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Artigo de método

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

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DOI:

10.3791/58345

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13 de setembro de 2018

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1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

Neste artigo

Resumo

Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.

Resumo

Câncer de bexiga é um problema significativo para a saúde. Estima-se que mais de 16.000 pessoas morrerão este ano nos Estados Unidos de câncer de bexiga. Enquanto 75% dos cânceres de bexiga são invasivos e improvável que metastatizam, cerca de 25% de progresso para um padrão de crescimento invasivo. Até metade dos pacientes com câncer invasivo desenvolverá letal recaída metastática. Assim, compreender o mecanismo de progressão invasiva no câncer de bexiga é crucial para prever os resultados dos pacientes e prevenir metástases letais. Neste artigo, apresentamos um modelo de invasão do câncer tridimensional que permite a incorporação de células tumorais e componentes do estroma para imitar na vivo condições ocorrem no microambiente do tumor de bexiga. Este modelo fornece a oportunidade de observar o processo invasivo em tempo real utilizando imagens de lapso de tempo, interrogar as vias moleculares envolvidos usando compostos de imagem e tela de imunofluorescência confocal com o potencial de invasão de bloco. Enquanto este protocolo centra-se em câncer de bexiga, é provável que métodos semelhantes poderiam ser usados para examinar a invasão e a mobilidade, bem como outros tipos de tumor.

Introdução

Invasão é um passo fundamental na progressão do câncer, que é necessário para a metástase e está associado a baixa sobrevivência e mau prognóstico em pacientes. Em câncer de bexiga humana, a mais comum malignidade do tracto urinário, o que faz com que cerca de 165.000 mortes por ano em todo o mundo, prognóstico, tratamento e estágio do câncer estão diretamente relacionadas com a presença ou ausência de invasão1. Cerca de 75% dos casos de câncer de bexiga são não-músculo invasivo e são gerenciados com ressecção local. Em contraste, os cânceres de bexiga músculo-invasivos (cerca de 25% dos casos) são tumores agressivos com altas taxas de metástases e são tratados com terapia de multimodalidade agressivo2,3. Portanto, compreender as vias moleculares que desencadeiam a invasão é essencial para melhor caracterizar o risco de progressão invasiva e desenvolver intervenções terapêuticas que podem impedir a progressão invasiva.

Progressão do tumor invasivo ocorre num ambiente complexo tridimensional (3D) e envolve a interação de células de tumor com outras células do tumor, estroma, membrana basal e outros tipos de células, incluindo células do sistema imunológico, fibroblastos, células musculares e vasculares células endoteliais. Permeável ao suporte (por exemplo, Transwell), sistemas de ensaio são comumente empregados para dosar de invasão de células de câncer4, mas esses sistemas são limitados porque não permitem monitoramento microscópico do processo de invasão em tempo real e a recuperação de amostras para análise molecular e ainda mais a coloração é um desafio. Desenvolvimento de um sistema de esferoide de tumor de bexiga em 3D para estudar a invasão é desejável porque permite a incorporação de componentes microenvironmental definidos com a conveniência de sistemas em vitro .

Neste protocolo, descrevemos um sistema para interrogar os processos invasivos de células de câncer de bexiga humana usando um ensaio de invasão de esferoide 3D incorporando as matrizes de gel à base de colagénio e microscopia confocal para permitir que os investigadores monitorar a motilidade celular e invasão em tempo real (Figura 1A). Este sistema é versátil e pode ser modificado para interrogar várias configurações/tumor estromal. Pode incorporar a maioria das linhas de células de câncer de bexiga ou bexiga primário tumores e células estromais adicionais tais como cancro associado fibroblastos e células do sistema imunológico5,6,7. Este protocolo descreve uma matriz composta de colágeno tipo 1, mas pode ser modificado para incorporar outras moléculas como fibronectina, laminina ou outras proteínas de colágeno. Processos invasivos podem ser seguidos por 72 horas ou mais dependendo da capacidade do microscópio e sistema utilizado. Fixação e mancha do tumor incorporado na matriz em 3D, antes, durante e depois da invasão da imunofluorescência permite o interrogatório de proteínas upregulated em células invasoras, assim fornecendo informações cruciais que geralmente ausente ou difícil de reunir usando outros modelos de cultura em 3D. Este sistema também pode ser utilizado para compostos de tela que bloqueiam a invasão e para delinear as vias de sinalização afectadas por tais compostos.

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Protocolo

1. crescente esferoides de câncer

  1. Crescimento de linhagens celulares
    1. Células de câncer de bexiga humana cultura sob convencional aderente as condições de cultura de células e mantêm em uma incubadora de 37 ° C, fornecida com 5% de CO2. Manter as células no < confluência de 90%.
      Nota: meios de cultura utilizados é de Dulbecco modificado mídia essencial mínima (DMEM) contendo 4,5 g/L D-glicose, piruvato de sódio de 110 mg/L, L-glutamina e fornecido com 10% soro bovino fetal (FBS) ao longo do presente protocolo.
    2. Um dia antes do início do experimento, trypsinize (usando 0,25% Trypsin-EDTA) células, quantificar a concentração de células e distribuir 1 x 106 células em meios de cultura 3 mL em cada poço de uma placa de fixação 6-poços ultra baixo.
    3. Incube as células em condições de fixação baixo a 37 ° C para ≥16 h. Isto deve permitir um tempo adequado para as células para agregar em esferoides para a maioria das linhas de células de câncer de bexiga.
      Nota: A formação de esferoides pode ser observada pelo microscópio invertido de campo brilhante. O tamanho ideal e o número de esferoides podem depender de experiências individuais, mas achamos que esferoides com diâmetro de 50 µm a 150 µm são geralmente adequados para a imagem latente de lapso de tempo usando uma lente de objetiva X 20.
    4. Para incorporar tipos de células adicionais, como fibroblastos ou células imunes para os esferoides, misturar as células desejadas com células cancerosas na proporção desejada (1:1, 01:10, etc.) em um anexo de ultra baixo da placa e incubar a 37 ° C para ≥16 h permitir a formação de mistura de células tipo esferoides.
  2. Crescimento de tumores primários
    Nota: Tumor esferoides também podem ser derivados de tumor de bexiga primário fontes tais como tumores, desenvolvidos a partir de modelos de tumor de bexiga induzida por substância cancerígena8. Por exemplo, tumores de bexiga, gerados a partir de ratos alimentados com N-butil - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamina (BBN), podem ser colhidas e picada em pedaços pequenos (cerca de 0,5 mm3) usando instrumentos cirúrgicos estéreis. Digerido amostras primárias da bexiga humana cânceres também podem ser estudados neste sistema.
    1. Recolher e lavar os pedaços de tumor de3 0,5 mm em 5 mL gelada fosfato salino (PBS). Centrifugação a 200 x g por 5 min a 4 ° C. Repita essa etapa de lavagem uma vez.
    2. Recolher pedaços de tumor por centrifugação a 200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e adicionar 5 mL de DMEM contendo 10% FBS. Transfira a mistura de esferoide/mídia de tumor em uma chapa de fixação 6-poços ultra baixo. Incubar a 37 ° C para ≥16 h antes da incorporação em matriz de colagénio (ver passo 2.3).

2. preparar a câmara de cultura 3-d

  1. Diluir o colágeno tipo 1 (derivado de rabo de rato) em DMEM contendo 10% FBS para fazer uma mistura de 2 mg/mL de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Em suma, misture colágeno com quantidade adequada de solução de NaOH N 1 e DMEM pipetando suave baseado as instruções do fabricante para atingir pH fisiológico.
    2. Depois de misturar colágeno e DMEM, rapidamente revestir os poços do slide câmara (para a maioria dos aplicativos, slides de câmara com um vidro de cobertura número 1.5 é ideal) com a mistura de colágeno-DMEM antes da solidificação (200 µ l/poço). Permitir que o slide de câmara revestido ser estacionária em temperatura ambiente por 15 min.
      Nota: A composição da matriz baseada em colágeno pode ser modificada com a adição de outros ingredientes, matriz extracelular, como fibronectina ou laminina, de acordo com os fins da experiência.
  2. Delicadamente Pipetar 500 µ l de mídia contendo esferoides (ou pedaços de tumor, se é utilizada a amostra do tumor primário) da placa de fixação ultra baixo 6-poços em um tubo de microcentrifugadora vazio 1,5 mL. Espere 2 min para deixar os esferoides resolver para o fundo do tubo.
  3. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Prepare um outro tubo de colágeno tipo 1 (2 mg/mL) misturado com DMEM contendo 10% FBS e rapidamente adicionar 500 µ l de mistura para os esferoides. Misture suavemente o esferoides e colágeno pipetando lento.
  4. Adicione 250 µ l de mistura de esferoides/colágeno para um poço de slide de colágeno-pré-revestidas de câmara. Permitir que a matriz de colagénio que contêm esferoides para solidificar completamente (cerca de 30 min a 37 ° C).
  5. Depois que a matriz de colagénio é solidificado, adicionar 1 mL de DMEM contendo 10% FBS a cada poço (Figura 1B). Incube o slide de câmara em uma incubadora de 37 ° C, fornecido com 5% CO2 até que esteja pronto para a imagem latente.

3. live Cell Imaging lapso de tempo

  1. Ligue o microscópio confocal, seguindo as instruções do fabricante e certifique-se de que a câmara climática atinge 37 ° C e é fornecida com 5% de CO2.
    Nota: Nosso microscópio e câmara normalmente requerem 1 h para atingir o equilíbrio do sistema.
  2. Transferi com cuidado o slide de câmara para o adaptador de slide anexado ao microscópio.
  3. Localize os esferoides de interesse usando um objectivo de baixa potência (por exemplo, 5 X) e começar a imagem com o objectivo de poder mais elevado (no atual protocolo, 20 objetivo X é usado pela maior parte a imagem de célula viva para sua melhor qualidade de imagem).
    Nota: Para amostras de tumor primário de bexiga, 5 X e 10 objectivos de X podem ser necessário a fim de cobrir a maior área de imagem. Para a nossa imagem de lapso de tempo, o intervalo de imagem é definido como 30 min e uma pilha de Z é usada para o spheroid todo da imagem. Tipicamente a distância entre Z-fatias é definida como 4 µm para a 20 X objetivo e a distância total do eixo Z é em torno de 200 µm. imagens podem ser obtidas usando DIC e fluorescência se células/tecidos abrigam marcadores de proteína fluorescente.
  4. Realize imagens de lapso de tempo de 24-72 h.
    Nota: A duração é determinada pelo tipo de célula e as necessidades do experimento.

4. preparação do bloco de amostra contendo câncer esferoides para corte de tecido congelado

  1. Cuidadosamente Retire o bloco do gel de colágeno e esferoides de slides a câmara usando pequenas pinças. Coloque o bloco do gel de colágeno em um molde de plástico histologia.
  2. Lave o gel de colágeno com 1X PBS brevemente e então corrigi-lo com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
    Cuidado: PFA é potencial cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado.
  3. Lave o gel de colágeno com 1,5 mL de 1X PBS num agitador de 15 min. substituir a PBS e repita a etapa anterior de lavar 3x.
  4. Aplique uma camada fina (cerca de 3 mm) da temperatura de corte ideal (OCT) composta para cobrir o fundo de um novo molde plástico da histologia. Coloque o fixo e gel de colágeno em cima da OCT lavado composto, então cuidadosamente incorporar o gel todo preenchendo o molde com OCT composto, evitando a formação de quaisquer bolhas de ar na OCT.
  5. Deixe o molde a 4 ° C, durante 1 h.
  6. Coloque o molde contendo a amostra e OCT composto em um prato de Petri de 100mm flutuando em nitrogênio líquido. Permitir que a amostra congelar completamente.
  7. Loja do bloco de amostra congelada a-80 ° C para uso futuro.

5. imunofluorescência Imaging para câncer secionado congelados esferoides

  1. O bloco de amostra congelada no freezer-80 ° C para a câmara de-20 ° C de um criostato de transferência.
  2. Execute corte congelado convencional definindo o intervalo de seção de 7 µm. Deixe amostras secionadas anexar para a lâmina de vidro, sem rugas ou preso o ar.
    1. Armazene os slides a-80 ° C antes de realizar a coloração ainda mais.
      Nota: Intervalos diferentes podem ser usados para atender às necessidades de experimentais.
  3. Ar seco os slides por 1h à temperatura ambiente.
  4. Permeabilize as amostras com PBS contendo 0,5% Triton X-100 por 15 min.
  5. Lavagem de amostras 3x com PBS por 10 min por lavagem.
  6. Cercam as amostras no slide com barreiras hidrofóbicos, usando uma caneta de barreira hidrofóbica.
  7. Trate as amostras com solução de bloqueio (1X PBS contendo 5% albumina de soro bovino (BSA)), por 1h à temperatura ambiente.
  8. Aplica 40 µ l de solução contendo anticorpos primária (1X PBS contendo 5% BSA com diluição de 1: 100 de anticorpo primário) para cada amostra no slide.
  9. Incube os slides no anticorpo primário a 37 ° C por 1 h ou na temperatura de quarto durante a noite (o tempo de incubação e condições variam dependendo do anticorpo primário).
  10. Lavagem de amostras 3x com PBS por 15 min (por lavagem).
  11. Aplica 40 µ l de solução contendo anticorpos secundária (1X PBS contendo 5% de BSA com diluição de 1: 300 anticorpo secundário) para cada amostra no slide.
  12. Lavagem de amostras 3x com PBS por 15 min (por lavagem).
  13. Manche as amostras com solução de Hoechst 33342 (1 µ g/mL, diluído em PBS) à temperatura ambiente por 10 min. Em seguida, lave as amostras com PBS por 5 min.
  14. Montar as amostras com meio de montagem e cubra-os com o tamanhos adequado de lamínulas. Deixe os slides no escuro à temperatura ambiente por 24 h e em seguida, executar a microscopia confocal.

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Resultados

Criação bem sucedida de esferoide de tumor de câncer de bexiga invasivo requer a formação de esferoides tumor tamanho de tumores primários ou linhas de célula. Figura 2 A mostra de esferoides apropriadamente dimensionados, desenvolvidos a partir de quatro as linhas da célula humana bexiga câncer (UC9-UM, UM-UC13, UM UC14, 253J e UM UC18). Figura 2 B mostra um esferoide de tumor de um tumor de bex...

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Discussão

Aqui descrevemos um modelo de esferoide de tumor em 3D que permite a observação em tempo real da invasão de câncer de bexiga que é crítico para metástase e progressão do câncer. Este sistema é favorável à incorporação de vários componentes do estroma e celulares para permitir que os investigadores melhor recapitular o microambiente do tecido onde ocorre invasão do câncer de bexiga. Esferoides de câncer da bexiga pode ser gerados a partir de várias fontes, tais como linhas de célula (incluindo linhas de células geneticame...

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Divulgações

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer o laboratório do Dr. Howard Crawford (Universidade de Michigan) para suporte técnico e fornecer materiais e equipamentos para este estudo e Alan Kelleher para suporte técnico.

Este trabalho foi financiado por doações da Universidade de Michigan Rogel Cancer Center núcleo Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Linhas celulares de câncer de bexiga humano UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
Meio de cultura de células DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Soro fetal bovino Thermo Fisher Scientific26140079
Antibiótico-Antimicótico (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolThermo Fisher Scientific25200056
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA3803
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 Thermo Fisher Scientific10010023
Costar Conjunto de 6 poços de fixação ultrabaixa Microscópio3471
Carl Zeiss491206-0001-000Uso geral para cultura de células e verificação de esferoides
Colágeno tipo 1 de cauda de rato, alta concentração Corning354249
Nunc Lab-Tek II Tampa de Vidro com CâmaraThermo Fisher Scientific155382
Microscópio Confocal Carl ZeissLSM800Um miscóscopo confocal com câmara climática, imagem multi-localização e função de varredura Z-stack 
Micromtoma criostatoLeica BiosystemsCM3050 S
Zen 2 Software de processamento de imagem Carl Zeiss
Solução de ParaformaldeídoCiências de Microscopia Eletrônica15710
ImmEdge Barreira Hidrofóbica PAP PenVector Laboratories Composto H4000
O.C.T Solução Thermo Fisher Scientific23730571
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249
Anti-ATDC (Trim29) anticorpoSigma-AldrichHPA020053
Anti-Citoqueratina 14Abcamab7800
Anticorpo Anti-VimentinaAbcamab24525
ProLong Diamond Meio de montagem
invertido convencional Corning

Referências

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