Um fluxo de trabalho usando a centrifugação diferencial ou citometria de fluxo é desenvolvido para detectar, quantificar e isolar corpos apoptotic de uma amostra de apoptotic de alta pureza.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza
Neste artigo
Resumo
Resumo
Corpos apoptotic (ApoBDs), microvesicles e exosomes são os principais membros da família vesículas extracelulares, com ApoBDs sendo um dos maior tipo. Tem sido proposto que a ApoBDs pode ajudar apuramento da célula, bem como a comunicação intercelular através do tráfico de biomoléculas. Abordagens convencionais utilizadas para a identificação e isolamento de ApoBDs são muitas vezes limitadas pela falta de quantificação exata e pureza da amostra de baixo. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho para confirmar a indução da apoptose, validar a formação ApoBD e isolar ApoBDs de alta pureza. Nós também irá delinear e comparar fluorescência-ativado da pilha (FACS) de triagem e centrifugação diferencial com base em abordagens para isolar ApoBDs. Além disso, a pureza de ApoBDs isoladas será confirmada usando um estabelecer previamente a coloração de baseados em citometria de fluxo e o método analítico. Tomados em conjunto, utilizando a abordagem descrita, THP-1 monócito apoptose e apoptose celular desmontagem foi induzida e validada, e ApoBD, gerado a partir de monócitos THP-1 foram isolados de uma pureza de 97-99%.
Introdução
Apoptose, uma forma bem estudada de morte celular programada, é necessário para manter a homeostase fisiológica e remover células potencialmente prejudiciais dentro do corpo humano1. Após a indução da apoptose, pilhas apoptotic (ApoCells) podem se submeter a uma série de alterações morfológicas e desmontar em pequenas vesículas de membrana-limite denominadas ApoBDs. Em geral, este processo é conhecido como desmontagem de célula apoptótica e pode ser dividido em 3 etapas distintas, com base na morfologia2,3. Passo 1 (membrana plasmática blebbing) é caracterizado pela formação de balão-co....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. indução da apoptose
- Centrifugar a amostra de célula a 300 x g por 5 min e descartar o sobrenadante para remover os detritos de células pré-existentes.
Nota: Quando utilizar células aderentes, células de sementes com antecedência e lave com 1 x solução de tampão fosfato (PBS) antes da indução de apoptose. - Determinar o número do celular e coletar as células.
Nota: Dependendo do pós-isolamento ensaio, recomendamos um número de celular inicial de pelo menos 1 x 107 células. - Resuspenda em mídia completa (respectivo meio contendo soro fetal bezerro de 10% (vol/vol), penicilina 50 UI/mL, 50 µ g/mL de mistura de estreptomicina....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Usando o procedimento descrito aqui, THP-1 monócito apoptose foi induzido e ApoBDs foram detectados e isolados através um FACS-baseado ou uma abordagem de centrifugação diferencial (Figura 1). Em primeiro lugar, apoptose foi induzida por irradiação UV e as amostras foram coletadas após 2-3 h de incubação, quando demonstrado de células apoptóticas morfologias, incluindo blebbing, formação de protrusão da membrana apoptotic e a geração de ApoBDs
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Desde sua descrição inicial na década de 1950, campo da apoptose tem avançado consideravelmente, tornando-se uma área de pesquisa proeminente. Apesar do amplo interesse e grandes esforços, certos aspectos da apoptose, em particular a formação de ApoBDs, não foi bem estudaram devido a falta de metodologias adequadas. Estes incluem nomeadamente a limitação no acompanhamento da progressão de apoptose e ApoBD formação simultaneamente utilizando a citometria de fluxo tradicional análise A5/PI e as impurezas de isolamento ApoB.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Isto trabalhou era suportada por concessões do nacional de saúde e Conselho de pesquisa médica (GNT1125033 e GNT1140187) e Australian Research Council (DP170103790) para I.K.H.P.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células, por exemplo, monócitos THP-1 humanos cultivados (número do clone: TIB-202) | ATCC-RPMI | ||
| 1640 médio | Life Technologies | 22400-089 | |
| Mistura de penicilina-estreptomicina | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | ||
| Anexina V FITC | BD | ||
| iodeto | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 pode causar irritação na pele, olhos e respiração. Evite o contato direto. |
| 10x Tampão de ligação Anexina V | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Tubo de centrífuga (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Tubo de microcentrífuga (1,5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO2) | - | - | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Citômetro de fluxo, configurado com dois lasers para detecção de FITC e APC | BD Bioscience-FACS | ||
| Canto II Citômetro de fluxo, configurado com dois lasers para detecção de FITC e APC | BD Bioscience-FACS | ||
| Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | - | |
| Software FlowJo 8.8.6 | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
Referências
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
