É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza

10.7K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/58317

⸱

12 de agosto de 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Genetics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Neste artigo

Resumo

Um fluxo de trabalho usando a centrifugação diferencial ou citometria de fluxo é desenvolvido para detectar, quantificar e isolar corpos apoptotic de uma amostra de apoptotic de alta pureza.

Resumo

Corpos apoptotic (ApoBDs), microvesicles e exosomes são os principais membros da família vesículas extracelulares, com ApoBDs sendo um dos maior tipo. Tem sido proposto que a ApoBDs pode ajudar apuramento da célula, bem como a comunicação intercelular através do tráfico de biomoléculas. Abordagens convencionais utilizadas para a identificação e isolamento de ApoBDs são muitas vezes limitadas pela falta de quantificação exata e pureza da amostra de baixo. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho para confirmar a indução da apoptose, validar a formação ApoBD e isolar ApoBDs de alta pureza. Nós também irá delinear e comparar fluorescência-ativado da pilha (FACS) de triagem e centrifugação diferencial com base em abordagens para isolar ApoBDs. Além disso, a pureza de ApoBDs isoladas será confirmada usando um estabelecer previamente a coloração de baseados em citometria de fluxo e o método analítico. Tomados em conjunto, utilizando a abordagem descrita, THP-1 monócito apoptose e apoptose celular desmontagem foi induzida e validada, e ApoBD, gerado a partir de monócitos THP-1 foram isolados de uma pureza de 97-99%.

Introdução

Apoptose, uma forma bem estudada de morte celular programada, é necessário para manter a homeostase fisiológica e remover células potencialmente prejudiciais dentro do corpo humano1. Após a indução da apoptose, pilhas apoptotic (ApoCells) podem se submeter a uma série de alterações morfológicas e desmontar em pequenas vesículas de membrana-limite denominadas ApoBDs. Em geral, este processo é conhecido como desmontagem de célula apoptótica e pode ser dividido em 3 etapas distintas, com base na morfologia2,3. Passo 1 (membrana plasmática blebbing) é caracterizado pela formação de balão-como estruturas na superfície das células, conhecido como blebs4,5. Passo 2 (formação de protrusão de apoptotic) inclui a formação de saliências longa membrana tais como apoptopodia, apoptopodia-frisado e microtubule picos6,7,8. Por último, etapa 3 (formação ApoBD) inclui a fragmentação do apoptotic saliências e/ou ApoCells para gerar ApoBDs6,9. Achados anteriores sugeriram um papel de ApoBDs em ajudar o afastamento de célula apoptótica e mediando a comunicação intercelular. Por exemplo, propõe-se que a fragmentação de um ApoCell em ApoBDs pode gerar pequenos pedaços 'pequenos' que podem ser facilmente removidos, envolvendo os fagócitos2,10,11. Além disso, os ApoBDs podem abrigar uma série de biomoléculas, tais como DNA, RNA e proteínas, que podem ser traficadas para células circundantes para facilitar a célula-célula comunicação12,13,14. Para funcionalmente investigar esses processos, é vital para confirmar três parâmetros-chave incluindo (i) validação de indução de apoptose e formação de ApoBD, (ii) isolamento de ApoBDs e (iii) confirmação da pureza de ApoBD.

Anteriormente, um número de métodos, incluindo citometria de fluxo e microscopia eletrônica tem sido costumava estudar apoptose e ApoBDs15,16,17,18. No entanto, quantificação e deteção de ApoBD são muitas vezes difíceis ou negligenciado. Por exemplo, a apoptose de baseados em citometria de fluxo mais rotineiramente usados do ensaio emprega anexina V (A5, uma proteína que se liga a exteriorizados ' comer-me' sinal fosfatidilserina (PtdSer)) e ácido nucleico mancha propidium iodeto (PI)19. No entanto, usando esta combinação de mancha universal, análise pressupõe que existem apenas três tipos de subconjuntos de células (células viáveis, ApoCells e necróticas células) na amostra. Além disso, embora considerado como "padrão ouro" por muitos pesquisadores por apoptose, ensaios de citometria de fluxo e análise de dados subsequentes muitas vezes exclui ApoBDs através de um passo inicial associado selecionar eventos deintermediário-elevado do FSC/SSC. Portanto, temos recentemente desenvolvido um ensaio de citometria de fluxo romance usando A5 e TO-PRO-3,7,20canais de outra mancha de ácidos nucleico pode ser seletivamente absorvida por caspase 3/7-ativado pannexin 1 (PANX1). Como caspase 3-induzida PANX1 ativação precede PtdSer exposição a fase inicial da apoptose, TO-PRO-3 manchas diferencialmente apoptotic e células necróticas. Além disso, essa abordagem combinada com nosso romance gating estratégia inclui eventos todos adquiridos durante a análise de dados e como resultado, seis subconjuntos de célula/partícula são identificados, incluindo: (i) células viáveis (FSC/SSCintermediário/alto, A5baixa , TO-PRO-3baixa), (ii) A5– ApoCells precoce (FSC/SSCintermediário/alto, A5baixo,intermediárioTO-PRO-3), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermediário/alto, A5alta , TO-PRO-3intermediário), (iv) necróticas células ou tarde ApoCells (FSC/SSCintermediário/alto, A5alta,altaTO-PRO-3), (v) ApoBDs (FSC/SSCbaixa, A5intermediário, TO-PRO-3baixa / intermediárias) e (vi) detritos (FSC/SSCbaixa, A5baixo, TO-PRO-3baixo)20. Nossa abordagem enfatiza a importância de analisar todos os subconjuntos de células/partícula e, mais importante, a separação do ApoBDs de células e detritos20. Assim, essa abordagem demonstra uma técnica eficiente para validar a indução de apoptose e formação ApoBD simultaneamente.

Tradicionalmente, ApoBDs foram isolados através de uma variedade de abordagens de centrifugação diferencial, pelo qual ApoBDs podem ser separadas das células ou outras vesículas extracelulares, com base na densidade. No entanto, tais métodos de centrifugação são muitas vezes limitados pela baixa pureza de ApoBD, falta de uma etapa de quantificação para confirmar a pureza da amostra, e/ou incapacidade de separar as células específicas do tipo ApoBDs17,21,22. Portanto, desenvolvemos recentemente duas abordagens, uma baseada em FACS e uma nova diferencial centrifugação abordagem baseada que pode ser acoplada com o nosso método de citometria de fluxo estabelecido anteriormente para validar a indução de apoptose e amostra de pureza23. ApoBD isolamento através de nossa abordagem baseada em FACS pode enriquecer ApoBDs para até 99% de pureza e pode ser acoplado com uma variedade de anticorpos de tipo específico de célula para isolar ApoBDs de populações de células mistas, amostras de tecidos e fluidos corporais23. Além disso, nossa abordagem de centrifugação diferencial revisada demonstra um método eficiente para isolar ApoBDs a > 90% de pureza23.

Neste trabalho, descrevemos em detalhes nosso procedimento experimental para validar a indução de apoptose e para detectar e quantificar a formação de ApoBD. Os fluxos de trabalho de isolamento ApoBD usando métodos baseados em centrifugação de FACS-baseado e diferenciais também são elaborados e comparados. Os dados representativos demonstram que a metodologia descrita fornece uma ferramenta eficaz de ponta para estudos futuros ApoBD.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. indução da apoptose

  1. Centrifugar a amostra de célula a 300 x g por 5 min e descartar o sobrenadante para remover os detritos de células pré-existentes.
    Nota: Quando utilizar células aderentes, células de sementes com antecedência e lave com 1 x solução de tampão fosfato (PBS) antes da indução de apoptose.
  2. Determinar o número do celular e coletar as células.
    Nota: Dependendo do pós-isolamento ensaio, recomendamos um número de celular inicial de pelo menos 1 x 107 células.
  3. Resuspenda em mídia completa (respectivo meio contendo soro fetal bezerro de 10% (vol/vol), penicilina 50 UI/mL, 50 µ g/mL de mistura de estreptomicina) para uma concentração final de 1 x 106 células/mL.
  4. Alíquota ~ 2 x 106 células por poço de um prato bem 6.
  5. Para induzir apoptose, retire a tampa da placa e irradiar as células em 150 mJ/cm2 , usando uma difusora de UV. Isso deve levar cerca de 30-60 s.
    Nota: Antes da irradiação, certifique-se que ~0.5 x 106 células são retidas para o controle de célula 'Untreated'.
    Nota: Apoptose pode também ser induzidas através de outros métodos, como anti-Fas ou soro fome6.
  6. Incube a 37° C, 5% de CO2 para 2-8 horas, dependendo da linhagem celular.
  7. Usando um microscópio de luz superior do banco, visualize as células para confirmar a presença de apoptotic morfologias, como blebbing, formação de apoptopodia e formação de ApoBD.
    Nota: a ampliação de X 40 é suficiente
  8. Usando uma pipeta P1000, pipetar e coletar amostras de apoptotic.
  9. Lavar a placa com PBS 1x e combinam com a amostra restante para garantir o rendimento máximo.
  10. Coletar ~1/10th 'Toda Apoptotic no exemplo' (WAS) de controle.
  11. Colete a amostra 'Tratada'.
  12. Centrifugue o WAS e o Untreated amostras a 3.000 x g, durante 6 min.
  13. Resuspenda em 1 mL de 1X PBS e reserve no gelo.
  14. Para isolamento de ApoBD, continue a qualquer passo 2 ou 3 com a amostra de apoptotic existente.

2. ApoBD isolamento através de FACS

  1. Centrifugar a amostra inteira a 3.000 x g, durante 6 min.
  2. Remova a maioria do líquido sobrenadante sem perturbar o sedimento.
  3. Resuspenda em uma solução de coloração contendo 1 mL de 1 tampão de ligação x A5, 75 µ l de A5-FITC e 2 µ l de TO-PRO-3 por 1 x 107 células.
  4. Incube a amostra no escuro à temperatura ambiente por 10 min.
  5. Adicionar 1 a 2 mL de tampão de ligação 1 x A5 e centrifugar a amostra a 3.000 x g, durante 6 min remover a mancha excesso.
    Nota: Para populações de células mistas ou amostras de tecido, executar um anticorpo que mancha passo usando uma combinação de marcadores do tipo específico de célula em 1 tampão de ligação x A5 e incubar no gelo por 20 min (ou conforme o protocolo do fabricante) antes de centrifugação a 3.000 x g, durante 6 min.
  6. Resuspenda o pellet de amostra em 3 mL de tampão de FACS (1X PBS, 1 tampão de ligação x A5, 10% FSC, 2 mM EDTA) por 1 x 107 células.
  7. Filtrar através de um filtro de célula 70 µm para um fundo redondo, tubo de polipropileno (citometria de fluxo) e manter as amostras no gelo e no escuro.
  8. Ligar a máquina de FACS e executar conjunto padrão usando um bocal de 100 µm, executar o atraso de entrega e garantir um fluxo estável.
  9. Carregar a amostra e definir a velocidade de aquisição de ~ 1000 eventos/s.
  10. Ajustar o FSC, SSC, APC (PRO-TO-3) e tensões FITC (A5) e eventos de posição dentro as parcelas de FACS para garantir as populações podem ser claramente separados.
  11. Registre eventos de 20.000.
  12. Defina uma estratégia associada como em parte 4.
  13. No layout tipo, adicione o portão ApoBD final como a população de classificação desejada.
  14. Começam a adquirir a amostra e realizar uma espécie de teste através da recolha de 5.000-10.000 ApoBDs em um novo tubo contendo tampão de FACS ~ 250 µ l.
  15. Executar um sistema volta a descarga e carga classificada ApoBDs.
  16. Adquirir e gravar teste-tipo ApoBDs.
  17. Verifique a pureza de ApoBD é ~ 99% comparando FSC (eixo y) vs A5 (eventos de eixo x).
    Nota: A5 coloração pode reduzir ligeiramente quando re-analisar amostras devido à laser branqueamento.
  18. Depois de alta pureza é alcançada, carregar a amostra original e continuar a classificação até o número desejado de ApoBDs tenha sido obtido.
    Nota: Se necessário, dupla classificação pode ser realizada para isolar simultaneamente ApoCells e ApoBDs.
    Nota: Ao classificar por um longo período de tempo, recomenda-se Incubar o tubo de coleta a 4 ° C.
  19. Quando a classificação for concluído, coletar uma pequena parcela do pós-tipo ApoBDs, pós-classificar ApoCells, Untreated e WAS para validar a apoptose e confirmar pós-tipo pureza.
    Nota: Embora o teste-tipo e pós-tipo pureza não devem diferir significativamente, isto é baseado em configurações de fluxo e estabilidade.

3. ApoBD isolamento através de centrifugação diferencial

  1. Centrifugar a amostra de apoptotic existente em 300 x g durante 10 minutos.
  2. Recolher o sobrenadante, deixando ~ 500 µ l para não perturbar o centrifugado e adicionar em um novo tubo cônico de 15 mL.
  3. Remova os restantes 500 µ l e ressuspender as células em 2 mL de 1X PBS (o que representa a fração de' ApoCell-enriquecido'.
  4. Centrifugue o sobrenadante coletado por 20 min a 3.000 g.
  5. Procurem uma pelota e remova cuidadosamente o sobrenadante (líquido sobrenadante pode conter pequenas vesículas extracelulares, incluindo microvesicles e exosomes).
  6. Resuspenda o pellet em 1 mL de 1X PBS (o que representa a fração de 'ApoBD-enriquecido')
  7. Colete 100 µ l de cada viável, WAS, enriquecido em ApoCell e ApoBD-enriquecido de amostras em um novo fundo redondo, tubo de poliestireno (citometria de fluxo).
  8. Adicione 100 µ l de mancha contendo tampão de ligação 2 x A5, 1: 100 A5-FITC e 1:1,000 TO-PRO-3
  9. Incube a temperatura ambiente por 10 min no escuro.
  10. Analise as amostras por citometria de fluxo, usando a estratégia associada como descrito acima para validar a sucesso indução da apoptose e pureza da fração enriquecida com ApoBD.

4. fluxo Cytometry Gating estratégia

  1. Plot TO-PRO-3 (eixo y) contra FSC (eixo x) para separar as células necróticas (TO-PRO-3alta) de todos os outros eventos não-permeabilizado (TO-PRO-3baixo/intermediário).
  2. Selecione todos os eventos não-permeabilizado e plotar SSC contra A5. Portão de duas populações, incluindo população 1 (P1), SSCintermediário/alto, A5baixo/intermediário células e população 2 (P2), todos os outros eventos.
  3. De P2, plot TO-PRO-3 contra o A5 e selecione eventos deintermediário/alto A5 para excluir todos os detritos de células.
  4. Selecione todos os eventos positivos do A5 e plotar FSC contra A5. Separe (FSCbaixa) ApoBDs ApoCells (FSCintermediário/alto).
    Nota: Quando a retenção de ApoBDs para ApoBD de isolamento através da abordagem baseada em FACS, recomendamos uma etapa final selecionando ApoBDs e comparando TO-PRO-3 para A5 e selecionando todos os eventos. Isso garante que o portal classificação final usa fluorescência em vez de parâmetros FSC/SSC.
  5. Para análise de células viáveis, selecione P1 e execute uma das duas estratégias associadas. Para análise de células viáveis geral, plotar FSC contra A5 e selecione todas as células deintermediário/alto FSC, portanto, removendo detritos de células restantes. Como alternativa, para uma análise aprofundada, células viáveis podem ser separadas da A5– ApoCells início plotando TO-PRO-3 contra o FSC. Selecionar TO-PRO-3baixa, as células viáveis deintermediário/alto do FSC e TO-PRO-3intermediário, FSCintermediário/alto A5– ApoCells cedo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Usando o procedimento descrito aqui, THP-1 monócito apoptose foi induzido e ApoBDs foram detectados e isolados através um FACS-baseado ou uma abordagem de centrifugação diferencial (Figura 1). Em primeiro lugar, apoptose foi induzida por irradiação UV e as amostras foram coletadas após 2-3 h de incubação, quando demonstrado de células apoptóticas morfologias, incluindo blebbing, formação de protrusão da membrana apoptotic e a geração de ApoBDs

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Desde sua descrição inicial na década de 1950, campo da apoptose tem avançado consideravelmente, tornando-se uma área de pesquisa proeminente. Apesar do amplo interesse e grandes esforços, certos aspectos da apoptose, em particular a formação de ApoBDs, não foi bem estudaram devido a falta de metodologias adequadas. Estes incluem nomeadamente a limitação no acompanhamento da progressão de apoptose e ApoBD formação simultaneamente utilizando a citometria de fluxo tradicional análise A5/PI e as impurezas de isolamento ApoB...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Isto trabalhou era suportada por concessões do nacional de saúde e Conselho de pesquisa médica (GNT1125033 e GNT1140187) e Australian Research Council (DP170103790) para I.K.H.P.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células, por exemplo, monócitos THP-1 humanos cultivados (número do clone: TIB-202)ATCC-RPMI
1640 médioLife Technologies22400-089
Mistura de penicilina-estreptomicinaLife Technologies15140122
FSCGibco10099-141
1x PBS-
Anexina V FITCBD
iodetoLife TechnologiesT3605TO-PRO-3 pode causar irritação na pele, olhos e respiração. Evite o contato direto.
10x Tampão de ligação Anexina VBD Bioscience556454
EDTASigma-Aldrich1001710526
Tubo de centrífuga (15 mL)Cellstar188271
Tubo de microcentrífuga (1,5 mL)Sarstedt72.690.001
Incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO2)--
CentrífugaBeckman Coulter392932
FACS ARIA III Citômetro de fluxo, configurado com dois lasers para detecção de FITC e APCBD Bioscience-FACS
Canto II Citômetro de fluxo, configurado com dois lasers para detecção de FITC e APCBD Bioscience-FACS
Diva 6.1.1 softwareBD Bioscience-
Software FlowJo 8.8.6--
  UV Stratalinker 1800Stratagene-
Bioscience-TO-PRO-3

Referências

  1. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
  2. Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
  3. Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
  4. Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
  5. Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
  6. Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439(2015).
  7. Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
  8. Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
  9. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
  10. Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
  11. Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
  12. Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
  13. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81(2009).
  14. Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
  15. Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
  16. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
  17. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  18. Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
  19. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  20. Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
  21. Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
  22. Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
  23. Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846(2017).
  24. Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444(2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Citometria de FluxoIsolamento por FACSCentrifugação DiferencialIndução de ApoptoseMonócitos THP-1Vesículas ExtracelularesSeleção CelularAnálise de PurezaEstratégia de Gating
Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.