Aqui, apresentamos um protocolo para tuberculose humana de modelo em um adulto zebrafish usando seu patógeno natural Mycobacterium marinum. Extraído DNA e RNA de órgãos internos de zebrafish infectado podem ser usado para revelar que o total micobacteriana carrega no peixe e as respostas de imune do hospedeiro com qPCR.
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Artigo de método
Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mycobacterium tuberculosis é atualmente o mais mortífero patógeno humano causando infecções 10,4 milhões e 1,7 milhões de mortes todos os anos. Exposição a esta bactéria faz com que um espectro largo de doença em seres humanos, que vão desde uma infecção esterilizada para uma doença mortal ativamente progredindo. A forma mais comum é a tuberculose latente, que é assintomática, mas tem o potencial para reativar a uma doença fulminante. Zebrafish adulto e seu patógeno natural Mycobacterium marinum recentemente provaram para ser um modelo aplicável para estudar o espectro de doença ampla de tuberculose. Importante, espontânea latência e reativação, bem como adaptáveis respostas imunes no contexto da infecção micobacteriana pode ser estudadas neste modelo. Neste artigo, descrevemos os métodos para a infecção experimental de zebrafish adulto, a coleção dos órgãos internos para a extração de ácidos nucleicos para a medição das cargas micobacterianas e acolhimento respostas imunes por PCR quantitativo. O in desenvolvido internamente, M. marinum -ensaio de qPCR específico é mais sensível que os métodos tradicionais de chapeamento como também detecta DNA de micobactérias não-dividindo, dormentes ou recentemente mortas. Como o DNA e o RNA são extraídos do mesmo indivíduo, é possível estudar as relações entre o estado doente e a expressão do gene hospedeiro e patógeno. O modelo adulto zebrafish para tuberculose, portanto, apresenta-se como um sistema altamente aplicável, não-mamíferos na vivo para estudar interações patógeno-hospedeiro.
Introdução
Peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal amplamente utilizado na investigação biomédica e é um modelo aceito para a biologia de vertebrados comum. O zebrafish foi adaptada a muitos campos de pesquisa modelagem de doenças humanas e desordens que variam de câncer1 e doença cardíaca2 a infecção e estudos imunológicos de várias bactérias 3 e infecções virais4 , 5. Além disso, o ex utero desenvolvimento de embriões de zebrafish fez o zebrafish um modelo popular em biologia do desenvolvimento-6 e tox....
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Protocolo
Todos os experimentos de zebrafish foram aprovados pelo Conselho de experimento Animal na Finlândia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos são executados de acordo com a lei (497/2013) e do Decreto do governo (564/2013), relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos ou educacionais na Finlândia.
1. cultivo de Mycobacterium marinum
Nota: Desde que o Mycobacterium marinum é um patógeno capaz de causar infecções superficiais nos seres humanos, descobrir as diretrizes locais para segurança pessoal e eliminação de resíduos de risco biológico antes de começar a trabalhar com esta bactéria.
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Resultados
O patógeno de peixe natural Mycobacterium marinum infecta os órgãos internos do peixe-zebra e produz uma infecção sistêmica com granulomas histologicamente visível19. Zebrafish adulto estão infectados com M. marinum por uma injeção intraperitoneal. O DNA e RNA são extraídos, e a carga de micobactérias é medida pela reacção em cadeia do polymerase quantitativa (qPCR) usando o DNA como o modelo. O contorno do método é mostrado na
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Discussão
Aqui nós descrevemos uma aplicação baseada em qPCR para medir micobacterianas cargas de DNA extraído de tecidos de zebrafish adultos infectados experimentalmente. Este aplicativo é baseado em cartilhas projetadas em torno do 16S-23S rRNA espaçador transcrito interno sequência40. A carga total de micobactérias em uma amostra de peixes é estimada usando uma curva padrão preparada a partir de DNA extraído de um número conhecido de micobactérias culturas e assumindo que uma bactéria tem uma cópia do s.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo finlandês Cultural Foundation (H.L.), Fundação de tuberculose de Tampere (H.L., L.-M.V., M.M.H, M.P.), Fundação da associação finlandesa de antituberculose (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H, M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (P.F.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H), Jane e Aatos Erkko Foundation (P.F.) e Academia da Finlândia (P.F.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo e Jenna Ilomäki são reconhecidos por sua assistência técnica. Os autores reconhecem o laboratório de Zebrafish de Tampere para seu serviço.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 ágar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enriquecimento | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Enriquecimento BD de Middlebrock ADC | , Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Espectrofotômetro GENESYS20 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Comprimidos salinos tamponados com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Agulha de fenol vermelho | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27 G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| seringa de 1 mL | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G agulha de insulina | Braun | 9151133 | |
| éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (pH 7,0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1,5 mL tubo de homogeneização | Qiagen | 13119-1000 | |
| grânulos cerâmicos de 2,8 mm | Qiagen | 13114-325 | |
| Etanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Clorofórmio | VWR | 22711.290 | |
| Tiocianato de guanidina | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118,2 g/mol |
| Citrato | de sódioSigma-Aldrich | 1613859 | FW 294,1 g/mol |
| Tris (base livre) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121,14 g/mol |
| TRI reagente | Centro de Pesquisa Molecular | TR118 | Solução de tiocianato-fenol de guanidina |
| Homogeneizador | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR Placa de 96 poços | BioRad | HSP9601 | |
| Filme opticamente transparente | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Termociclador com sistema em tempo real CFX96 | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | Reagente | de descontaminação 10666421 eliminando RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Master Mix de Transcrição Reversa | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
Referências
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80(2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S.
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Reimpressões e permissões
