Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.
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Artigo de método
Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga
Neste artigo
Resumo
Resumo
Câncer de bexiga é um problema significativo para a saúde. Estima-se que mais de 16.000 pessoas morrerão este ano nos Estados Unidos de câncer de bexiga. Enquanto 75% dos cânceres de bexiga são invasivos e improvável que metastatizam, cerca de 25% de progresso para um padrão de crescimento invasivo. Até metade dos pacientes com câncer invasivo desenvolverá letal recaída metastática. Assim, compreender o mecanismo de progressão invasiva no câncer de bexiga é crucial para prever os resultados dos pacientes e prevenir metástases letais. Neste artigo, apresentamos um modelo de invasão do câncer tridimensional que permite a incorporação de células tumorais e componentes do estroma para imitar na vivo condições ocorrem no microambiente do tumor de bexiga. Este modelo fornece a oportunidade de observar o processo invasivo em tempo real utilizando imagens de lapso de tempo, interrogar as vias moleculares envolvidos usando compostos de imagem e tela de imunofluorescência confocal com o potencial de invasão de bloco. Enquanto este protocolo centra-se em câncer de bexiga, é provável que métodos semelhantes poderiam ser usados para examinar a invasão e a mobilidade, bem como outros tipos de tumor.
Introdução
Invasão é um passo fundamental na progressão do câncer, que é necessário para a metástase e está associado a baixa sobrevivência e mau prognóstico em pacientes. Em câncer de bexiga humana, a mais comum malignidade do tracto urinário, o que faz com que cerca de 165.000 mortes por ano em todo o mundo, prognóstico, tratamento e estágio do câncer estão diretamente relacionadas com a presença ou ausência de invasão1. Cerca de 75% dos casos de câncer de bexiga são não-músculo invasivo e são gerenciados com ressecção local. Em contraste, os cânceres de bexiga músculo-invasivos (cerca de 25% dos casos) são tumores agressivos com altas taxas de metástas....
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Protocolo
1. crescente esferoides de câncer
-
Crescimento de linhagens celulares
- Células de câncer de bexiga humana cultura sob convencional aderente as condições de cultura de células e mantêm em uma incubadora de 37 ° C, fornecida com 5% de CO2. Manter as células no < confluência de 90%.
Nota: meios de cultura utilizados é de Dulbecco modificado mídia essencial mínima (DMEM) contendo 4,5 g/L D-glicose, piruvato de sódio de 110 mg/L, L-glutamina e fornecido com 10% soro bovino fetal (FBS) ao longo do presente protocolo. - Um dia antes do início do experimento, trypsinize (usando 0,25% Trypsin-EDTA) células, quantificar....
- Células de câncer de bexiga humana cultura sob convencional aderente as condições de cultura de células e mantêm em uma incubadora de 37 ° C, fornecida com 5% de CO2. Manter as células no < confluência de 90%.
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Resultados
Criação bem sucedida de esferoide de tumor de câncer de bexiga invasivo requer a formação de esferoides tumor tamanho de tumores primários ou linhas de célula. Figura 2 A mostra de esferoides apropriadamente dimensionados, desenvolvidos a partir de quatro as linhas da célula humana bexiga câncer (UC9-UM, UM-UC13, UM UC14, 253J e UM UC18). Figura 2 B mostra um esferoide de tumor de um tumor de bex.......
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Discussão
Aqui descrevemos um modelo de esferoide de tumor em 3D que permite a observação em tempo real da invasão de câncer de bexiga que é crítico para metástase e progressão do câncer. Este sistema é favorável à incorporação de vários componentes do estroma e celulares para permitir que os investigadores melhor recapitular o microambiente do tecido onde ocorre invasão do câncer de bexiga. Esferoides de câncer da bexiga pode ser gerados a partir de várias fontes, tais como linhas de célula (incluindo linhas de células geneticame.......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer o laboratório do Dr. Howard Crawford (Universidade de Michigan) para suporte técnico e fornecer materiais e equipamentos para este estudo e Alan Kelleher para suporte técnico.
Este trabalho foi financiado por doações da Universidade de Michigan Rogel Cancer Center núcleo Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Linhas celulares de câncer de bexiga humano UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| Meio de cultura de células DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Soro fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiótico-Antimicótico (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Conjunto de 6 poços de fixação ultrabaixa | Microscópio | 3471 | |
| Carl Zeiss | 491206-0001-000 | Uso geral para cultura de células e verificação de esferoides | |
| Colágeno tipo 1 de cauda de rato, alta concentração | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Tampa de Vidro com Câmara | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Microscópio Confocal | Carl Zeiss | LSM800 | Um miscóscopo confocal com câmara climática, imagem multi-localização e função de varredura Z-stack |
| Micromtoma criostato | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Software de processamento de imagem | Carl Zeiss | ||
| Solução de Paraformaldeído | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15710 | |
| ImmEdge Barreira Hidrofóbica PAP Pen | Vector Laboratories | Composto H4000 | |
| O.C.T | Solução Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) anticorpo | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Citoqueratina 14 | Abcam | ab7800 | |
| Anticorpo Anti-Vimentina | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Meio de montagem |
Referências
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C.
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Reimpressões e permissões
