Summary
Burada, hızlı ve tekrarlanarak ayarlanabilir boyutu, şekli ve yüzey proteini tanıtımı için T hücre genişletme ex vivo veya içinde vivo hücre (aAPC) sunan biyolojik ilham, biyolojik olarak parçalanabilen articifical antijen üretmek için bir iletişim kuralı mevcut .
Abstract
Yapay antijen sunan hücreler (aAPC) T hücreleri uyarmak için güçlü yeteneklerini nedeniyle bağışıklık modülasyonu için umut verici bir platform vardır. Acellular yüzeylerde sinyal sunu parametrelerinin kesin kontrol ve T hücreleri ile olan etkileşimleri modüle için aAPC yüzeyinin fiziksel özellikleri de dahil olmak üzere aAPC, hücre tabanlı anahtar avantajlar sunuyor. Yönbağımlı parçacıkları, inşa aAPC özellikle ellipsoidal parçacıklar, küresel karşılıkları, uyarıcı T hücreleri artan bağlama ve daha büyük yüzey alanı T hücre için kullanılabilir nedeniyle de ilgili kişi, daha etkili olduğu gösterilmiştir olarak nonspesifik alımı ve gelişmiş farmakokinetik özellikleri azaltılmış. Yönbağımlı parçacıklar artan ilgi rağmen bile yaygın ince film germe uygulamak ve tekrarlanarak zor olabilir gibi anizotropik parçacıklar yöntemleri kabul.
Bu amaçla, biyolojik olarak parçalanabilen anizotropik parçacık tabanlı aAPC tunable boyut, şekil, ile hızlı, standart imalatı için bir iletişim kuralı tanımlamak ve sunum T hücre genişletme ex vivo ve in vivo, yöntemleri için birlikte için sinyal onların boyutu, Morfoloji ve yüzey protein içeriği, karakterize ve işlevselliğini değerlendirmek için. Yönbağımlı aAPC imalatı bu ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir, aAPC için "kapalı" immunotherapies üretmek için ideal hale yaklaşımdır.
Introduction
Onlar sağlam antijen spesifik T hücre yanıt oluşturabilir çünkü yapay antijen sunan hücreler (aAPC) immunomodulatory ajanları olarak söz göstermiştir. Bu platformlar için temel yeteneklerini çok önemli sinyaller T Hücre aktivasyonu için verimli bir şekilde sunmak için vardır. Acellular aAPC çünkü onlar daha kolay ve daha az maliyetli imal, ölçek-up ve çeviri sırasında daha az sorunlarla karşı karşıya ve hücre tabanlı terapiler ile ilgili riskleri hafifletmek hücre tabanlı aAPC için cazip bir alternatif vardır. Acellular aAPC de yüksek derecede sinyal sunu parametreleri üzerinde kontrol ve T hücreleri1ile arayüzü yüzey fiziksel özellikleri için izin verir.
aAPC iki sinyal T Hücre aktivasyonu için gerekli en az özetlemek gerekir. Sinyal 1 antijen tanıma sağlar ve T hücre reseptör (TCR) tanır ve ben ya da karmaşık TCR sinyal sonuçlanan soydaş, antijen taşıyan II MHC sınıf ile yürütmektedir oluşur. Antijen özgüllük gereksinimi atlamak için aAPC sistemleri genellikle karşı nonspecifically TCR karmaşık uyarır CD3 reseptör agonistik bir monoklonal antikor ayı. MHC, özellikle MHC multimers, rekombinant formları da aAPC yüzeyinde antijen özgüllük2,3sağlamak için kullanılmıştır. Sinyal 2 T hücre etkinliği yönlendirir costimulatory bir sinyalidir. 4-1BB gibi diğer costimulatory reseptörleri başarıyla hedeflenen4olmasına rağmen costimulation T Hücre aktivasyonu için gerekli sağlamak için CD28 reseptör genellikle aAPC yüzeyi üzerinde sunulan agonistik bir antikor ile uyarılır. 1 ve 2 sinyal proteinleri genellikle aAPC sentezlemek için katı parçacıklar yüzeyinde immobilize. Tarihsel olarak, aAPC polistren4,5 ve demir dextran6gibi malzemelerin çeşitli fabrikasyon. Daha yeni sistemleri yararlanmak poli (laktik-co-Glikolik asit) gibi biyobozunur polimerler (PLGA) kolayca proteinler sinyal birleştiğinde, doğrudan yönetim içinde vivoiçin uygundur ve sürekli serbest bırakılması kolaylaştırabilir aAPC oluşturmak için sitokinler veya T hücre harekete geçirmek7,8ek olarak çözünür faktörler kapsüllenir.
Gerekli sinyal proteinleri varlığı ek olarak, yeterince büyük yüzey alanı üzerinden reseptör nişan aAPC/T hücre etkileşim sırasında T Hücre aktivasyonu için gereklidir. Böylece, aAPC boyutu ve şekli gibi fiziksel parametrelerini büyük ölçüde onların mevcut temas bölgesinin değiştirmek ve T hücreleri uyarmak için yeteneklerini etkiler. Mikron büyüklüğünde aAPC gösterilmiştir uyarıcı T hücreleri onların nano karşıtları9,'10dan daha etkili olduğu. Ancak, nano-aAPC üstün biodistribution ve onların performans vivo içinde mikro-aAPC11üzerinde artırabilir lenf düğümleri için daha iyi drenaj olabilir. Şekil aAPC parçacık tabanlı sistemler ilgi başka bir değişkendir. Yönbağımlı aAPC son zamanlarda gösterilmiştir uyarıcı T hücreleri, özellikle hedef hücreleri azaltılmış belirsiz hücre alımı ile birleştiğinde ile gelişmiş etkileşim nedeniyle izotropik parçacıklar daha etkili olmak. Hücreler tercihen ellipsoidal parçacıklar uzun eksene bağlamak ve eğrilik ve düz yüzey daha büyük yarıçapı izin aAPC ve T hücre12arasında daha fazla temas için. Ellipsoidal parçacıklar uzun ekseninin aynı zamanda küresel parçacıklar vivo içinde Yönetim12,13takip göre artan dolaşım zaman sonuçlanan fagositoz, teşvik etmemektedir. Bu avantajlar nedeniyle ellipsoidal parçacıkların mikro ve nanoscales12efekti gözlenen antijen spesifik T hücreleri vitro ve in vivo küresel parçacıklar için karşılaştırıldığında daha fazla genişlemesi aracılık, 13. Yönbağımlı partikülleri imal etmek çeşitli strateji vardır, ama ince film germe farklı parçacık şekil14bir dizi oluşturmak için kullanılan basit, yaygın olarak kabul gören bir yöntem olduğunu. Sentez, parçacıklar filmlerine döküm ve bir veya iki boyutlu bir sıcaklık parçacık malzeme cam geçiş sıcaklığı yukarıda gergin. Filmin ardından parçacıkları almak için tasfiye edilir. Yönbağımlı parçacıklar ilgi büyüyen rağmen imalatı parçacık tabanlı aAPC için geçerli yaklaşımlar çoğunlukla izotropik sistemleri ile sınırlı ve parçacık şekil değiştirme yöntemleri uygulamak zor, bazı aAPC sentezi ile uyumsuz olabilir stratejileri ve -sizlik çekmek-hassasiyet ve tekrarlanabilirlik15. Bizim ince film germe tekniği el ile gerçekleştirilen veya bir ya da iki boyutları15dakika sonra istenen bir en boy oranı hızla anizotropik parçacıklar biyobozunur polimerler çeşitli sentez oluşturmak için bir otomatik biçimde, gergin.
Bizim önceki çalışmaları temel, geliştirdiğimiz içinde hızla T hücre genişletme ex vivo veya için standart bir biçimde aAPC ayarlanabilir boyutu ve şekli oluşturmak için ölçeklenebilir ince film germe teknoloji ile birlikte biyolojik bir parçacık dayalı yaklaşım Vivo. Protein konjugasyon stratejimiz bu aAPC sistemi yüksek oranda esneklik veren karboksil grupları için istenen bir yoğunluk, parçacık yüzeyinde herhangi bir protein(s) ilgi çift için kullanılabilir. Ayrıca boyutu, Morfoloji ve yüzey protein aAPC içerik karakterize ve onların işlevselliği vitrodeğerlendirmek için yöntemleri açıklar. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücreleri ex vivo veya vivo içinde çeşitli immunotherapeutic uygulamalar için genişletmek için kolayca adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. küresel PLGA parçacıklar Tunable boyutta imalatı
- Parçacık sentezi için malzeme hazırlanması
- % 5 w/w Polivinil alkol (PVA) çözüm hazırlamak.
- Bir Erlenmeyer şişesi bir manyetik heyecan çizgiyle 500 mL deiyonize (DI) su ekleyin ve elektrikli karıştırıcı 500 rpm ve monitör sıcaklık termometre ile yerleştirin. Buharlaşma önlemek için folyo ile kapak cep şişesi.
- Su sıcaklığı yaklaşık 70 ° C'ye ulaştığında, PVA 25 g toplam PVA daha eklemeden önce dağıtılması için bekleyen zaman içinde küçük gruplar halinde ekleyin.
- Bir kez tüm PVA (genellikle 30-60 dakika) tasfiye edilir, çözüm serin ve steril filtre izin vermek. İleride kullanmak üzere 4 ° C'de depolayın.
- Film döküm çözüm % 10 w/w PVA ve % 2 w/w gliserol hazırlamak.
- Bir Erlenmeyer şişesi bir manyetik heyecan çizgiyle 500 mL DI su ekleyin. 8 mL gliserol oda sıcaklığında toz tarafından ekleyip karıştırın.
- Şişeyi sıcak plaka karıştırıcı 500 rpm ve monitör sıcaklık termometre ile yerleştirin. Buharlaşma önlemek için folyo ile kapak cep şişesi.
- Çözüm sıcaklık yaklaşık 70 ° C'ye ulaştığında, PVA 50 g toplam PVA daha eklemeden önce dağıtılması için bekleyen zaman içinde küçük gruplar halinde ekleyin.
- Bir kez tüm PVA (genellikle 60 dk) tasfiye edilir, 0,22 mikron gözenek boyutu ile bir şişe-ilk vakum filtre sistemi kullanarak çözüm serin ve steril filtre izin vermek. İleride kullanmak için oda sıcaklığında saklayın.
- 50 mL %1 w/w PVA çözeltisi hazırlamak. 40 mL DI su ve 10 mL % 5 PVA çözeltisi (1.1.1 içinde yapılmış) 100-150 mL kabı için ekleyin.
- 100 mL %0.5 w/w PVA çözeltisi hazırlamak. 150-250 mL kabı 90 mL DI su ve 10 mL % 5 PVA çözeltisi ekleyin.
- Bir manyetik heyecan bar yeri kimyasal başlıklı 500 rpm'de oda sıcaklığında bir heyecan tabakta ve %0,5 PVA çözeltisi ekleyin.
- % 5 w/w Polivinil alkol (PVA) çözüm hazırlamak.
- Microparticle sentezi
- Poli (laktik-co-Glikolik asit) 100 mg tartmak (PLGA) bir mercek flakon ve erime diklorometan (DCM) 5 ml. Girdap PLGA geçiyoruz.
- Böylece homogenizer kabı dibinde gibi mümkün olduğunca dokunmadan yakındır homogenizer 50 mL % 1 PVA çözümde yer. Homogenizer üzerinde dönüş ve istenilen hıza ayarlayın — 5 mikron çapında parçacıklar, 3 mikron, 1 mikron (homojenizasyon hızı azalır parçacık boyutunun artırılması) için 15.000 rpm için 5.000 rpm için 3200 rpm. Bir kez istenilen hızda PLGA çözüm için kabı ekleyin ve 1 dakika homojenize.
- Homojenizasyon sonra 1 dökün % PVA, PLGA microparticle çözüm 100 mL % 0.5 PVA çözüm bir heyecan plaka ve heyecan bir kimyasal başlıklı çözücü buharlaşma için en az 4 saat.
- Parçacıklar 3 kez DI su yıkayın.
- Parçacık çözümü için 5 dakika 50 mL konik boru ve santrifüj 3000 x g de içine dökün. Süpernatant dökün ve yaklaşık 20 mL DI su ekleyin.
- Parçacıklar vortexing tarafından resuspend. Resuspended sonra konik tüpler 50 ml DI su ile doldurmak.
- Yine aynı şekilde iki kez daha yıkayın.
- Nanoparçacık sentezi
- PLGA 200 mg bir mercek şişe içine dışarı ağırlığında ve 5 mL DCM geçiyoruz. Girdap PLGA geçiyoruz.
- 50 mL %1 PVA çözeltisi ile bir ölçek buz dolu kap içine yerleştirin. Sonicator sonda kabı içinde belgili tanımlık dip olarak mümkün olduğunca yakın temas etmeden yerleştirin. Sonication başlar ve hemen PLGA çözüm kabı ekleyin. 12 W güç 200 yaklaşık bir çapı ile nano tanecikleri üretmek 2 dakika ile solüsyon içeren temizleyicide nm.
- 1 sonication sonra dökmek % PVA, PLGA nanopartikül çözüm bir heyecan plaka ve heyecan bir kimyasal başlıklı çözücü buharlaşma en az 4 saat için 100 mL % 0.5 PVA çözüm içine.
- Parçacık çözüm 50 mL konik boru ve santrifüj 3000 x g 5 dakika microparticles kaldırmak de içine dökün. Süpernatant kaldırmak ve yüksek hızlı santrifüj tüpler içine dökün.
- Parçacıklar 3 kez DI su ile yıkayın. 40.000 x g de 15 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant dökün ve DI suda vortexing tarafından resuspend. Yine aynı şekilde iki kez daha yıkayın.
2. polimer parçacıkları akort şeklinin imalatı
- PLGA parçacıklar üç kez yıkadıktan sonra parçacıklar DI su yaklaşık 1 mL resuspend. Film döküm çözüm parçacıklar 2.5 mg/mL parçacıkların son parçacık konsantrasyonu için ekleyin.
- 10 mL aliquots parçacık süspansiyon içine 75 x 50 mm dikdörtgen Petri yemekler tek boyutlu germe veya 15 mL aliquots içine iki boyutlu germe için 100 x 100 mm kare Petri yemekler pipette. Kabarcıklar ya pipet tarafından veya kenara iterek kabarcıklar kaldırmak ve bir kimyasal başlıklı filmleri kuru gecede izin.
- Filmler kurumuş bir zamanlar filmleri plastik yemekleri cımbızla çıkarın ve filmlerin kenarları makasla kesme. Kenarları küresel tanecik olarak kullanılmak üzere bir 50 mL konik tüp kaydedin.
- Bir film bir film Alüminyum blok üzerine monte ederek aygıt uzanan otomatik ince film üzerine yükleyin. 1 D germe için alüminyum blok sedye (Şekil 2) bir eksen üzerine film kısa kenarlarını iki film arasında iki adet neopren lastik koyarak bağlayın. Bir Allen anahtarı, vida kullanılarak metal üzerine film tutmak için kauçuk kulpları. 2D germe için her iki eksen (Şekil 2) germek için dört Alüminyum blok üzerine tüm dört kenarları bağlayın.
- Ölçmek ve Alüminyum blok 1 D germe için bir eksen veya 2D germe için her iki eksen arasında film uzunluğu kaydedin. Bir veya iki yönde istenen kat-streç üzerinde dayalı film germek için gerekli mesafe hesaplamak.
- Film yüklü germe cihazın 90 ° c fırında yerleştirin ve film 10 dakika içinde sıcaklığına getirmek. Büyük bir ölçek su küçük bir miktar ile fırında yerleştirin.
- Streç film.
- Germe tamamlandığında, germe aygıt Fırından çıkarın ve film için oda sıcaklığında 20 dakika soğumaya.
- 1 D germe için germe aygıt filminden kenarlarında kesti. 2D germe için dışarı ve kurtarmak liflerin düzenli bir biçimde gerilir filmin kare merkezi her iki eksende kesti. Konik tüpleri ile tüp başına 2 filmleri filmleri koyun ve filmin geri kalanı atın.
- Filmleri çözünene kadar yaklaşık 25 mL DI su her konik tüp ve girdap ekleyin.
- Bir kez filmleri çözülür, parçacıklar 3 kez DI su ile yıkayın.
- Microparticles için konik tüpler 50 mL ve santrifüj 3000 x g de 5 dakika doldurmak, süpernatant dökün, DI su ve girdap parçacıklar resuspend yaklaşık 20 mL ekleyin.
- Nano tanecikleri, yüksek hızlı santrifüj tüpleri ve 15 dakika boyunca 40.000 x g, santrifüj transfer parçacıklar için süpernatant dökün, DI su ve girdap parçacıklar resuspend yaklaşık 20 mL ekleyin.
- Sonra üçüncü yıkama, parçacıklar DI su yaklaşık 1 mL resuspend. Microcentrifuge tüp ağırlığı kaydetmek ve parçacıklar tüp ekleyin. -80 ° C dondurucu parçacıklar 1 saat veya flaş dondurma için sıvı azot içinde dondurmak. Bir kez dondurulmuş, parçacıklar bir gecede lyophilize.
- Liyofilize parçacıklar microcentrifuge tüpte tartmak ve kaydedilen liyofilize parçacıklar ağırlığını belirlemek için boş tüp ağırlığını çıkarma.
3. yüzey Protein konjugasyon yapay antijen sunan hücreler oluşturmak için
- 2-(N-Morpholino) hazırlamak ethanesulfonic asit (MES) arabellek. MES 0.1 M çözümünün suda yapmak ve 6.0 için pH titrasyonu ile 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ayarlayın.
- Liyofilize PLGA/PBAE mikro/nano tanecikleri 20 μg/mL MES arabelleği, vortexing tarafından resuspend. Polipropilen microcentrifuge tüp MES arabellek 900 μL ile doldurun ve tüp 100 μL parçacık çözüm ekleyin.
- EDC/NHS çözüm hazırlamak. 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ve 48 mg N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) 1 mL MES arabelleği geçiyoruz.
- 100 μL EDC/NHS çözüm parçacıklar ve girdap karışımı ekleyin.
- Oda sıcaklığında bir inverter metroyla 30 dakika boyunca kuluçkaya.
- Microparticles 5000 x g de 5 dakika veya 17.000 x g de nano tanecikleri için 5 dakika boyunca spin aşağı. Süpernatant atın ve 2-3 W, vortexing (microparticles) veya sonicating 1 ml PBS için 5 saniye (nano tanecikleri) resuspend.
- Microparticles için parçacıklar için 8 μg istenen sinyal 1 protein ve 10 μg Anti-fare CD28 (klon 37.51) ekleyin. Nano tanecikleri için 16 μg sinyal 1 ve 20 μg Anti-fare CD28 ekleyin. PBS için 1.1 mL tüp ses getirmek ekleyin.
- 4 ° C'de bir inverter tüp gecede kuluçkaya.
- Ertesi gün, parçacıklar yıkayın. Microparticles 5000 x g de 5 dakika veya 17.000 x g de nano tanecikleri için 5 dakika boyunca spin aşağı. Süpernatant atmak ve vortexing (microparticles) veya 2-3 W, sonication için 5 saniye (nano tanecikleri) 1 mL steril PBS parçacıkları resuspend. İki kez tekrarlayın.
- Acil kullanım için kültür ortamda istenen konsantrasyon, parçacıkları resuspend. Uzun süreli depolama için parçacıklar 10 mg/mL 100 mM sükroz çözümünde, resuspend. Dondurma, lyophilize ve-80 ° C'de parçacıklar depolamak
4. karakterizasyonu ve aAPC değerlendirilmesi
- AAPC boyutu ve şekli (Şekil 3) karakterizasyonu
- Microparticle boyutu ve şekli Tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanarak görüntüleme moleküller tarafından karakterize. SEM için görüntüleme, yaymak liyofilize parçacıklar karbon teyp üzerine bir alüminyum yapıştırılır çakmak ve ceket altın-Paladyum şaplatın.
- Analiz boyutu ve boy oranı parçacıkların görüntü analiz yazılımı kullanarak.
- Parçacık boyutunu belirlemek için ölçek çubuğu kullanarak ölçeği ayarlayın ve parçacık çapı ölçmek. Ortalama partikül çapı belirlemek ve parçacık boyutlarda bir çubuk grafik oluşturmak yaklaşık 100 parçacıklar için yineleyin.
- En boy oranını belirlemek için uzun eksen ve parçacıkların kısa eksen arasında mesafeyi ölçmek ve uzun eksen kısa eksen tarafından bölmek. Yaklaşık 50 parçacıkların her şekil için Ortalama partikül boyut oranını belirlemek ve çubuk grafikler oluşturmak için her şekil için yineleyin.
- Nanopartikül boyutu ve şekli parçacıklar transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak Imaging tarafından karakterize. Analiz boyutu ve görüntü analiz yazılımı 5.1.2 içinde açıklandığı gibi kullanarak nano tanecikleri en/boy oranı. Alternatif olarak, dinamik ışık saçılma (DL) veya izleme çözümlemesi (NTA) nanopartikül kullanarak küresel nanopartikül boyutunu ölçmek.
- Protein konjugasyon verimliliği
- AAPC 1-3, yöntemlerine göre hazırlamak adım 3.7 fluorescently etiketli sinyal 1 protein ve anti-fare CD28 kullanır Konjügasyon ve yıkama sonra 1 ml PBS 2 mg/mL aAPC son bir konsantrasyon için aAPC resuspend.
- Siyah polistren 96-şey Mikroplaka protein standartları hazırlamak. 5 μg fluorescently etiketli sinyal 1 protein için PBS plaka ilk iyi ekleyip 10 1:2 dilutions PBS içinde plaka satır boyunca. Son iyi boş bırakın. Standartlar fluorescently etiketli anti-CD28 ile başka bir dizi oluşturmak için bu adımı yineleyin.
- AAPC çözümün 100 μL pipet Çoğalt Kuyu yapımı siyah polistren Mikroplaka nüsha olarak içine.
- Floresans uygun dalga boylarında bir floresan plaka okuyucu üzerinde okuyun. Protein standartın floresans okumalar her floresan antikor için standart eğriler oluşturmak için kullanın. Standart eğri kullanarak, sinyal 1 konsantrasyonları ve anti-CD28 her örnek iyi hesaplamak ve sonra yüzey protein ve fiil verim (Şekil 4A, Şekil 5A) miktarını hesaplamak.
- CD8 + T hücreleri vitro uyarılması için aAPC değerlendirilmesi
- B ortam hazırlamak (RPMI orta takıma L glutamin, %10 FBS, %1 Non-gerekli amino asit çözeltisi, % 1 Sodyum pyruvate, %1 MEM vitamini çözüm, ile 92 mikron β-mercaptoethanol, 10 ng/mL siprofloksasin ve 30 U/mL IL-2.
- Siyah 6 fare karbon dioksit maruz kalma yoluyla kurban.
- Bir daha önce oluşturulmuş protokol16göre fareden dalak hasat. Dalak ile 10 - 50 mL konik tüp içinde toplamak 15 mL PBS. Bir havaneli ile kullanarak, dalak 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL konik tüp içine püre. Ezme sırasında süzgeç 40 mL PBS ile yıkayın.
- 300 x g de splenocytes 5 dakika boyunca spin. Süpernatant dökün ve 4 mL kırmızı kan hücreleri parçalayıcı Ack Lysing arabellek splenocytes resuspend. Oturmak için tüp 1 dakikalığına rahatsız edilmeden izin verin ve sonra PBS için 20 mL tüp ses getirmek ekleyin.
- 300 x g de hücreleri 5 dakika boyunca spin. PBS 1 mL hücrelerde resuspend ve süpernatant dökün. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- 300 x g de hücreleri 5 dakika boyunca spin ve hücre ayrılık Arabellek istenen hacmi resuspend. CD8 + T hücreleri CD8 + negatif seçim T hücre izolasyon kit, üreticinin protokol sonrası kullanarak tek hücre süspansiyon yalıtmak.
- Manyetik ayırma, CD8 + T hücreleri 300 x g, beş dakikalığına spin ve hücre ayrılık arabellek kaldırma. PBS 1 mL hücrelerde resuspend ve hücreleri saymak. Hücre carboxyfluorescein succinyl ester (CFSE) göre üreticinin iletişim kuralı ile etiketleyin.
- 8,333 CD8 + T hücreleri ve 0.0833 mg (veya istenilen doz) aAPC 150 μL B medya her iyi bir 96 kuluçkaya de U-alt plaka doku kültürü tedavi.
- 37 ° C de 7 gün kuluçkaya. 3-4 gün sonra her şey için 75 μL taze orta ekleyerek kültür orta yenileyin.
- Kuluçka 3 gün sonra nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirmek için bir akış sitometresi hücrelerdeyse etiketli CFSE analiz. Her tepe akış sitometresi CFSE histogramı birbirini izleyen her hücre bölünmesi ile hücre CFSE seyreltme nedeniyle bir nesil temsil eder.
- 7 gün sonra her şey hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın. Sayma önce ölü hücreleri bir Trypan mavi çözüm ile leke. Ölü hücreleri son hücre sayımları hariç. Son hücre konsantrasyonu kat genişleme (Şekil 4 ve Şekil 5) hesaplamak için başlangıç konsantrasyonu normalleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir şematik cihaz germe otomatik 2D ince film için Şekil 1' de verilmiştir. Bir şematik ve aygıt uzanan ince bir 1 D film için açıklama sedye Alüminyum parçalar standart frezeleme ve işleme teknikleri kullanarak inşa edilmiştir Ho ve ark.17 verilir. Benzer şekilde 1D sedye, 2D sedye metalik kulpları ve kılavuz raylar oluşur. Çift yönlü Kurşun vidalar için dönme hareketi doğrusal çevirmek için kullanılır. Kurşun vida yeterli tork ile aynı Step motorlar için mekanik musluklar ile ekli vardır. 8 step motor kontrol kabloları 8 iğneli ısıya dayanıklı amphenol konektörler kolay bağlantı denetimi konsolunu ince film germe için bir fırın için üzerine lehimli. Kaplama-politetrafloroetilin (PTFE) tel yeterli uzunlukta Step motorlar sürücüleri kontrol konsolunda bağlanmak için kullanılması gerekir. Önerilen bilgisayar kontrol şeması Şekil 1A' verilir. Iki motorlar 2 bağımsız sürücüleri için ısıya dayanıklı kablo üzerinden bağlanmanız gerekir. İki sürücü sonra bir mikroişlemci arabirimine bir bilgisayar ile bağlı gerekir. Sürücüler için x ekseni bağlantısının kurulması ve y ekseni üzerinde mikrodenetleyici verir. Sürücüleri ve mikroişlemci bir harici güç kaynağı gerektirir. Bu üç bileşenden güç kaynağı bağlama önce 4 A sigortayı bileşenleri geçerli aşırı korumak için güç bağlantıların her biri arasında eklenmesi önerilir. Son olarak, mikrodenetleyici bir erkek DB25 erkek kablosu ile bir bilgisayara bir paralel bağlantı noktası giriş yolu ile bağlantılı olabilir. Step motorlar kontrol etmek için kullanılan elektronik ısı duyarlı olduğunu ve bu nedenle işlem sırasında ince filmler germe etkinleştirmek için yeterli sıcaklığa ısıtmak için kullanılan herhangi bir ısı kaynağı (örneğin, bir fırın) dışında yerleştirilmesi gerekir. Önerilen motorlar ısıya dayanıklı parçacıklar germe için bu protokolü belirtilen sıcaklık kadar olmasına rağmen ana güç kaynağına takılı oldukları süre motor ve sürücüleri ek ısı kadar inşa edecek. Bu nedenle, bu cihazın sadece gerçek film potansiyel ısı birikmesi en aza indirmek için uzanan dönemde etkinleştirilmesi önerilir.
PLGA nano - ve microparticles bu protokol için açıklanan ve TEM (Şekil 3A) ve SEM (Şekil 3B), sırasıyla kullanarak yansıma tek emülsiyon teknikleri kullanarak sentez. Küresel nano tanecikleri vardı DLS ve 224 tarafından ölçülen 237.3 ± 4.0 nm çapında NTA (Şekil 3 c) tarafından ölçülen nm. Microparticles 3 ± 1 mikron (şekil 3D) bir ortalama çapı ile küresel parçacıklar üretmek için 5000 devirde homojenizasyon tarafından sentezlenen. Parçacıklar oblate ellipsoidal parçacıklar üretmek için muhtemelen ellipsoidal nano - ve microparticles oluşturmak için bir boyut 90 ° C'de cihaz germe ve iki boyutta 70 ° C'de gergin otomatik film kullanarak gergin. Tüm üç şekiller microparticles boy oranları uzun eksen ve parçacıkların kısa eksen mesafe ölçme ve iki bölme analiz edildi. Küresel microparticles 1,05 ± 0,04 en-boy oranı, 1 D Muhtemelen gergin iken ellipsoidal parçacıklar 3.6 ± 0,8 (Şekil 3E) daha büyük bir en boy oranı vardı. 2D gergin oblate ellipsoidal parçacıklar 1.2 ± 0.2, kabaca bakımı bir en boy oranı en boy oranı vardı.
EDC/NHS tepki Kimya bir fluorescently etiketli peptid yüklü MHC IgG dimer ve anti-CD28 antikor gergin ve küresel PLGA parçacıkların yüzeyine çekimlerine kullanıldı. Fiil verim sonuçları benzer miktarda protein küresel ve ellipsoidal mikro-aAPC (Şekil 4A) ve nano-aAPC (Şekil 5A) yüzeyinde göstermek ve aAPC sentezi sırasında kaplin protein içinde oluştuğunu göstermek bir konsantrasyon bağımlı bir şekilde. Şekil aAPC işlevselliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için küresel ve muhtemelen ellipsoidal aAPC gp100 yüklü MHC IgG dimer ile Birleşik ve anti-CD28 PMEL transgenik CD8 + T hücreleri uyarmak için kullanılmıştır. T hücreleri ile CFSE etiketli ve nükleer silahların yayılmasına karşı (Şekil 4B, 5B) değerlendirmek için 3 gün sonra akış sitometresi tarafından değerlendirildi. Muhtemelen ellipsoidal aAPC T hücre çoğalması alt doyurarak dozda yüksek düzeyde küresel aAPC, daha iyi ayırmalı 0.01 mg doz elde ikna etmek için bulunmuştur. 7 gün sonra el ile T hücreleri sayıldı. Muhtemelen ellipsoidal aAPC daha etkili bir şekilde küresel karşılıkları nano (Şekil 5C) ve microscale (Şekil 4 c) göre T hücreleri uyarılmış ve doz bağımlı T hücresi genişletmeye gözlendi.
Şekil 1: otomatik ince film sedye şematik gösterimi. (A) ince film sedye denetim uçbirimini şematik. (B) ince film sedye için mekanik donanım şeması. (Sol) Mekanik donanım genel bakış. (Sağ) İnce filmleri için mekanizma sürükleyici bir kesit. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Polimer parçacıkları anizotropik şekiller halinde germek için birleştirilmiş otomatik ince film sedye fotoğraflarını. Cihaz germe 2D ince film film kavrama alüminyum bağlar ile iki eksen oluşur. İki eksen Kurşun vidalar karşıt yönde yerleştirildiği birbirlerine dışında hareket ediyorlar. Germe işlemi otomatikleştirmek için bir USB bağlantılı mikrodenetleyici sinyallere tek kutuplu Step motorlar termal bir kablo üzerinden geçiş iki Step motor sürücüler bağlıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: küresel ve ellipsoidal PLGA parçacıkların boyutu ve boy oranı analiz. (A) TEM ve (B) SEM görüntüleri küresel, 1D Muhtemelen ellipsoidal ve 2D gergin oblate ellipsoidal PLGA (A) nano tanecikleri ve (B) microparticles uzanıyordu. (C) küresel nano tanecikleri NTA tarafından boy ve 224 olduğuna karar nm çapındadır. PLGA microparticles SEM görüntüleri küresel partiküller (D) boyut dağılımı ve (E) boy oranları tüm parçacık şekil için analiz edildi. (C) çoğaltılamaz ve adapte ile izin küçük13, telif hakkı Wiley-VCH 2015. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: karakterizasyonu ve işlevsel değerlendirme küresel ve muhtemelen ellipsoidal mikro-aAPC. (A) konjugasyon verimliliğini fluorescently etiketli peptid yüklü MHC IgG dimer ve anti-CD28 antikor küresel ve muhtemelen ellipsoidal microparticles yüzeyine. (B) CD8 + T hücreleri ile CFSE etiketli ve küresel ve 1 D gergin mikro-aAPC 0,01, 0,1 ve 1 mg doz veya sigara konağımız denetimleri ile inkübe edildi. 3 gün sonra hücrelerin proliferasyonu değerlendirmek için akış sitometresi tarafından değerlendirildi. (C) T hücreleri manuel sayarak 7 gün sonra da değerlendirildi. Hücre sayısı kat-genleşme hesaplamak için ilk sayımı için normalleştirilmiş. Muhtemelen ellipsoidal ve küresel kat genişleme arasında karşılaştırma için * = p < 0,05, ** p < 0,01, = ve *** p < 0,001 =. Hata çubukları için 3 çoğaltır standart hata ortalamaya (SEM) temsil eder. Biyomalzeme12, telif hakkı Elsevier 2014 çoğaltılamaz ve adapte ile izni. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: karakterizasyonu ve işlevsel değerlendirme küresel ve muhtemelen ellipsoidal nano-aAPC. (A) konjugasyon verimliliğini fluorescently etiketli peptid yüklü MHC IgG dimer ve anti-CD28 antikor küresel ve muhtemelen ellipsoidal nano tanecikleri yüzeyine. (B) CD8 + T hücreleri ile CFSE etiketli ve küresel ve muhtemelen ellipsoidal nano-aAPC 0,01, 0,1 ve 1 mg dozda değişen kat streç ile inkübe edildi. 3 gün sonra hücrelerin proliferasyonu değerlendirmek için akış sitometresi tarafından değerlendirildi. (C) T hücreleri (1.5 ile 3.5 için değişen) kat streç değişen muhtemelen ellipsoidal parçacıkları ile inkübe manuel sayarak 7 gün sonra da değerlendirildi. Hücre sayısı kat-genleşme hesaplamak için tedavi edilmemiş bir koşul için normalleştirilmiş. * = p < 0,05, ** p < 0,01, = ve *** p < 0,001 için küresel karşılaştırıldığında =. Hata çubukları için 3 çoğaltır standart hata ortalamaya (SEM) temsil eder. Çoğaltılamaz ve adapte ile izin küçük13, telif hakkı Wiley-VCH 2015. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı anizotropik polimer parçacıkları kesin üretimi için çok yönlü bir yöntemi ayrıntıları. Ölçeklenebilir, tekrarlanabilir ve ucuz burada açıklanan tekniği uzanan ince filmidir. Yönbağımlı parçacıklar üretmek için alternatif teknikleri yüksek maliyetli, düşük performans ve sınırlı partikül boyutu da dahil olmak üzere birçok sınırlamalar acı. Yaklaşım uzanan ince film parçacıklar sonra sentez anizotropik olmak değiştirilir de avantajlı çünkü ve sonuç olarak, Parçacık boyut ve sentez teknikleri çok çeşitli uyumludur. Şekil 1 otomatik iki boyutlu germe aygıt kurulum ayrıntıları. Bu cihaz, elektronik bileşenleri el ile film germe istenen derecesi ulaşmıştır kadar vidaları çevirerek de kullanılabilir. Ancak, otomatik işlemin çok daha tutarlı ve el ile işlem15' ten hızlı olduğunu bulduk. Yönbağımlı parçacıkları, mikrosıvısal yaklaşımlar17,18,19, katman katman kaplama21ve diğer tabandan tavana sentez yaklaşımlar21 gibi sentezlemek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir ,22. Ancak, bu yaklaşımların parçacık geometri üzerinde güçlü kontrol etkinleştirmeyin ve şekiller oluşturulabilir ve kullanılabilir parçacık malzemeler açısından kadar çok yönlü değildir. Nonspherical parçacıklar imalatı için popüler bir tepeden parçacık çoğaltma sigara-ıslatma şablonları (Yazdır)24saat içinde yöntemdir. Yazdırma parçacık şekil üzerinde kesin denetim sağlasa da, pahalı makine gerektirir ve olarak erişilebilir ve basit yöntem uzanan ince film uygulamak değil.
Tek emülsiyon teknik PLGA parçacıkların nano microscale12,13arasında değişen çeşitli boyutlarda imal etmek kullanılabilir. Tarafından değişen homojenizasyon hız veya sonication genlik, microparticle ve nanoparçacık boyutu, sırasıyla, modülasyonlu. Küresel partiküller oluşturduktan sonra burada açıklanan yöntemi uzanan ince film parçacıkları çeşitli şekiller15deforme için kullanılabilir. Bu protokol için tarif biz muhtemelen ve oblate ellipsoidal parçacıklar nesil bir ya da iki boyutlu olarak sırasıyla yayarak. Küresel partiküller PLGA cam geçiş sıcaklığı ısıtmalı ve bir ya da iki boyutlu olarak parçacıklar deforme gerilmiş ince bir plastik film içine dökme. Parçacıklar en/boy oranı son derece kontrol edilebilir. Film streç derecesini ayarlama, parçacıkları en/boy oranı modülasyonlu ve bulduk bu ölçülen Parçacık boyut oranı son derece öngörülen değeri12,13ile ilişkilidir. Diğer çeşitli şekillerle germe sırasında sıcaklık veya germe derecesi değiştirerek oluşturulur. Örneğin, kırmızı kan hücreleri şeklini andıran biconcave Diskoidal parçacıklar 90 ° C'de microparticles 1.5-fold içinde iki boyutları yayarak oluşturulabilir 15. germe tekniği bu film de küresel polistren parçacıklar solucanlar, varil ve dikdörtgen diskler21de dahil olmak üzere birçok anizotropik şekillere dönüştürmek için kullanılmaktadır. Cihazın daha fazla işlem yapmak için Şekil 1 ' de gösterildiği gibi otomatik olarak veya el ile vidaları kontrol ederek cihaz germe film kullanılabilir etkin ve tutarlı15. Bu basit tekniği güvenilir bir şekilde onların şekil24fizyolojik koşullar altında tutmak anizotropik parçacıkları üretir. Ayrıca, bu yöntem diğer polimer malzemeler için Ayrıca PLGA için polycaprolactone gibi (PCL) uygulanmış ve hibrid parçacıklar yapılan PLGA ve poli (beta-amino ester) (PBAE).
Bu iletişim kuralı da nasıl PLGA parçacıklar, çeşitli boyut ve şekil aAPC davranmaya CD8 + T Hücre aktivasyonu için gerekli yüzey proteinleri ile Birleşik açıklar. Proteinler kovalent konjuge anizotropik ve küresel PLGA mikro ve nano tanecikleri EDC/NHS aracılı kaplin karboksil grupları parçacık yüzeyinde protein üzerinde birincil aminlerin tarafından olabilir. Bu protokol için açıklandığı gibi parçacıkların yüzeyine fluorescently etiketli protein kaplin tarafından protein konjugasyon verimliliğini ölçülebilir ve bu teknik parçacıklara % 15-20 verimliliği12protein çiftler bulduk, 13. Muhtemelen ellipsoidal mikro - ve nanoparçacık aAPC CD8 + T etkinleştirme, küresel karşılıkları yayılma ve genişleme vitro12,13hücre daha etkili. Ellipsoidal aAPC Gelişmiş bağlama ve onların daha büyük yüzey alanı kişi12nedeniyle T hücreleri ile etkileşim. Yönbağımlı parçacıklar da küresel partiküller vivo içinde gelişmiş biodistribution ve fagositoz13direnç nedeniyle üzerinde üstün özellikleri var. Bu platform çok modüler ve birçok başka ilaç teslim uygulamalar için adapte potansiyeline sahiptir. Bu yordamı kullanarak, akort şekli ve boyutu polimer parçacıkları oluşturulabilir ve parçacık yüzey ilgi herhangi bir protein ile Birleşik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891) ve KRR (DGE-1232825) NSF yüksek lisans araştırma bursu program destek için teşekkür ederim. RAM teşekkür Ulusal Araştırma hizmet ödülü NIH ncı F31 (F31CA214147) ve üniversite bilim adamları burs desteği için başarı ödülleri. Yazarlar teşekkür NIH (R01EB016721 ve R01CA195503), körlüğü James önlemek ve Carole ücretsiz Catalyst Ödülü, araştırma ve destek için kanserli hastalarda JHU Bloomberg-Kimmel Enstitüsü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
