Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para reproducibly e rapidamente gerar biologicamente inspirados, biodegradável articifical apresentadoras de células (aAPC) com tamanho ajustável, forma e apresentação de proteína de superfície de célula T expansão ex vivo ou in vivo .

Resumo

Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) são uma plataforma promissora para modulação imune devido a sua potente capacidade de estimular células T. Substratos acelulares oferecem vantagens chaves sobre aAPC baseados em células, incluindo um controle preciso dos parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície aAPC modular suas interações com as células T. aAPC, construída a partir de partículas anisotrópicas, partículas particularmente elipsoidais, foram mostrados para ser mais eficaz do que suas contrapartes esféricos para estimulantes células T devido ao aumento de vinculação e maior área de superfície disponível para a célula T entrar em contato, bem como como reduzida absorção inespecífica e reforçadas propriedades farmacocinéticas. Apesar do aumento do interesse em partículas anisotrópicas, ainda amplamente aceita métodos de geração de partículas anisotrópicas tais como alongamento de filme fino pode ser um desafio para implementar e usar reproducibly.

Para este fim, descrevemos um protocolo para a preparação rápida, padronizada de biodegradável aAPC anisotrópica baseada em partículas com tamanho ajustável, forma e sinal de apresentação para células T expansão ex vivo ou na vivo, juntamente com métodos para caracterizar o seu tamanho, morfologia e superfície teor de proteínas e para avaliar sua funcionalidade. Essa abordagem para fabricar aAPC anisotrópica é escalável e reprodutíveis, tornando-a ideal para a geração de aAPC para imunoterapias "prateleira".

Introdução

Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) têm mostrado promessa como agentes imunomoduladores porque elas podem gerar uma resposta robusta pilha de T antígeno-específicas. Essenciais para essas plataformas são sua capacidade de apresentar eficientemente cruciais sinais para a ativação de células T. AAPC acelular são uma alternativa atraente para aAPC baseados em células, porque eles são mais fácil e menos dispendiosa fabricar, enfrentam poucos desafios durante o scale-up e Tradução e atenuar os riscos associados com terapias baseadas em células. AAPC acelular também permitem um alto grau de controle sobre parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície que irá interagir com T células¹.

aAPC deve recapitular um mínimo de dois sinais essenciais para a ativação de células T. Sinal 1 prevê o reconhecimento do antígeno e ocorre quando o receptor de células T (TCR) reconhece e se envolve com um MHC-classe I ou II, tendo seu antígeno cognato, culminando na sinalização através do TCR complexo. Para contornar a exigência de especificidade do antígeno, aAPC sistemas frequentemente suportar um agonístico anticorpo monoclonal contra o receptor CD3, que nonspecifically estimula o complexo TCR. Formas recombinantes do MHC, particularmente oriundas de MHC, também utilizámos na superfície da aAPC para fornecer o antígeno especificidade^2,3. Sinal 2 é um sinal de co-estimulação que direciona a atividade das células T. Para fornecer o costimulation necessária para a ativação de células T, o receptor CD28 geralmente é estimulado com um anticorpo agonístico apresentado na superfície aAPC, apesar de outros receptores co-estimulação como 4-1BB foram alvejados com sucesso⁴. Proteínas de sinal 1 e 2 são normalmente imobilizadas na superfície de partículas rígidas para sintetizar aAPC. Historicamente, aAPC têm sido fabricados a partir de uma variedade de materiais, incluindo poliestireno^4,5 e ferro dextrano⁶. Sistemas mais novos utilizam polímeros biodegradáveis como poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) para gerar aAPC que pode ser facilmente acoplado para sinalizar proteínas, é adequados para a administração direta na vivoe pode facilitar a liberação sustentada de encapsulados de citocinas ou fatores solúveis para aumentar a ativação de célula T^7,8.

Além da presença de proteínas de sinal necessário, engajamento do receptor sobre uma superfície suficientemente grande durante a interação de célula aAPC/T é essencial para a ativação de células T. Assim, os parâmetros físicos da aAPC como tamanho e forma drasticamente alteram sua área de contato disponível e afetam sua capacidade de estimular células T. AAPC micro-empresas foram mostrados para ser mais eficaz em estimular as células T do que suas contrapartes de nanoescala^9,10. No entanto, nano-aAPC pode ter biodistribuição superior e melhor drenagem para os linfonodos que pode melhorar seu desempenho na vivo sobre micro-aAPC¹¹. A forma é outra variável de interesse em sistemas baseados em partículas aAPC. AAPC anisotrópica recentemente foram mostrados para ser mais eficaz do que partículas isotrópicas a estimular as células T, principalmente devido à interação aprimorada com células alvo juntamente com absorção reduzida celular específico. Células ligam preferencialmente ao eixo longo de partículas elipsoidais, e o maior raio de curvatura e superfície mais plana que permitem mais contato entre a aAPC e células T¹². O longo eixo das partículas elipsoidais também desencoraja a fagocitose, resultando em aumento da circulação de tempo em comparação com as partículas esféricas em vivo administração^12,13a seguir. Devido a estas vantagens, partículas elipsoidais mediam a maior expansão do antígeno-específicas T células in vitro e em vivo em comparação com as partículas esféricas, um efeito observado em ambos os micro e nanoscales^{12, 13}. Existem várias estratégias para fabricar partículas anisotrópicas, mas alongamento de película fina é um método simples, amplamente aceitado, usado para gerar uma gama de partículas diversas formas¹⁴. Após a síntese, partículas são lançadas filmes e esticadas em uma ou duas dimensões, a uma temperatura acima da temperatura de transição vítrea do material das partículas. O filme é então dissolvido para recuperar as partículas. Apesar do crescente interesse em partículas anisotrópicas, abordagens atuais para fabricação baseada em partículas aAPC limitam-se principalmente aos sistemas isotrópicos, e métodos de alterar a forma das partículas podem ser difícil de implementar, incompatível com certa síntese aAPC estratégias e falta de precisão e reprodutibilidade¹⁵. Nossa técnica de alongamento de película fina pode ser executada manualmente ou em um modo automatizado para gerar rapidamente partículas anisotrópicas sintetizadas a partir de uma variedade de polímeros biodegradáveis, esticada para uma proporção desejada em uma ou duas dimensões¹⁵.

Baseado no nosso trabalho anterior, desenvolvemos uma abordagem baseada em partículas biodegradável combinada com tecnologia de alongamento de thin-film escalável para gerar rapidamente aAPC com tamanho ajustável e a forma de uma forma padronizada para células T expansão ex vivo ou em vivo. Nossa estratégia de conjugação de proteínas pode ser usada para acoplar qualquer somáticas de interesse aos grupos da carboxila na superfície da partícula em uma densidade desejada, dando a este sistema de aAPC um alto grau de flexibilidade. Descrevemos também métodos para caracterizar o tamanho, morfologia e teor de aAPC de proteínas de superfície e para avaliar sua funcionalidade em vitro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para expandir as células imunes ex vivo ou na vivo para uma variedade de aplicações de imunoterapia.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Johns Hopkins.

1. fabricação de PLGA esférico partículas de tamanho ajustável

1. Preparação de materiais para a síntese de partículas
   1. Prepare a solução a 5% w/w de álcool polivinílico (PVA).
      1. Adicionar 500 mL de água desionizada (DI) para um Erlenmeyer com uma barra de agitação magnética e colocar no agitador de placa quente a 500 rpm e monitor de temperatura com termômetro. Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação.
      2. Quando a temperatura da água atinge aproximadamente 70 ° C, adicione o total de 25 g de PVA em pequenos lotes ao longo do tempo, à espera de PVA dissolver antes de adicionar mais.
      3. Uma vez que todas PVA é dissolvido (tipicamente 30-60 min), deixe filtro de solução fria e estéril. Armazenar a 4 ° C para uso futuro.
   2. Prepare a solução de fundição de filme de 10% w/w PVA e 2% w/w glicerol.
      1. Adicione 500 mL de água para um Erlenmeyer com uma barra de agitação magnética. Adicione 8 mL de glicerol em temperatura ambiente e misture por trituração.
      2. Colocar o balão no agitador prato quente a 500 rpm e monitor de temperatura com termômetro. Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação.
      3. Quando a temperatura da solução atinge cerca de 70 ° C, adicione 50 g total de PVA em pequenos lotes ao longo do tempo, à espera de PVA dissolver antes de adicionar mais.
      4. Quando todos PVA é dissolvido (normalmente 60 min), deixe a solução legal e estéril filtro usando um sistema de filtro de vácuo garrafa-top com um tamanho de poros de 0,22 μm. Armazenar em temperatura ambiente para uso futuro.
   3. Prepare uma solução PVA 50 mL 1% w/w. Adicione 40 mL de água e 10 mL de solução a 5% PVA (feita em 1.1.1) para um copo de 100-150 mL.
   4. Prepare uma solução PVA 100ml 0,5% w/w. Adicione 90 mL de água e 10 mL de solução a 5% PVA para um copo de 150-250 mL.
   5. Adicione uma barra de agitação magnética para o 0,5% solução PVA e coloque em uma capa de química em uma placa de agitação à temperatura ambiente a 500 rpm.
2. Síntese de micropartículas
   1. Pesar 100 mg de poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) em um frasco de cintilação e dissolver em 5 mL de diclorometano (DCM). Vórtice de dissolver o PLGA.
   2. Coloque homogenizador na solução 50 mL 1% PVA para que o homogeneizador é o mais próximo do fundo do copo quanto possível sem tocá-lo. Ligue homogenizador e ajuste a velocidade desejada — 3.200 rpm para partículas de diâmetro 5 μm, 5.000 rpm para 3 μm, 15.000 rpm para 1 μm (aumentando o tamanho de partícula de diminuições de velocidade de homogeneização). Uma vez na velocidade desejada, adicionar a solução PLGA para o copo e homogeneizar por 1 minuto.
   3. Após a homogeneização, despeje o 1% PVA, solução de micropartículas PLGA na solução 100 mL 0,5% PVA em um prato Misture e mexa pelo menos 4 horas para a evaporação de solvente em uma capa de química.
   4. Lave as partículas 3 vezes em água DI.
      1. Despeje a solução de partícula em tubos de Erlenmeyer de 50 mL e centrifugar a 3000 x g por 5 minutos. Derrama o sobrenadante e adicionar cerca de 20 mL de água Desionizada.
      2. Resuspenda as partículas vortexing. Uma vez resuspended, encha tubos cônicos para 50 mL com água.
      3. Lave novamente da mesma maneira duas vezes mais.
3. Síntese de nanopartículas
   1. Pesar 200 mg de PLGA dentro de um frasco de cintilação e dissolver em 5 mL de DCM. Vórtice de dissolver o PLGA.
   2. Coloque um copo com 50 mL de solução de PVA 1% no recipiente cheio de gelo. Coloque a sonda de sonicador no copo como perto do fundo quanto possível sem tocar. Comece sonication e adicione imediatamente a solução PLGA no copo medidor. Proceda à sonicação com uma potência de 12 W por 2 minutos gerar nanopartículas com um diâmetro aproximado de 200 nm.
   3. Depois sonication, despeje o 1% PVA, solução de nanopartículas PLGA em uma solução PVA 100ml 0,5% em uma placa de agitação e mexa pelo menos 4 horas para a evaporação de solvente em uma capa de química.
   4. Despeje a solução de partícula tubos Erlenmeyer de 50 mL e centrifugação a 3.000 x g, durante 5 minutos para remover micropartículas. Remover o sobrenadante e despeje em tubos de centrífuga de alta velocidade.
   5. Lave as partículas 3 vezes com água Desionizada. Centrifugar a 40.000 x g durante 15 minutos. Derrama o sobrenadante e ressuspender em água DI vortexing. Lave novamente da mesma maneira duas vezes mais.

2. fabricação de partículas poliméricas de forma ajustável

1. Depois de lavar as partículas PLGA três vezes, resuspenda as partículas em aproximadamente 1 mL de água Desionizada. Adicione a solução de fundição de filme de partículas para a concentração final de partícula das partículas de 2,5 mg/mL.
2. Pipete a suspensão de partículas em alíquotas de 10 mL para pratos de Petri retangular 75 x 50 mm para distender unidimensional ou em alíquotas de 15 mL em pratos de Petri 100 x 100 mm quadrados para alongamento bidimensional. Remover bolhas ou pipeta ou bolhas empurra para o lado e deixar secar durante a noite filmes numa vizinhança de química.
3. Uma vez que os filmes tenham secado, remover filmes de pratos de plástico com uma pinça e cortar bordas de filmes com uma tesoura. Salve as bordas em um tubo cônico de 50 mL, para ser usado como partículas esféricas.
   1. Carrega um filme para a película fina automatizado esticando o dispositivo por um filme em blocos de alumínio de montagem. Para 1D alongamento, monte filme para blocos de alumínio de um eixo de maca (Figura 2), colocando duas arestas curtas do filme entre dois pedaços de borracha neoprene. Usando uma chave Allen, Dane-se as alças de metal na parte superior de borracha para segurar o filme no lugar. Para alongamento 2D, monte todas as quatro bordas em quatro blocos de alumínio para esticar em ambos os eixos (Figura 2).
   2. Medir e registrar o comprimento do filme entre blocos de alumínio sobre um eixo para 1D alongamento ou ambos os eixos para distender 2D. Calcule a distância necessária para esticar o filme em uma ou duas direções com base em dobra-trecho desejado.
   3. Coloque o dispositivo de alongamento filme carregado em estufa a 90 ° C e trazer o filme para temperatura durante 10 minutos. Coloca um copo grande no forno com uma pequena quantidade de água.
   4. Filme estirável.
   5. Quando o alongamento for concluída, retire o dispositivo de alongamento do forno e deixe arrefecer o filme à temperatura ambiente durante 20 minutos.
   6. Para 1D alongamento, corte o filme fora o dispositivo de alongamento nas bordas. Para alongamento 2D, corte e salvar o centro quadrado de filme que é esticado uniformemente em ambos os eixos. Coloque filmes em tubos cónicos com 2 filmes por tubo e descartar o resto do filme.
   7. Adicione cerca de 25 mL de água Desionizada para cada tubo cônico e o vórtice até os filmes são dissolvidos.
   8. Uma vez que os filmes são partículas dissolvidas, lave 3 vezes com água Desionizada.
      1. Por micropartículas, encher tubos cônicos para 50 mL e centrifugar a 3000 x g por 5 minutos, derrama o líquido sobrenadante, adicionar cerca de 20 mL de água Desionizada e vórtice para Ressuspender as partículas.
      2. Para nanopartículas, partículas de transferência para tubos de centrífuga de alta velocidade e centrifugar 40.000 x g por 15 minutos, deite fora o líquido sobrenadante, adicionar cerca de 20 mL de água Desionizada e vórtice para Ressuspender as partículas.
   9. Após a terceira lavagem, resuspenda partículas em aproximadamente 1 mL de água Desionizada. Registrar o peso do tubo microcentrifuga e adicionar partículas ao tubo. Congele as partículas em um freezer-80 ° C por 1 hora ou congelamento flash em nitrogênio líquido. Uma vez congelado, lyophilize partículas durante a noite.
   10. Uma vez liofilizado, pesar as partículas no tubo microcentrifuga e subtrair o peso verificado do tubo vazio para determinar o peso das partículas liofilizados.

3. proteína conjugação para criar Artificial células apresentadoras

1. Prepare 2-(N-Morpholinos) etanesulfónico tampão de ácido (MES). Faça uma solução 0,1 M de MES na água e ajustar o pH a 6.0 por titulação com 1M de hidróxido de sódio (NaOH).
2. Resuspenda micro/nanopartículas de PLGA/PBAE liofilizadas em 20 μg/mL no buffer MES vortexing. Encher um tubo de polipropileno microcentrifuga com 900 μL de tampão MES e adicionar 100 μL de solução a partícula para o tubo.
3. Prepare a solução EDC/NHS. Dissolva 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC) e 48 mg de N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) em 1 mL de tampão MES.
4. Adicione solução EDC/NHS 100 μL para as partículas e o vórtice para misturar.
5. Incube o tubo em um inversor em temperatura ambiente por 30 minutos.
6. Spin para baixo de micropartículas a 5.000 x g por 5 minutos, ou nanopartículas a 17.000 x g por 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de solução Isotónica pela utilização do Vortex (micropartículas) ou sonicating em 2-3 W durante 5 segundos (nanopartículas).
7. Por micropartículas, adicione 8 μg de proteína o sinal desejado 1 e 10 μg de anti-rato CD28 (clone 37.51) para as partículas. Por nanopartículas, adicione 16 μg sinal 1 e 20 μg anti-rato CD28. Adicione PBS para trazer o volume no tubo para 1,1 mL.
8. Incube o tubo em um inversor a 4 ° C durante a noite.
9. No dia seguinte, lave as partículas. Spin para baixo de micropartículas a 5.000 x g por 5 minutos, ou nanopartículas a 17.000 x g por 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as partículas em 1 mL de PBS estéril, pela utilização do Vortex (micropartículas) ou sonication em 2-3 W durante 5 segundos (nanopartículas). Repita duas vezes.
10. Resuspenda as partículas na concentração desejada em meio de cultura para uso imediato. Para armazenamento a longo prazo, resuspenda partículas em 10 mg/mL em uma solução de sacarose 100 mM. Congelar, lyophilize e armazenar as partículas a-80 ° C.

4. caracterização e avaliação da aAPC

1. Caracterização da aAPC tamanho e forma (Figura 3)
   1. Caracteriza microparticulado tamanho e forma de partículas de imagem usando microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para SEM imagens, espalhou partículas liofilizadas em fita de carbono aderiram a um alumínio tack e salpicar o casaco com ouro-paládio.
   2. Analise o tamanho e a proporção de partículas usando software de análise de imagem.
   3. Para determinar o tamanho de partícula, definir escala usando a barra de escala e medir o diâmetro das partículas. Repita para aproximadamente 100 partículas determinar o diâmetro médio da partícula e gerar um histograma de tamanhos de partículas.
   4. Para determinar a relação de aspecto, medir a distância entre o eixo e o eixo curto de partículas e divida o longo eixo por eixo curto. Repita para aproximadamente 50 partículas de cada forma de determinar a relação de aspecto de partícula média para cada forma e gerar histogramas.
   5. Caracteriza as nanopartículas tamanho e forma por imagem de partículas usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Analise o tamanho e a proporção de nanopartículas usando software de análise de imagem, conforme descrito em 5.1.2. Alternativamente, medir o tamanho de nanopartículas esféricas usando Difusão dinâmica da luz (DLS) ou nanopartículas acompanhamento análise (NTA).
2. Eficiência de conjugação de proteínas
   1. Preparar aAPC de acordo com métodos 1-3, mas no passo 3.7 usar proteína fluorescente etiquetadas sinal 1 e anti-rato CD28. Após a conjugação e lavagem, Ressuspender a aAPC em 1 mL de PBS para uma concentração final de 2 mg/mL aAPC.
   2. Prepare padrões de proteína em uma microplaca de 96 poços de poliestireno preta. Adicionar 5 μg de proteína fluorescente etiquetadas sinal 1 para PBS no primeiro poço da placa e faça 10 diluições de 1:2 em PBS em toda a linha da placa. Deixe o espaço em branco bem passado. Repita este passo para gerar um outro conjunto de normas com fluorescente etiquetadas anti-CD28.
   3. Pipete 100 μL da solução aAPC para replicar poços da microplaca de poliestireno preto em triplicado.
   4. Lê a fluorescência em um leitor de placa de fluorescência em comprimentos de onda adequados. Use as leituras de fluorescência dos padrões da proteína para gerar curvas padrão para cada anticorpo fluorescente. Usando a curva padrão, calcular a concentração de sinal 1 e anti-CD28 em cada poço de amostra e em seguida, calcular a quantidade de proteína e eficiência de conjugação (Figura 4A, Figura 5A).
3. Avaliação da aAPC para estimulação em vitro de células T CD8 +
   1. Preparar a mídia B' (meio RPMI suplementado com L glutamina, 10% FBS, 1% solução de ácido aminado Non-essential, piruvato de sódio 1%, 1% solução de vitamina MEM, 92 μM β-Mercaptoetanol, 10 ng/mL ciprofloxacin e 30 U/mL IL-2.
   2. Sacrifica um rato preto 6 através de exposição de dióxido de carbono.
   3. O baço do mouse de acordo com um protocolo previamente estabelecido¹⁶da colheita. Recolher o baço em um tubo cônico de 50 mL, com 10 - 15 mL de PBS. Usando um pilão, amasse o baço através de um filtro de célula de 70 µm para um tubo cónico de 50 mL. Durante a trituração, lave o filtro com 40 mL de PBS.
   4. Gire os splenocytes a 300 x g por 5 minutos. Decantar o sobrenadante e ressuspender os splenocytes em 4 mL de tampão de lise de Ack para lisar células vermelhas do sangue. Permitir que o tubo se sentar imperturbável durante 1 minuto, em seguida, adicione o PBS para trazer o volume no tubo de 20 mL.
   5. Gire as células a 300 x g por 5 minutos. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS. Conte as células usando um hemocytometer.
   6. Girar as células a 300 x g por 5 minutos e ressuspender no volume desejado de buffer de separação da célula. Isole as células T CD8 + da suspensão única célula usando uma CD8 + seleção negativa kit de isolamento de célula T, a seguir o protocolo do fabricante.
   7. Após a separação magnética, girar as células T CD8 + a 300 x g durante 5 minutos e remover o buffer de separação da célula. Ressuspender as células em 1 mL de PBS e contar as células. Rotular as células com carboxyfluorescein Succinil éster (CFSE) de acordo com o protocolo do fabricante.
   8. Incube 8.333 células T CD8 + e mg 0,0833 (ou dose desejada) da aAPC em media 150 μL B' em cada poço de um 96 bem U-cultura de tecidos tratados placa inferior.
   9. Incube a 37 ° C por 7 dias. Após 3-4 dias, atualize o meio de cultura adicionando meio fresco de 75 μL de cada poço.
   10. Após 3 dias de incubação, analise CFSE rotulados de células em um citômetro de fluxo, para avaliar a proliferação. Cada pico no histograma fluxo cytometry CFSE representa uma geração de células devido a diluição CFSE com cada divisão celular sucessiva.
   11. Após 7 dias, use um hemocytometer para contar o número de células em cada poço. Antes da contagem, manche as células mortas com uma solução de azul de Trypan. Exclua as células mortas da contagem de células final. Normalize a concentração celular final para a concentração inicial para calcular a dobra-expansão (Figura 4 e Figura 5).

Resultados

Um esquema para a película fina 2D automatizado dispositivo de alongamento é dada na Figura 1. Um esquema e uma descrição para uma película fina de 1D, dispositivo de alongamento é dada na Ho et al.¹⁷ a maca é construída a partir de usando o padrão de moagem e de técnicas de usinagem de peças de alumínio. Semelhante a maca 1D, 2D maca consiste em apertos metálicos e trilhos de guia. Bidirecional de roscas são usadas para traduzir linea...

Discussão

Este protocolo detalha um método versátil para a geração precisa de partículas poliméricas anisotrópicas. A película fina alongamento técnica descrita aqui é escalável, altamente reprodutível e barato. Técnicas alternativas para a geração de partículas anisotrópicas sofrem muitas limitações, incluindo o alto custo, baixa taxa de transferência e tamanho de partícula limitada. A película fina, abordagem de alongamento também é vantajosa porque as partículas são modificadas para serem anisotrópica após a síntese e, em conse...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Poli (álcool vinílico), MW 25000, 88% hidrolisado	Polysciences, Inc.	02975-500
Sigma-Aldrich	G9012		glicerol
	Fluke	N/A	Nome do modelo: Sonda de temperatura de imersão Fluke 52 II
	Fluke	N/A	Nome do modelo: Placa de aquecimento digital Fluke 80PK 22
e	Agitador Benchmark Scientific	H3760-HS
Agitador Multiponto	Thermo Fisher Scientific	50093538
Resomer RG 504 H, Poli(D,L-lactide-co-glicolide)	Sigma-Aldrich	719900
Diclorometano	Sigma-Aldrich	D65100
Homogeneizador	IKA&	nbsp;
Sonicator	Sonics & Materiais, Inc.	N/A	Número do modelo: VC 505
Sonicator gabinete de redução de som	Sonics & Materiais, Inc.	N/A	Número da peça: 630-0427
Sonda Sonicator	Sonics & Materiais, Inc.	N/A	Número da peça: 630-0220
Sonicator microtip	Sonics & Materiais, Inc.	N/A	Número da peça: 630-0423
Centrífuga de alta velocidade	Beckman Coulter	N/A	Número do modelo: J-20XP (descontinuado), modelo alternativo: J-26XP
Rotor de centrífuga de alta velocidade	Beckman Coulter	369691	Número do modelo: JA-17
Tubos de centrífuga de policarbonato de alta velocidade	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 mL, tampa de rosca
Retangular descartável Petri prato	VWR International	25384-322	75 x 50 x 10 mm
Prato de Petri descartável quadrado	VWR International	10799-140	100 mm x 100 mm
FOLHA  Purificado anti-rato CD3ε Anticorpo	Biolegend	100314
InVivoMab anti-camundongo CD28, clone 37.51	Bio X Cell	BE0015-1
N- (3-Dimetilaminopropil) -N′-etilcarbodiimida cloridrato	Sigma-Aldrich	E6383
N-Hidroxisulfosuccinimida sal de sódio	Sigma-Aldrich	56485
MES	Sigma-Aldrich	M3671
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Anticorpo	Biolegend	100212
APC anti-mouse CD28 Anticorpo Biolegend		102109
Corning  Microplaca de Poliestireno Sólido de 96 Poços	Sigma-Aldrich	CLS3915 fundo	plano, tubos LoBind de proteína de poliestireno preto
, 1,5 mL	Eppendorf	22431081
RPMI 1640 Médio (+ L-Glutamina)	ThermoFisher Scientific	11875093
Soro Fetal	Bovino Sigma-Aldrich	F4135	Inativada por Calor, filtrada estéril
	Sigma-Aldrich	17850
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
IL-2 Humano Recombinante (sem transportador)	Biolegend	589102
Piruvato de Sódio (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)	ThermoFisher Scientific	11140050
MEM Vitamina Solução (100X)	ThermoFisher Scientific	11120052
CD8a+  Kit de Isolamento de Células T, camundongo	Miltenyi Biotech	130-104-075
Kit de Proliferação de Células CellTrace CFSE	ThermoFisher Scientific	C34554
LS Colunas	Miltenyi Biotech	130-042-401
Separador MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS Multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Citômetro de Fluxo	Accuri C6
Synergy 2 Leitor de Microplacas Multi-Detecção	BioTek
autoMACS Running Buffer	Miltenyi BIotech	130-091-221
Filtro de Células	ThermoFisher Scientific	22363548	Estéril, 70 µ m malha de nylon
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher Scientific	A1049201
C57BL/6J (Preto 6)	Rato The Jackson Laboratory	000664	Macho, com pelo menos 7 semanas de idade
Placas de cultura de tecidos U-Bottom	VWR	353227	Estéril, placas de poliestireno tratadas com cultura de tecidos de 96 poços
Fonte de alimentação 40 V DC	Probotix	LPSK-4010
PTFE Fio Revestido	Mouser	602-5858-100-01	Este é para um carretel de 100 pés, mas um fio equivalente funcionará
Driver de Motor de Passo	Probotix	MondoStep5.6
Kit de Conector IDC	Probotix	IDCM-10-12
Microcontrolador	Probotix	PBX-RF
4A Fusíveis	Radio Shack	2701026	Fusíveis equivalentes também funcionarão
Cabo DB25 Macho para Macho	Probotix	DB25-6
	Grampos	2094915	Cabo equivalente também funcionará
Conectores Amphenol de 8 pinos macho e fêmea	Mouser	654-97-3100A-20-7P e 654-97-3106A20-7S
Motor de Passo	Probotix	HT23-420-8
Parafuso de Avanço Direito	Roton	60722
Parafuso de Chumbo	Esquerdo Roton	60723
Parafusos	McMaster Carr	92196A151
Borracha de Neoprene	McMaster Carr	8698K51
Porca de Chumbo Flangeada para Destros	Roton	91962
Porca de Chumbo Flangeada para Canhotos	Roton	91963
Computador de Controle Linux	Probotix	LCNC-PC	Qualquer computador com especificação correspondente e sistema operacional Linux funcionará
filtro de vácuo de garrafa Corning	Sigma-Aldrich	CLS431097
Trypan Blue Solution, 0,4%	ThermoFisher Scientific	15250061