O9-1 é uma linhagem de células multipotentes rato crista neural. Aqui descrevemos protocolos passo a passo detalhados para cultivo de células O9-1, diferenciar células O9-1 em tipos de células específicas e manipulando geneticamente células O9-1 usando mediada por siRNA nocaute ou CRISPR-Cas9 edição do genoma.
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Artigo de método
Cultivo e manipulação das células da crista Neural de O9-1
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Células da crista neural (CNCC) estão migrando de células tronco que podem se diferenciar em diferentes tipos de células e dar origem a vários tecidos e órgãos. A linha de celular O9-1 é derivada o endógeno CNCC embrionárias de rato e mantém a sua multipotency. No entanto, em condições de cultura específica, O9-1 células podem se diferenciar em diferentes tipos de células e ser utilizadas em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. Recentemente, com a combinação de estudos de rato e de células O9-1, mostramos que o hipopótamo efetores da via de sinalização Yap e Taz desempenham importantes funções no desenvolvimento craniofacial crista neural-derivado. Embora o processo de cultivo de células O9-1 é mais complicado do que o utilizado para outras linhas de célula, a linha de celular O9-1 é um poderoso modelo para investigar a CNCC em vitro. Aqui, apresentamos um protocolo para a linha de celular O9-1 para manter a sua stemness, bem como protocolos para diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células, como células de músculo liso e osteoblastos de cultivo. Além disso, os protocolos são descritos para a realização de estudos de perda-de-função do gene em células O9-1 usando CRISPR-Cas9 exclusão e pequena interferência mediada por RNA "knockdown".
Introdução
Crista neural (CNCC) são células estaminais, como com uma notável capacidade migratória e transitória existência durante o desenvolvimento embrionário. CNCC originam entre o ectoderma superficial e o tubo neural e migra para outras partes do embrião durante o desenvolvimento embrionário1. Com base em seus domínios funcionais, CNCC pode ser classificados em vários tipos diferentes, incluindo crânio, tronco, vagal, sacral e cardíaca CNCC. Além disso, a CNCC pode se diferenciar em várias linhagens de células, como células musculares lisas, células ósseas e neurônios e dar origem a vários tecidos2,
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Protocolo
1. preparação antes da cultura de pilha O9-1
Nota: Mídia Basal usada para cultura de células O9-1 deve fomos condicionadas por Sandos pura ratos tioguanina/Ouabaína-resistente (STO) pilhas do rato dos fibroblastos; Portanto, as células STO precisam ser obtidos e preparados conforme descrito abaixo, antes de iniciar a cultura de pilha O9-1.
-
Cultura de célula activa STO
- Preparar a mídia para cultivo de células ativas de STO, fazendo de Dulbecco completa modificado mídia da águia (DMEM) com 7% de soro fetal bovino (FBS) (grau de cultura de células-tronco embrionárias), 100 U/mL penicilina, 100 µ g/mL Estre....
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Resultados
O objetivo das nossas experiências knockdown e nocaute foi estudar os efeitos de Yap e Taz perda-de-função nas células O9-1. Antes os experimentos knockdown e nocaute, temos que certificar-se que preparam para mídia basal e células de cultura O9-1 como descrito acima (por exemplo, necessidades de matriz membrana basal para cobrir a placa inteira como mostrado na Figura 1e O9-1 células recuperadas de nitrogênio líquido como mostrado na
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Discussão
O NCC é um contribuinte versátil e chave para diferentes tecidos e órgãos durante a morfogênese embrionária. A linha de celular O9-1 mantém seu potencial para se diferenciar em muitos tipos de células diferentes e imita as características na vivo do CNCC, tornando-o uma ferramenta útil em vitro para estudar a função dos genes e Regulamento molecular em CNCC. O status diferente de células O9-1 pode corresponder a diferentes crista neural progênie na vivo, dependendo das condições de cultura de c.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicações científicas do Instituto do coração do Texas, prestou apoio editorial. Agradecemos também as seguintes fontes de financiamento: nacional Center cientista desenvolvimento Grant a associação americana do coração (14SDG19840000 de J. Wang), o prêmio de pesquisa Lawrence 2014 do Rolanette e osso Lawrence Berdon doença programa do Texas (para J. Wang ) e os institutos nacionais de saúde (DE026561 e DE025873 para J. Wang, DE016320 e DE019650 de R. Maxson).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células alimentadoras ativas de STO | ATCC | ATCC CRL-1503 | Também disponível na forma inativada por mitomicina C, catálogo # ATCC 56-X |
| O9-1 linha celular de crista neural craniana de camundongo | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, glicose alta, sem glutamina | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, glicose alta | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (soro bovino fetal) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicilina - estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatina de pele suína | Sigma | G1890 | |
| Tripsina-EDTA 0,25% em HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco) sem cálcio ou magnésio | Lonza | 17-512F | |
| MEM aminoácidos não essenciais (MEM NEAA) 100Xx | Gibco | 11140-050 | |
| Piruvato de sódio (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO fator inibidor de leucemia (LIF) 106 unidade/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes-básico (rhFGF-básico) | R& D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomicina C | Roche | 10107409001 | |
| Matriz Matrigel | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimetilsulfóxido) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1x) | Gibco | 31985-070 | |
| Meio essencial mínimo, alfa 1x com sais de Earle, ribonucleosídeos, desoxirribonucleosídeos e L-glutamina | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (soro fetal de bezerro) | |||
| ITS (insulina-transferrina-selênio) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ácido | |||
| BMP2 (proteína morfogenética óssea 2) | |||
Referências
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
