TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Resumo

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

Resumo

Epigenético regulamento tem um papel central na expressão gênica. Desde que a modificação do histone foi descoberta na década de 1960, suas funções fisiológicas e patológicas têm sido muito estudadas. Com efeito, o advento da próxima geração sequenciamento profundo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP) através de anticorpos de modificação de histona específico tem revolucionado o nosso ponto de vista do Regulamento epigenético através do genoma. Por outro lado, tecidos tipicamente consistem em tipos de diversas células, e sua mistura complexa coloca desafios analíticos para investigar a Epigenoma em um tipo específico de célula. Para resolver o estado de cromatina de tipo específico de célula em uma forma de todo o genoma, desenvolvemos recentemente em tandem da cromatina imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq), que se baseia a purificação seletiva da cromatina de proteínas de histona marcados do núcleo da célula tipos de interesse, seguido de ChIP-Seq O objetivo do presente protocolo é a introdução de melhores práticas de tChIP-Seq Esta técnica fornece uma ferramenta versátil para a investigação de tecido-específica Epigenoma em modificações do histone diversificada e organismos modelo.

Introdução

Tecidos de animais consistem em tipos de células diferentes. A regulação dos genes em cada célula define o tipo de célula. Modificações da cromatina - DNA metilação e histona modificação - fundamentam a especificidade do tipo de célula da expressão do gene. Assim, a medição do Regulamento epigenética em cada tipo de célula tem sido desejada, mas tem sido um desafio técnico.

Para investigar a epigenética em um tipo específico de célula, sequenciamento de imunoprecipitação da cromatina em tandem (tChIP-Seq) foi recentemente desenvolvido (Figura 1)¹. Em tCh....

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pela divisão de segurança da RIKEN (H27-EP071) e conduzidos com normas e diretrizes relevantes.

1. dissecção de tecidos

1. Dissecar os tecidos de interesse em pedaços pequenos (aproximadamente < 3 mm²) com uma tesoura de primavera.
   Nota: Fragmentos de tecido maiores demoram mais para congelar, e pedaços menores vão transitar por maiores volumes de tampão, ambos os quais podem afetar os resultados.
2. Adicionar os fragmentos de tecido dissecado para um recipiente limpo com nitrogênio líquido e recolhê-los em tubos de 2 mL (1 parte por tubo) preenchido com nitrogênio ....

Resultados

Aqui, descrevemos a dissecção de tecidos, fixação, lysis da pilha, purificação em tandem da cromatina e preparação de biblioteca de DNA por sequenciadores de última geração. Durante os procedimentos, pode-se testar a qualidade do DNA, que é a chave para o sequenciamento de sucesso, em várias etapas (Figura 2). Desde uma única nucleossoma é tipicamente rodeada por 147 bp DNA ⁴, DNA cortado não deve ser inferior esse tamanho. Imediatamen.......

Discussão

Nosso protocolo foi otimizado para os neurônios do cérebro do rato, em que a expressão da bandeira-tag H2B é induzida pela injeção de tamoxifeno. Promotores utilizados para H2B expressão, matérias-primas tecido e a quantidade dos tecidos são parâmetros cruciais para sucesso tChIP-Seq Assim, a otimização desses fatores deve ser considerada para cada tipo de célula de interesse.

Um passo crítico entre os procedimentos utilizados neste protocolo é o DNA de tosquia para atingir um comprimento de c.......

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo LoBind de proteína, 2 mL	Eppendorf	No.  0030108132	lise celular
, 1,5 mL	Eppendorf	No.  0030108116	Para ChIP e preparação de biblioteca
Tubo de DNA LoBind, 1.5 mL	Eppendorf	No.  0030108051	Para ChIP e preparação
de biblioteca Tubo de PCR de 8 tiras	BIO-BIK	3247-00	Para ChIP e preparação de biblioteca
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Moedor criogênico prático para fazer pó de célula para fixação
Bala de metal	TOKKEN	SK-100-DLC10	Acessório do SK Mill
Tubo de aço inoxidável de 2 mL	TOKKEN	TK-AM5-SUS	Uma opção para célula suporte
tubo de lise 2 mL em aço inoxidável	TOKKEN	SK-100-TL	Uma opção para lise celular
16% formaldeído (p/v), sem metanol	Pierce	28906	Para fixar células. Prepare a solução a 1% antes de usar.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare o estoque de 2,5 M
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	Para lavar lisado e DNA purificado
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	Para tampão de lise 1. Prepare 1 M, caldo de pH 7,5.
5 M NaCl, grau de biologia molecular	Nacalai Tesque	06900-14	Para tampão de lise 1, tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, grau de biologia molecular	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	Para tampão de lise 1, tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl
Glicerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	Para tampão de lise 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	Para tampão de lise 1
Triton X-100, grau de biologia molecular	Nacalai Tesque	12967-32	Para tampão de lise 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	Para tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl. Prepare 1 M, caldo de pH 8,0.
0,1 M EGTA pH neutro	Nacalai Tesque	08947-35	Para tampão de lise 2
Coquetel de inibidor de protease (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	Para bloquear a degradação do
tampão de proteína RIPA	Thermo Fisher Scientific	89900	Para lise celular e
lavagem milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Acessório do ultrassônico focalizado
	Covaris	S220 ou E220	Para digerir o DNA em tamanho adequado para ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	Para Tampão de eluição ChIP
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	Para purificar o DNA do lisado
Proteinase K, recombinante, PCR Grau	Sigma-Aldrich	3115887001	Para purificar o DNA do etanol lisado
	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Faça 70% de solução
Anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 produzido em camundongo	Sigma-Aldrich	F1804	Para purificar a cromatina expressa em células de interesse
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	Isso pode ser usado para anti-FLAG IP e anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-metil histona H3 (K4), anticorpo monoclonal de camundongo	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Qualquer outro anticorpo que funcione para análise ChIP funcionará
10x Reagente de bloqueio	Sigma-Aldrich	11096176001	Para bloqueio durante a purificação de afinidade
Denhardt' s solução	Nacalai Tesque	10727-74	Para bloqueio durante a purificação de afinidade
Glicogênio (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	Para purificar o DNA do lisado
Qubit 2.0 Fluorômetro	Thermo Fisher Scientific	Q32866	Para quantificação de DNA isolado
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Para quantificação de DNA isolado
Tubo de 0,5 mL	Axygen	10011-830	Para quantificação por Qubit
Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	Para purificar o DNA do lisado
AMPure XP grânulos	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnéticos para preparação de biblioteca
Rack de gelo de metal	Funakoshi	IR-1	Para manter o lisado celular congelado
Resfriador	de amostras New England Biolabs	T7771S	Ajuda a consertar células com danos mínimos
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Para verificar a qualidade de fragmentos de DNA isolados. Outro analisador de fragmentos pode ser usado.
Software Especialista Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	G2946CA	Fornecido com o
Kit de DNA de Alta Sensibilidade	Agilent Technologies	5067-4626	Para verificar a qualidade dos fragmentos de DNA isolados
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Fornecido com 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase e solução PEG/NaCl
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter para preparação de bibliotecas. Fornecido com adaptadores de código de barras de DNA e mistura de primer.
Kit de amplificação de biblioteca em tempo real KAPA	Roche	07959028001	Fornecido com 2x KAPA HiFi HS PCR em tempo real Master Mix, PCR Primer Mix e padrões fluorescentes
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	Para preparação de biblioteca. Além disso, esta enzima pode ser necessária para o KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8,5 para eluição de placa
qPCR de DNA de 386 poços	Thermo Fisher Scientific	4309849	Para PCR em tempo real
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	Para quantificar o DNA
MicroAmp Filme Adesivo Óptico	Thermo Fisher Scientific	4311971	Para PCR em tempo real
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	Para vedação de placas
Mistura			Combine 1.4 µ L de 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µ L de KAPA End Repair Enzyme Mix e 1,6 µ L de H2O
Master mix			Combine 1 µ L de tampão de cauda A KAPA, 0,6 µ L da enzima KAPA A-tailing e 8,4 µ L de H2O
		de tampão de ligação	Combine 2 µ L de tampão de ligadura KAPA e 6 µ L de H2O
		mestre de PCR em tempo real	Combine 5 µ L de 2x KAPA HiFi HS PCR Master Mix em tempo real, 0,35 µ L de Primer PCR Mix (10 µ M cada um dos primers diretos AATGATACGGCGACCACCGAG e primer reverso CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) e 3,15 µ L de mistura
			Combine 10 µ L de 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µ L de PCR Primer Mix e 0,6 µ L de H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Navegador do genoma para visualizar dados de sequenciamento
DNA olgionucleotídeo: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		Um primer para amplificar a região promotora do
olgionucleotídeo do DNA GAPDH: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		Um primer para amplificar a região promotora de GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	Para quantificar o DNA correspondente à região promotora de GADPH
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	Para quantificar o DNA correspondente à região promotora de GADPH

Para tubo de proteína LoBind de de Bioanalyzer mestre de reparo final A-taling Mistura Mistura mestra de PCR HO