Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza

Apoptose, uma forma bem estudada de morte celular programada, é necessário para manter a homeostase fisiológica e remover células potencialmente prejudiciais dentro do corpo humano¹. Após a indução da apoptose, pilhas apoptotic (ApoCells) podem se submeter a uma série de alterações morfológicas e desmontar em pequenas vesículas de membrana-limite denominadas ApoBDs. Em geral, este processo é conhecido como desmontagem de célula apoptótica e pode ser dividido em 3 etapas distintas, com base na morfologia^2,3. Passo 1 (membrana plasmática blebbing) é caracterizado pela formação de balão-como estruturas na superfície das células, conhecido como blebs^4,5. Passo 2 (formação de protrusão de apoptotic) inclui a formação de saliências longa membrana tais como apoptopodia, apoptopodia-frisado e microtubule picos^6,7,8. Por último, etapa 3 (formação ApoBD) inclui a fragmentação do apoptotic saliências e/ou ApoCells para gerar ApoBDs^6,9. Achados anteriores sugeriram um papel de ApoBDs em ajudar o afastamento de célula apoptótica e mediando a comunicação intercelular. Por exemplo, propõe-se que a fragmentação de um ApoCell em ApoBDs pode gerar pequenos pedaços 'pequenos' que podem ser facilmente removidos, envolvendo os fagócitos^2,10,11. Além disso, os ApoBDs podem abrigar uma série de biomoléculas, tais como DNA, RNA e proteínas, que podem ser traficadas para células circundantes para facilitar a célula-célula comunicação^12,13,14. Para funcionalmente investigar esses processos, é vital para confirmar três parâmetros-chave incluindo (i) validação de indução de apoptose e formação de ApoBD, (ii) isolamento de ApoBDs e (iii) confirmação da pureza de ApoBD.

Anteriormente, um número de métodos, incluindo citometria de fluxo e microscopia eletrônica tem sido costumava estudar apoptose e ApoBDs^15,16,17,18. No entanto, quantificação e deteção de ApoBD são muitas vezes difíceis ou negligenciado. Por exemplo, a apoptose de baseados em citometria de fluxo mais rotineiramente usados do ensaio emprega anexina V (A5, uma proteína que se liga a exteriorizados ' comer-me' sinal fosfatidilserina (PtdSer)) e ácido nucleico mancha propidium iodeto (PI)¹⁹. No entanto, usando esta combinação de mancha universal, análise pressupõe que existem apenas três tipos de subconjuntos de células (células viáveis, ApoCells e necróticas células) na amostra. Além disso, embora considerado como "padrão ouro" por muitos pesquisadores por apoptose, ensaios de citometria de fluxo e análise de dados subsequentes muitas vezes exclui ApoBDs através de um passo inicial associado selecionar eventos de^{intermediário-elevado} do FSC/SSC. Portanto, temos recentemente desenvolvido um ensaio de citometria de fluxo romance usando A5 e TO-PRO-3,^7,20canais de outra mancha de ácidos nucleico pode ser seletivamente absorvida por caspase 3/7-ativado pannexin 1 (PANX1). Como caspase 3-induzida PANX1 ativação precede PtdSer exposição a fase inicial da apoptose, TO-PRO-3 manchas diferencialmente apoptotic e células necróticas. Além disso, essa abordagem combinada com nosso romance gating estratégia inclui eventos todos adquiridos durante a análise de dados e como resultado, seis subconjuntos de célula/partícula são identificados, incluindo: (i) células viáveis (FSC/SSC^{intermediário/alto}, A5^baixa , TO-PRO-3^baixa), (ii) A5^– ApoCells precoce (FSC/SSC^{intermediário/alto}, A5^baixo,^{intermediário}TO-PRO-3), (iii) A5⁺ ApoCells (FSC/SSC^{intermediário/alto}, A5^alta , TO-PRO-3^{intermediário}), (iv) necróticas células ou tarde ApoCells (FSC/SSC^{intermediário/alto}, A5^alta,^altaTO-PRO-3), (v) ApoBDs (FSC/SSC^baixa, A5^{intermediário}, TO-PRO-3^{baixa / intermediárias}) e (vi) detritos (FSC/SSC^baixa, A5^baixo, TO-PRO-3^baixo)²⁰. Nossa abordagem enfatiza a importância de analisar todos os subconjuntos de células/partícula e, mais importante, a separação do ApoBDs de células e detritos²⁰. Assim, essa abordagem demonstra uma técnica eficiente para validar a indução de apoptose e formação ApoBD simultaneamente.

Tradicionalmente, ApoBDs foram isolados através de uma variedade de abordagens de centrifugação diferencial, pelo qual ApoBDs podem ser separadas das células ou outras vesículas extracelulares, com base na densidade. No entanto, tais métodos de centrifugação são muitas vezes limitados pela baixa pureza de ApoBD, falta de uma etapa de quantificação para confirmar a pureza da amostra, e/ou incapacidade de separar as células específicas do tipo ApoBDs^17,21,22. Portanto, desenvolvemos recentemente duas abordagens, uma baseada em FACS e uma nova diferencial centrifugação abordagem baseada que pode ser acoplada com o nosso método de citometria de fluxo estabelecido anteriormente para validar a indução de apoptose e amostra de pureza²³. ApoBD isolamento através de nossa abordagem baseada em FACS pode enriquecer ApoBDs para até 99% de pureza e pode ser acoplado com uma variedade de anticorpos de tipo específico de célula para isolar ApoBDs de populações de células mistas, amostras de tecidos e fluidos corporais²³. Além disso, nossa abordagem de centrifugação diferencial revisada demonstra um método eficiente para isolar ApoBDs a > 90% de pureza²³.

Neste trabalho, descrevemos em detalhes nosso procedimento experimental para validar a indução de apoptose e para detectar e quantificar a formação de ApoBD. Os fluxos de trabalho de isolamento ApoBD usando métodos baseados em centrifugação de FACS-baseado e diferenciais também são elaborados e comparados. Os dados representativos demonstram que a metodologia descrita fornece uma ferramenta eficaz de ponta para estudos futuros ApoBD.

1. indução da apoptose

1. Centrifugar a amostra de célula a 300 x g por 5 min e descartar o sobrenadante para remover os detritos de células pré-existentes.
   Nota: Quando utilizar células aderentes, células de sementes com antecedência e lave com 1 x solução de tampão fosfato (PBS) antes da indução de apoptose.
2. Determinar o número do celular e coletar as células.
   Nota: Dependendo do pós-isolamento ensaio, recomendamos um número de celular inicial de pelo menos 1 x 10⁷ células.
3. Resuspenda em mídia completa (respectivo meio contendo soro fetal bezerro de 10% (vol/vol), penicilina 50 UI/mL, 50 µ g/mL de mistura de estreptomicina) para uma concentração final de 1 x 10⁶ células/mL.
4. Alíquota ~ 2 x 10⁶ células por poço de um prato bem 6.
5. Para induzir apoptose, retire a tampa da placa e irradiar as células em 150 mJ/cm² , usando uma difusora de UV. Isso deve levar cerca de 30-60 s.
   Nota: Antes da irradiação, certifique-se que ~0.5 x 10⁶ células são retidas para o controle de célula 'Untreated'.
   Nota: Apoptose pode também ser induzidas através de outros métodos, como anti-Fas ou soro fome⁶.
6. Incube a 37° C, 5% de CO₂ para 2-8 horas, dependendo da linhagem celular.
7. Usando um microscópio de luz superior do banco, visualize as células para confirmar a presença de apoptotic morfologias, como blebbing, formação de apoptopodia e formação de ApoBD.
   Nota: a ampliação de X 40 é suficiente
8. Usando uma pipeta P1000, pipetar e coletar amostras de apoptotic.
9. Lavar a placa com PBS 1x e combinam com a amostra restante para garantir o rendimento máximo.
10. Coletar ~1/10^th 'Toda Apoptotic no exemplo' (WAS) de controle.
11. Colete a amostra 'Tratada'.
12. Centrifugue o WAS e o Untreated amostras a 3.000 x g, durante 6 min.
13. Resuspenda em 1 mL de 1X PBS e reserve no gelo.
14. Para isolamento de ApoBD, continue a qualquer passo 2 ou 3 com a amostra de apoptotic existente.

2. ApoBD isolamento através de FACS

1. Centrifugar a amostra inteira a 3.000 x g, durante 6 min.
2. Remova a maioria do líquido sobrenadante sem perturbar o sedimento.
3. Resuspenda em uma solução de coloração contendo 1 mL de 1 tampão de ligação x A5, 75 µ l de A5-FITC e 2 µ l de TO-PRO-3 por 1 x 10⁷ células.
4. Incube a amostra no escuro à temperatura ambiente por 10 min.
5. Adicionar 1 a 2 mL de tampão de ligação 1 x A5 e centrifugar a amostra a 3.000 x g, durante 6 min remover a mancha excesso.
   Nota: Para populações de células mistas ou amostras de tecido, executar um anticorpo que mancha passo usando uma combinação de marcadores do tipo específico de célula em 1 tampão de ligação x A5 e incubar no gelo por 20 min (ou conforme o protocolo do fabricante) antes de centrifugação a 3.000 x g, durante 6 min.
6. Resuspenda o pellet de amostra em 3 mL de tampão de FACS (1X PBS, 1 tampão de ligação x A5, 10% FSC, 2 mM EDTA) por 1 x 10⁷ células.
7. Filtrar através de um filtro de célula 70 µm para um fundo redondo, tubo de polipropileno (citometria de fluxo) e manter as amostras no gelo e no escuro.
8. Ligar a máquina de FACS e executar conjunto padrão usando um bocal de 100 µm, executar o atraso de entrega e garantir um fluxo estável.
9. Carregar a amostra e definir a velocidade de aquisição de ~ 1000 eventos/s.
10. Ajustar o FSC, SSC, APC (PRO-TO-3) e tensões FITC (A5) e eventos de posição dentro as parcelas de FACS para garantir as populações podem ser claramente separados.
11. Registre eventos de 20.000.
12. Defina uma estratégia associada como em parte 4.
13. No layout tipo, adicione o portão ApoBD final como a população de classificação desejada.
14. Começam a adquirir a amostra e realizar uma espécie de teste através da recolha de 5.000-10.000 ApoBDs em um novo tubo contendo tampão de FACS ~ 250 µ l.
15. Executar um sistema volta a descarga e carga classificada ApoBDs.
16. Adquirir e gravar teste-tipo ApoBDs.
17. Verifique a pureza de ApoBD é ~ 99% comparando FSC (eixo y) vs A5 (eventos de eixo x).
    Nota: A5 coloração pode reduzir ligeiramente quando re-analisar amostras devido à laser branqueamento.
18. Depois de alta pureza é alcançada, carregar a amostra original e continuar a classificação até o número desejado de ApoBDs tenha sido obtido.
    Nota: Se necessário, dupla classificação pode ser realizada para isolar simultaneamente ApoCells e ApoBDs.
    Nota: Ao classificar por um longo período de tempo, recomenda-se Incubar o tubo de coleta a 4 ° C.
19. Quando a classificação for concluído, coletar uma pequena parcela do pós-tipo ApoBDs, pós-classificar ApoCells, Untreated e WAS para validar a apoptose e confirmar pós-tipo pureza.
    Nota: Embora o teste-tipo e pós-tipo pureza não devem diferir significativamente, isto é baseado em configurações de fluxo e estabilidade.

3. ApoBD isolamento através de centrifugação diferencial

1. Centrifugar a amostra de apoptotic existente em 300 x g durante 10 minutos.
2. Recolher o sobrenadante, deixando ~ 500 µ l para não perturbar o centrifugado e adicionar em um novo tubo cônico de 15 mL.
3. Remova os restantes 500 µ l e ressuspender as células em 2 mL de 1X PBS (o que representa a fração de' ApoCell-enriquecido'.
4. Centrifugue o sobrenadante coletado por 20 min a 3.000 g.
5. Procurem uma pelota e remova cuidadosamente o sobrenadante (líquido sobrenadante pode conter pequenas vesículas extracelulares, incluindo microvesicles e exosomes).
6. Resuspenda o pellet em 1 mL de 1X PBS (o que representa a fração de 'ApoBD-enriquecido')
7. Colete 100 µ l de cada viável, WAS, enriquecido em ApoCell e ApoBD-enriquecido de amostras em um novo fundo redondo, tubo de poliestireno (citometria de fluxo).
8. Adicione 100 µ l de mancha contendo tampão de ligação 2 x A5, 1: 100 A5-FITC e 1:1,000 TO-PRO-3
9. Incube a temperatura ambiente por 10 min no escuro.
10. Analise as amostras por citometria de fluxo, usando a estratégia associada como descrito acima para validar a sucesso indução da apoptose e pureza da fração enriquecida com ApoBD.

4. fluxo Cytometry Gating estratégia

1. Plot TO-PRO-3 (eixo y) contra FSC (eixo x) para separar as células necróticas (TO-PRO-3^alta) de todos os outros eventos não-permeabilizado (TO-PRO-3^{baixo/intermediário}).
2. Selecione todos os eventos não-permeabilizado e plotar SSC contra A5. Portão de duas populações, incluindo população 1 (P1), SSC^{intermediário/alto}, A5^{baixo/intermediário} células e população 2 (P2), todos os outros eventos.
3. De P2, plot TO-PRO-3 contra o A5 e selecione eventos de^{intermediário/alto} A5 para excluir todos os detritos de células.
4. Selecione todos os eventos positivos do A5 e plotar FSC contra A5. Separe (FSC^baixa) ApoBDs ApoCells (FSC^{intermediário/alto}).
   Nota: Quando a retenção de ApoBDs para ApoBD de isolamento através da abordagem baseada em FACS, recomendamos uma etapa final selecionando ApoBDs e comparando TO-PRO-3 para A5 e selecionando todos os eventos. Isso garante que o portal classificação final usa fluorescência em vez de parâmetros FSC/SSC.
5. Para análise de células viáveis, selecione P1 e execute uma das duas estratégias associadas. Para análise de células viáveis geral, plotar FSC contra A5 e selecione todas as células de^{intermediário/alto} FSC, portanto, removendo detritos de células restantes. Como alternativa, para uma análise aprofundada, células viáveis podem ser separadas da A5^– ApoCells início plotando TO-PRO-3 contra o FSC. Selecionar TO-PRO-3^baixa, as células viáveis de^{intermediário/alto} do FSC e TO-PRO-3^{intermediário}, FSC^{intermediário/alto} A5^– ApoCells cedo.

Usando o procedimento descrito aqui, THP-1 monócito apoptose foi induzido e ApoBDs foram detectados e isolados através um FACS-baseado ou uma abordagem de centrifugação diferencial (Figura 1). Em primeiro lugar, apoptose foi induzida por irradiação UV e as amostras foram coletadas após 2-3 h de incubação, quando demonstrado de células apoptóticas morfologias, incluindo blebbing, formação de protrusão da membrana apoptotic e a geração de ApoBDs6. Um método de citometria de fluxo baseados em A5 e TO-PRO-3 foi usado para confirmar a indução de apoptose de monócitos e formação de ApoBD, separando as células viáveis, células necróticas, cedo ApoCells, ApoCells, ApoBDs e detritos (Figura 2). Tomados em conjunto, a análise de citometria de fluxo indicado que o tratamento UV resulta em ~ 20% ApoCells (Figura 3).

THP-1 monócito ApoBDs foram então isoladas do WAS através de duas abordagens. Em primeiro lugar, as amostras foram preparadas para uma abordagem baseada em FACS, onde apenas uma etapa de centrifugação única é necessário para a amostra inteira apoptotic de pelotas antes de coloração de alta pureza e FACS. Este método é apropriado para os ensaios funcionais quando significativamente amostra alta pureza é necessária (por exemplo, para análise de qPCR), quando é necessário um número específico de ApoBDs ou quando adquirir de células específicas do tipo ApoBDs de uma amostra complexa. Usando esta metodologia, ApoBDs foram isoladas para ~ 99% de pureza (Figura 4).

Em seguida, THP-1 monócito ApoBDs também foram isolados através de um Two-Step, abordagem de centrifugação diferencial. A primeira etapa inclui o isolamento de células viáveis, ApoCells e células necróticas. A segunda etapa inclui a separação do ApoBDs maior de pequenas vesículas extracelulares como microvesicles e exosomes, que são incapazes de ser peletizado em 3.000 x g. citometria de fluxo realizou-se em seguida para confirmar a pureza de amostra de ApoBD e indução de apoptose e demonstrou uma amostra enriquecida com ApoBD contendo ~ 97% ApoBDs (Figura 4). Isto apresenta uma técnica rápida e eficaz para isolar ApoBD de pureza relativamente elevada e é apropriado quando a purificação ApoBDs de amostras contendo um único tipo de células.

Figura 1 . Diagrama esquemático de isolamento ApoBD através de qualquer um abordagem de centrifugação diferencial ou baseados em FACS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Estratégia de retenção de citometria de fluxo. Seis subconjuntos de célula/partícula (incluindo células viáveis, A5– ApoCells cedo, A5+ ApoCells, células necróticas, ApoBDs e detritos) foram identificados e usado para selecionar ApoBD de FACS de isolamento. (a) células necróticas do membrana permeabilised são separadas dos eventos não-permeabilised. células (b) A5baixo intermediário, SSCbaixo-alto são separadas dos eventos debaixo-alto A5. (b. i) para em análise aprofundada, TO-POR-3 células viáveisbaixa podem ser separadas da TO-PRO-3intermediário A5– ApoCells cedo. (b. II) alternativamente, simplesmente cálculo ApoBD pureza, células viáveis podem ser separadas dobaixo eventos FSC. (c) excluem-se os restos debaixo A5. (d) FSCintermediário/alto ApoCells são separados do FSCbaixa ApoBDs. (e) todos os A5-a-PRO-3intermediário/alto ApoBDs são selecionados para classificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 3 . Validação do THP-1 monócito apoptose. Realizou-se análise de citometria de fluxo de não tratados ou irradiados UV monócitos THP-1 para determinar os níveis de células viáveis, A5– ApoCells cedo, A5+ ApoCells e as células necróticas.

Figura 4 . Purificação do THP-1 monócito-derivado ApoBDs. Análise de citometria de fluxo foi realizada na isolada THP-1 monócito-derivado ApoBDs através de qualquer uma abordagem de centrifugação diferencial ou FACS-baseado baseada, mostrando o enriquecimento de ApoBDs de células viáveis, ApoCells e células necróticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.