Aqui nós apresentamos um protocolo para fabricar um rim córtex extracelulares matriz-derivado hidrogel para manter a composição de estruturais e bioquímicos de matriz extracelular (ECM) do rim nativo. O processo de fabricação e suas aplicações são descritas. Finalmente, uma perspectiva sobre como usar este hidrogel para apoiar a bioengenharia e a regeneração celular e tecido de rim-específicas é discutida.
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Artigo de método
Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel
Neste artigo
Resumo
Resumo
Matriz extracelular (ECM) fornece importantes pistas biofísicas e bioquímicas para manter a homeostase do tecido. Hidrogel sintético atual oferece suporte mecânico robusto em vitro cultura de células, mas falta a composição de proteínas e ligante necessária para eliciar comportamentos fisiológicos das células. Este manuscrito descreve um método de fabricação para um hidrogel de ECM-derivado de córtex renal com robustez mecânica adequada e apoia composição bioquímica. O hidrogel é fabricada por mecanicamente, homogeneizando e solubilizing córtex renal humana decellularized ECM. A matriz preserva rácios de proteína nativa renal córtex ECM, permitindo também a criação de gelificação para stiffnesses mecânicas fisiológicas. O hidrogel serve como substrato ao qual nos rins córtex-derivado de células podem ser mantidas sob condições fisiológicas. Além disso, a composição de hidrogel pode ser manipulada para modelar um ambiente de doente que permite o estudo futuro das doenças renais.
Introdução
Matriz extracelular (ECM) fornece importantes pistas biofísicas e bioquímicas para manter a homeostase do tecido. A composição molecular complexa regula propriedades estruturais e funcionais do tecido. Proteínas estruturais fornecem células com consciência espacial e permitam a migração e adesão1. Ligantes acoplados interagem com receptores de superfície celular para controlar o comportamento de célula2. Rim ECM contém uma infinidade de moléculas cuja composição e estrutura varia dependendo da localização anatômica, grau de desenvolvimento e doença estado3,4. Rec....
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Protocolo
Rins humanos foram isolados por LifeCenter noroeste seguindo as diretrizes éticas, definidas pela Associação de organizações de contratos órgão. Este protocolo segue animais cuidados e célula cultura diretrizes delineadas pela Universidade de Washington.
1. preparação do tecido do rim humano
- Preparação da solução de decellularization
- Esterilize um copo de 5000 mL e uma barra de agitação de 70 x 10mm.
- Misture 1: 1000 (peso: volume) Dodecil sulfato de sódio (SDS) em água desionizada esterilizada no copo. Deixe a solução em uma placa de agitação em aproximadamente 200 rpm para 24h ou até o SDS é completamente disso....
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Resultados
O hidrogel de kECM fornece uma matriz para cultura de células de rim com composição química similar como o microambiente de rim nativo. Para fabricar o hidrogel, tecido de córtex renal é mecanicamente isolado de um órgão de rim e cubos (Figura 1). Decellularization com um detergente químico (Figura 2AA..1-3), seguido de lavagens com água para remover partículas de detergente (Figura 2A
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Discussão
Matrizes fornecem importantes dicas mecânicas e químicas que regem o comportamento da célula. Hidrogel sintético é capazes de apoiar a padronização 3-dimensional complexa mas não apresentar as diversas pistas extracelulares encontradas no microambiente matriz fisiológica. Hidrogel derivado de ECM nativo é materiais ideais para estudos tanto in vivo e in vitro . Estudos anteriores usaram decellularized ECM hidrogel para revestir biomateriais sintéticos para evitar33,hos.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de reconhecer a Lynn e Mike Garvey Imaging laboratório do Instituto de células-tronco e medicina regenerativa e LifeCenter noroeste. Eles também gostaria de agradecer o apoio financeiro da National Institutes of Health subvenções, UH2/UH3 TR000504 (de J.H.) e DP2DK102258 (para Y.Z.), NIH T32 formação grant DK0007467 (R.J.N.) e um presente sem restrições os centros de rim do noroeste para o Instituto de pesquisa do rim.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Preparação de tecido renal | |||
| 5000 mL Copo | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Estéril H2O | Autoclavado DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| Filtro de vácuo de 500 mL | VWR | 97066-202 | |
| Placa de agitação | Sigma-Aldrich | CLS6795420D Copo | |
| 1000 mL | CLS10031L | Sigma-Aldrich | |
| F4642 | Qualquer pinça semelhante pode ser usada | ||
| Grampo de hemostato com cabo de tesoura | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Tesoura de dissecação | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Cabo de bisturi, No. 4 | VWR | 25859-000 | Qualquer cabo de bisturi semelhante pode ser usado |
| Lâmina de bisturi, No. 20 | VWR | 25860-020 | Qualquer lâmina de bisturi semelhante pode ser usada |
| Barra de agitação (38,1 x 9,5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorvente Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Placa de Petri (150 x 25 mm) | Saco | autoclavável para risco biológico Corning 430597 | |
| VWR | 14220-026 | ||
| Filtro de células estéreis (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Grau de cultura de células Água | HyClone | SH30529.03 | |
| Tubo independente de 30 mL | VWR | 89012-778 | |
| Fabricação de Máquina Homogeneizadora de Gel ECM < / forte > | |||
| Sigma-Aldrich | V7130 | ||
| (15,9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Sigma-Aldrich | P7012 | ||
| 0,01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Diluir para 0,01 N HCl com cultura celular |
| águaRim ECM Gelação | |||
| 1 N NaOH (Estéril) | Sigma-Aldrich | 415413 | Diluir para 1 N em água de grau de cultura celular |
| Meio 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Tubo Cônico | ThermoFisher | 339651 | |
| Meio de Cultura de Células | ThermoFisher | 11330.032 | Meio de Águia Modificado de Dulbecco: Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12) |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiótico-Antimicótico 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Solução de Insulina, Transferrina, Selênio, Piruvato de Sódio ( ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| Seringa de 1 mL | Microespátula Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Sigma-Aldrich | Z193208 |
Referências
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H.
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Reimpressões e permissões
