail.
  17. Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
  18. Adicione 1 mL de tampão RIPA com 1 x inibidor da protease cocktail. Imediatamente, prossiga para a próxima etapa.

3. cromatina tosquia

  1. Transfira o lisado para um tubo de sonicador e em seguida, coloque o tubo em um ultrasonicator.
  2. A cromatina de cisalhamento com as seguintes configurações: temperatura: 4 ° C; pico de potência incidente: 175 W; factor de serviço: 10%; ciclos/explosão: 200; e tempo: 2.400 s.
  3. Transferir a amostra para um 1,5 mL-proteína baixa ligação tubo e centrifugar durante 5 min à 20.000 x g a 4 ° C.
  4. Recolha o sobrenadante para um tubo de ligação de baixa proteína nova.
    Nota: A amostra pode ser congelado em nitrogênio líquido e armazenada a-80 ° C.

4. seleção de qualidade do DNA (reticulação reversa)

  1. Mix 20 µ l do lisado e 180 µ l de tampão de eluição do ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM de NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) e 1% w/v Dodecil sulfato de sódio (SDS)) em um tubo de reação em cadeia (PCR) de polimerase. Incube a amostra a 65 ° C em um termociclador para 6 h com a tampa do termociclador aberta. Mantenha a tampa do termociclador aberta para evitar excesso de desnaturação.
    Nota: O tampão de eluição de ChIP deve ser filtrado e armazenado à temperatura ambiente antes do uso. Esta incubação pode ser estendida para a noite.
  2. Adicione 1 µ l de 10 mg/mL RNase A, vórtice e incubar a 37 ° C por 30 min.
  3. Adicione 6,5 µ l de 15 mg/mL proteinase K, vortex e incubar a 55 ° C por 60 min.
  4. A reação de um tubo de ligação baixa de DNA de transferência, adicione 4 µ l de glicogênio de 5 mg/mL e o vórtice. Em seguida, adicione 200 µ l de álcool isoamílico/fenol/clorofórmio (25:24:1) e centrifugar por 5 min a 18.000 x g, à temperatura ambiente.
  5. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de ligação baixa de DNA. Adicionar 200 µ l de tampão Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) e 200 mM NaCl) para a solução de fenol/clorofórmio/isoamílico álcool restante e centrifugar durante 5 min à 18.000 x g, à temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante e misture com o sobrenadante primeiro.
  6. Adicionar 900 µ l de etanol gelado e incubar durante 1 h a-20 ° C.
    Nota: Esta incubação pode ser estendida para 4 - 6 h.
  7. Centrífuga para 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.
  8. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 1 mL de etanol gelado de 75% para a pelota e centrifugar durante 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Repita este passo (duas lavagens no total).
  9. Descartar o sobrenadante cuidadosamente e deixe secar naturalmente por 1 min à temperatura ambiente.
  10. Adicionar 50 µ l de tampão Tris-EDTA (TE) e dissolver o DNA pela incubação à temperatura ambiente por 30 min ou a 4 ° C durante a noite. Evite a utilização do Vortex ou pipetagem. Manter este DNA como "entrada" e usá-lo para a preparação de biblioteca, se necessário.
  11. Medir a concentração de DNA com um dados de acordo com as instruções do fabricante (ver tabela de materiais) e verificar a distribuição de tamanho com uma máquina de electroforese microfluidic (ver dados representativos, mostrados na figura de 2a). uso 10 ng ou menos DNA para este ensaio.
    Nota: Fragmentos de 100 – 500 pares de bases (bp) a ter 50% ou mais do DNA.

5. purificação de afinidade pelo anticorpo anti-FLAG

Nota: Para o neurônio tChIP-Seq, tecidos cerebrais de 8 ratos são normalmente usados para obter um exemplo de tChIP-Seq para preparar 2 ng de DNA purificado pela purificação imunológico em tandem (ver passo 7.1). Em nossas mãos, 0,1 ng de DNA ainda fornecida bibliotecas de DNA de alta qualidade para ChIP-Seq (Janaina, não publicada). Assim, em teoria, um único rato pode ser suficiente para executar o neurônio tChIP-Seq A quantidade necessária deve ser otimizada para o tipo de tecidos e células de interesse. Para o controle negativo da experiência imumuno-purificação, tecido cerebral lisado de ratos sem qualquer expressão de H2B-bandeira deve ser preparado e usado.

  1. Pipete 200 µ l dos grânulos magnéticos conjugada com ovelhas anti-rato a imunoglobulina G (IgG) em um tubo de ligação de baixa proteína.
  2. Coloque o tubo sobre um suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS gelado e o vórtice. Repita este passo (duas lavagens no total).
  3. Adicionar 20 µ l de anticorpo antibandeira de 1 mg/mL e girar para 5 h a 4 ° C.
    Nota: Esta incubação pode ser estendida para a noite.
  4. Lave os grânulos seguindo passo 5.2. Coloque as contas em um tubo de 15 mL.
  5. Resuspenda os grânulos em 1110 µ l de tampão RIPA e em seguida, adicionar 900 µ l de 10x bloqueando reagente, 180 µ l de solução do Denhardt de 50x, 10 µ l de 100 x coquetel de inibidor de protease e 6,8 mL do lisado preparado no passo 3. Dividi essa mistura em 5 tubos de ligação de baixa proteína. Girar para 6 h a 4 ° C.
    Nota: Esta incubação pode ser estendida para a noite.
  6. Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de tampão RIPA e misture suavemente. Repita este passo 5 vezes (6 lavagens no total). Todas as contas do pool em um tubo de ligação de baixa proteína única.
  7. Adicionar 200 µ l de tampão de eluição de ChIP e rodar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Verifica a qualidade do DNA, conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2B e C). Imediatamente, prossiga para a próxima etapa.

6. afinidade purificação por anticorpo Anti-H3K4me3 e reticulação reversa

Nota: A seguinte do grânulo preparação que etapas (6,1-6,4) devem ser executadas antes passo 5.7.

  1. Pipete 40 µ l de grânulos magnéticos conjugada com anti-rato ovelhas IgG em um tubo de 2 mL-emperramento da proteína baixa.
  2. Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS gelado e misture suavemente. Repita este passo (duas lavagens no total).
  3. Adicione 4 µ l de anticorpo anti-H3K4me3 de 1 mg/mL e girar para 6 h a 4 ° C.
  4. Lave os grânulos 6.2 passo a seguir. Coloque as contas em um tubo de ligação de baixa 2 mL-proteína.
  5. Resuspenda as contas em 1558 µ l de tampão RIPA e adicione 200 µ l de 10x bloqueando reagente, 40 µ l de solução do Denhardt de 50x, 2 µ l de 100 x coquetel de inibidor de protease e 200 µ l do eluato preparado no passo 5.7. Rodar a noite a 4 ° C.
    Nota: O SDS em tampão de eluição do ChIP foi diluído 10 vezes mais nesta incubação.
  6. Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de tampão RIPA e misture suavemente. Repita essa etapa 4 vezes (5 lavagens no total). Após a última lavagem, transferir as contas para um tubo de ligação baixa de DNA e descartar o sobrenadante.
  7. Adicionar 200 µ l de tampão de eluição de ChIP e rodar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferi o eluato para um novo bindingTube baixa de DNA.
    Nota: O eluato pode ser armazenado a-80 ° C.
  8. Siga o passo 4 para decrosslinking do DNA. Resuspenda o DNA purificado em 20 µ l de tampão TE.
  9. Verifica a qualidade do DNA, conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2D). (opcional) Realizar análise de enriquecimento por PCR quantitativo conforme descrito anteriormente,2. Dez vezes ou maior enriquecimento deve ser observado.

7. Biblioteca construção

  1. Para cada entrada e ChIP de DNA, calcule a proporção de DNA na região de 100-500-bp, usando a função de análise do esfregaço do software para a máquina de electroforese microfluidic. Estimar o volume de amostra necessário para obter 2 ng de 100-500 bp DNA. Use 20 ng DNA na faixa de 100-500-bp como o exemplo de "entrada".
  2. Pipetar amostras de DNA polimerase 8-faixa e adicione H2O para trazer o volume total de 10 µ l. (opcional) se o volume de DNA excede 10 µ l, aumentar proporcionalmente a seguinte reação final-reparação e a seleção de tamanho.
  3. Preparar mistura de mestre final-reparação (ver Tabela de materiais). Adicionar 4 µ l do mix mestre final-reparação do DNA e incube por 30 min a 20 ° C.
  4. Adicione 36 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 e 0,6 x volume (30 µ l) de sólido fase grânulos magnético reversível imobilização (SPRI) e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.
  6. Transferir o sobrenadante para um tubo novo, adicione 1,2 x volumes (60 µ l) de grânulos magnéticos SPRI e incubar 5 min à temperatura ambiente.
  7. Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.
  8. Lave os grânulos duas vezes com 200 µ l de 80% EtOH, segurando o tubo ainda sobre o ímã.
  9. Brevemente, centrifugar o tubo para coletar o EtOH residual na parte inferior e colocá-lo de volta sobre o ímã. Remova o residual EtOH completamente.
  10. Deixe a tampa do tubo aberto para 1-2 min permitir que o EtOH evaporar.
  11. Feche a tampa e mantenha o tubo no gelo.
    Nota: Agora você obteve DNA tamanho selecionado de 100-500 bp sobre os grânulos. Mais detalhes sobre a seleção de tamanho duplo podem ser encontrados no site do fabricante (www.beckman.com).
  12. Preparar A-tailing mestre mistura (veja a Tabela de materiais).
  13. Resuspenda os grânulos (de passo 7.10) com 10 µ l de mistura de mestre A-tailing e incube por 30 minutos a 30 ° C.
  14. Adicionar 1,8 x volume (18 µ l) de polietileno glicol (PEG) / solução de NaCl e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  15. Siga os passos 7,7-7.11 para purificar o DNA.
  16. Preparar a mistura de tampão de ligadura (ver Tabela de materiais).
  17. Pipetar 8 µ l de mistura de tampão da ligadura para os grânulos (de passo 7.14), adicione 1 µ l de 1 adaptador µM e ressuspender os grânulos. Use 1 µ l de adaptador de 5 µM para o exemplo de entrada. Considere o uso de adaptadores diferentes para cada amostra de multiplexação.
  18. Acrescente 1 µ l de DNA Ligase e incube por 15 min a 20 ° C.
  19. Adicionar 1,0 x volume (10 µ l) da solução de NaCl/PEG, resuspenda os grânulos e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  20. Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.
  21. Pipetar 25 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.
  22. Adicionar 1,0 x volume (25 µ l) de solução de NaCl/PEG e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  23. Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.
  24. Pipete 11 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.
  25. Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.
  26. Recolha o sobrenadante para um tubo de PCR 8-faixa novo.
  27. Preparar a mistura de mestre PCR em tempo real (ver materiais para obter detalhes).
  28. Pipete 8,5 µ l de mistura de mestre de PCR em tempo real em um prato PCR (qPCR) 384-bem quantitativa e adicionar 1,5 µ l do adaptador ligado DNA (da etapa 7.26).
  29. Pipete 10 µ l de cada padrão fluorescente em poços vazios.
  30. Realizar o PCR em tempo real com o seguinte programa: (98 ° C por 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s) x 20 ciclos, e (72 ° C por 60 s) x 1 ciclo.
  31. Determine o número de ciclos PCR necessária para atingir a intensidade de fluorescência da fluorescente padrão 2.
  32. Preparar o mestre PCR mistura (veja a Tabela de materiais).
  33. Pipetar 11,5 µ l do mix mestre PCR no DNA restante (da etapa 7.26) adaptador-ligados e realizar PCR conforme indicado no passo 7: 30h com os ciclos PCR determinados em 7.31 da etapa.
  34. Adicionar 1,0 x volume (20 µ l) de solução de NaCl/PEG e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  35. Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.
  36. Pipetar 20 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.
  37. Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.
  38. Recolha o sobrenadante para um tubo de ligação de baixa 1,5 mL-DNA novo.
  39. Verifica a qualidade da biblioteca conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2E e F). Use 1 µ l de amostra de DNA da biblioteca. (opcional) Realizar análise de enriquecimento por qPCR conforme descrito anteriormente, 2. Dez vezes ou maior enriquecimento deve ser observado.

8. sequenciamento

  1. Sequenciar as bibliotecas em um sequenciador de próxima geração (ver dados representativos, mostrados na Figura 3).
    Nota: A profundidade de sequência suficiente para a análise de dados pode variar dependendo do tamanho do genoma do organismo3. Para o ser humano e rato, nós recomendamos a obtenção de pelo menos 20 milhões de único-extremidade leituras. De acordo com o rendimento de leituras, multiplexação pode ser rentável.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos a dissecção de tecidos, fixação, lysis da pilha, purificação em tandem da cromatina e preparação de biblioteca de DNA por sequenciadores de última geração. Durante os procedimentos, pode-se testar a qualidade do DNA, que é a chave para o sequenciamento de sucesso, em várias etapas (Figura 2). Desde uma única nucleossoma é tipicamente rodeada por 147 bp DNA 4, DNA cortado não deve ser inferior esse tamanho. Imediatamen...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nosso protocolo foi otimizado para os neurônios do cérebro do rato, em que a expressão da bandeira-tag H2B é induzida pela injeção de tamoxifeno. Promotores utilizados para H2B expressão, matérias-primas tecido e a quantidade dos tecidos são parâmetros cruciais para sucesso tChIP-Seq Assim, a otimização desses fatores deve ser considerada para cada tipo de célula de interesse.

Um passo crítico entre os procedimentos utilizados neste protocolo é o DNA de tosquia para atingir um comprimento de c...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a todos os membros do laboratório Iwasaki para leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte por um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (26113005 # S.N. e JP17H05679 o S.I.); um subsídio para jovens cientistas (A) (JP17H04998 o S.I.) do Ministério da educação, ciência, esportes e cultura do Japão (MEXT); e as pioneiras projetos "Evolução celular" e todo projeto RIKEN "Doença e Epigenoma" de RIKEN (para S.N. e S.I.).

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Materials

2

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubo LoBind de proteína, 2 mLEppendorfNo.  0030108132lise celular
, 1,5 mLEppendorfNo.  0030108116Para ChIP e preparação de biblioteca
Tubo de DNA LoBind, 1.5 mLEppendorfNo.  0030108051Para ChIP e preparação
de biblioteca Tubo de PCR de 8 tirasBIO-BIK3247-00Para ChIP e preparação de biblioteca
SK MillTOKKENSK-200Moedor criogênico prático para fazer pó de célula para fixação
Bala de metalTOKKENSK-100-DLC10Acessório do SK Mill
Tubo de aço inoxidável de 2 mLTOKKENTK-AM5-SUSUma opção para célula suporte
tubo de lise 2 mL em aço inoxidávelTOKKENSK-100-TLUma opção para lise celular
16% formaldeído (p/v), sem metanolPierce28906Para fixar células. Prepare a solução a 1% antes de usar.
GlycineNacalai Tesque17109-35Prepare o estoque de 2,5 M
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Para lavar lisado e DNA purificado
HEPESNacalai Tesque02443-05Para tampão de lise 1. Prepare 1 M, caldo de pH 7,5.
5 M NaCl, grau de biologia molecularNacalai Tesque06900-14Para tampão de lise 1, tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, grau de biologia molecularWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Para tampão de lise 1, tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl
GlicerolWako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945Para tampão de lise 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Para tampão de lise 1
Triton X-100, grau de biologia molecularNacalai Tesque12967-32Para tampão de lise 1
TrisNacalai Tesque35406-91Para tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl. Prepare 1 M, caldo de pH 8,0.
0,1 M EGTA pH neutroNacalai Tesque08947-35Para tampão de lise 2
Coquetel de inibidor de protease (100x)Nacalai Tesque25955-24Para bloquear a degradação do
tampão de proteína RIPAThermo Fisher Scientific89900Para lise celular e
lavagem milliTUBE 1 mL AFA FiberCovaris520130Sonicator tube. Acessório do ultrassônico focalizado
CovarisS220 ou E220Para digerir o DNA em tamanho adequado para ChIP-Seq
UltraPure 10% SDSThermo Fisher Scientific15553-027Para Tampão de eluição ChIP
RNase ANacalai Tesque30141-14Para purificar o DNA do lisado
Proteinase K, recombinante, PCR GrauSigma-Aldrich3115887001Para purificar o DNA do etanol lisado
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225Faça 70% de solução
Anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 produzido em camundongoSigma-AldrichF1804Para purificar a cromatina expressa em células de interesse
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgGThermo Fisher Scientific11201DIsso pode ser usado para anti-FLAG IP e anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-metil histona H3 (K4), anticorpo monoclonal de camundongoWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811Qualquer outro anticorpo que funcione para análise ChIP funcionará
10x Reagente de bloqueioSigma-Aldrich11096176001Para bloqueio durante a purificação de afinidade
Denhardt' s soluçãoNacalai Tesque10727-74Para bloqueio durante a purificação de afinidade
Glicogênio (5 mg/ml)Thermo Fisher ScientificAM9510Para purificar o DNA do lisado
Qubit 2.0 FluorômetroThermo Fisher ScientificQ32866Para quantificação de DNA isolado
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851Para quantificação de DNA isolado
Tubo de 0,5 mLAxygen10011-830Para quantificação por Qubit
Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Para purificar o DNA do lisado
AMPure XP grânulosBeckman CoulterA63881SPRI magnéticos para preparação de biblioteca
Rack de gelo de metalFunakoshiIR-1Para manter o lisado celular congelado
Resfriadorde amostras New England BiolabsT7771SAjuda a consertar células com danos mínimos
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAPara verificar a qualidade de fragmentos de DNA isolados. Outro analisador de fragmentos pode ser usado.
Software Especialista Bioanalyzer 2100Agilent TechnologiesG2946CAFornecido com o
Kit de DNA de Alta SensibilidadeAgilent Technologies5067-4626Para verificar a qualidade dos fragmentos de DNA isolados
KAPA LTP Library Preparation KitRoche07961898001Fornecido com 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase e solução PEG/NaCl
NEXTflex DNA BarcodesBIOO ScientificNOVA-514101Adapter para preparação de bibliotecas. Fornecido com adaptadores de código de barras de DNA e mistura de primer.
Kit de amplificação de biblioteca em tempo real KAPARoche07959028001Fornecido com 2x KAPA HiFi HS PCR em tempo real Master Mix, PCR Primer Mix e padrões fluorescentes
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602Para preparação de biblioteca. Além disso, esta enzima pode ser necessária para o KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8,5 para eluição de placa
qPCR de DNA de 386 poçosThermo Fisher Scientific4309849Para PCR em tempo real
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific4485701Para quantificar o DNA
MicroAmp Filme Adesivo ÓpticoThermo Fisher Scientific4311971Para PCR em tempo real
MicroAmp Clear Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4306311Para vedação de placas
MisturaCombine 1.4 µ L de 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µ L de KAPA End Repair Enzyme Mix e 1,6 µ L de H2O
Master mixCombine 1 µ L de tampão de cauda A KAPA, 0,6 µ L da enzima KAPA A-tailing e 8,4 µ L de H2O
de tampão de ligaçãoCombine 2 µ L de tampão de ligadura KAPA e 6 µ L de H2O
mestre de PCR em tempo realCombine 5 µ L de 2x KAPA HiFi HS PCR Master Mix em tempo real, 0,35 µ L de Primer PCR Mix (10 µ M cada um dos primers diretos AATGATACGGCGACCACCGAG e primer reverso CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) e 3,15 µ L de mistura
Combine 10 µ L de 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µ L de PCR Primer Mix e 0,6 µ L de H2O
Integrative Genomics ViewerBroad InstituteIGV_2.3.88Navegador do genoma para visualizar dados de sequenciamento
DNA olgionucleotídeo: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′Eurofins GenomicsUm primer para amplificar a região promotora do
olgionucleotídeo do DNA GAPDH: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins GenomicsUm primer para amplificar a região promotora de GAPDH
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR420LPara quantificar o DNA correspondente à região promotora de GADPH
Thermal Cycler DiceTakaraTP870Para quantificar o DNA correspondente à região promotora de GADPH
Para tubo de proteína LoBind de de Bioanalyzer mestre de reparo final A-taling Mistura Mistura mestra de PCR HO

References

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