Visualizar Drosophila perna neurônio Motor axônios através da cutícula adulto

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para visualizar o direcionamento axonal com uma proteína fluorescente em adultas pernas de drosófila por fixação, montagem, imagem e pós-imagem passos.

Resumo

A maioria dos trabalhos na especificação neuronal procedeu-se em genética e fisiologicamente tractable modelos como o C. elegans, Drosophila larvas e peixes, que todos se envolver em movimentos ondulatória (como rastreamento ou natação) como seu principal modo de locomoção. No entanto, uma forma mais sofisticada compreensão da especificação individual do neurônio motor (MN) — pelo menos em termos de informar terapias doença — exige um sistema igualmente tractable que modela melhor os esquemas complexos baseados em apêndice locomoção de vertebrados. O sistema locomotor Drosophila adulto responsável por andar reúne-se todos esses critérios com facilidade, já que neste modelo é possível estudar a especificação de um número pequeno de perna facilmente distinto MNs (aproximadamente 50 MNs por perna) ambos usando um vasto matriz de poderosas ferramentas de genéticas e no contexto de um sistema de locomoção baseada em apêndice fisiológico. Aqui descrevemos um protocolo para visualizar a inervação do músculo de perna em uma mosca adulta.

Introdução

Como o membro de vertebrados, a perna de Drosophila adulta é organizada em segmentos. Cada perna de mosca contém 14 músculos, cada um dos quais compreende várias fibras musculares^1,2. Os corpos celulares de MNs a perna adultos estão localizados no T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) e T3 (metathoracic) gânglios em cada lado do cabo ventral do nervo (VNC), uma estrutura análoga à medula espinhal vertebrada (Figura 1). Existem aproximadamente 50 MNs em cada gânglio, cujo objectivo músculos em quatro segmentos da perna ipsilateral (coxa, trocanter, fêmur e tíbia) (

Protocolo

1. perna dissecção e fixação

1. Pegue uma placa de vidro multi bem e preenchimento adequado número de poços com etanol a 70%. Adicionar 15 – 20 CO₂-moscas anestesiados (de qualquer sexo e qualquer idade) para cada um bem e usando um pincel, delicadamente dab o voa para a solução de etanol até moscas são totalmente submerso.
   Nota: Este passo é remover a hidrofobicidade da cutícula. Não lave por mais de 1 min, porque isto aumenta a autofluorescência da cutícula.
2. Enxague as moscas 3 vezes com solução de detergente tensoativo não iônico 0,3% em 1x salina tamponada fosfato (PBS). Manter as moscas nesta solução pelo menos 10 min.
   Nota: As p....

Resultados

Como mostrado na Figura 4, este procedimento permite excelente imagem de axônios GFP-etiquetado em adultas pernas de Drosophila , juntamente com seus terminais mandris. Importante um sinal limpo do GFP é obtido sem qualquer contaminação por fluorescência emitida pela cutícula da perna. O sinal da cutícula então pode ser combinado com o sinal GFP para identificar o posicionamento de axônios nas pernas (Video 1, Figura 1e<.......

Discussão

A cutícula de Drosophila adulto e de outros artrópodes, que contém muitos pigmentos escuros, é um grande obstáculo para a visualização de estruturas dentro do seu corpo. Além disso, é fortemente fluorescente auto que é agravada pela fixação. Estas duas características são muito problemáticas para observações de corantes fluorescentes ou moléculas dentro do corpo dos animais com um exoesqueleto.

O procedimento que descrevemos e que usamos rotineiramente no laboratório produz imagens limpas e de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Etanol absoluto	Fisher	E/6550DF/17	Detergente
surfactante não iônico	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, para biologia molecular
Pinça fina	Sigma-Aldrich	F6521	Pinça de joalheiro, Dumont No. 5
Placa de vidro multipoços	Microscopia Eletrônica Ciências	71563-01	Pirex de 9 cavidades, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldeído (w/v),
Glicerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glicerol (Biologia Molecular)
Espaçadores	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, quatro poços, cerca de 12 μ L volume de trabalho por poço, 7 mm de diâmetro, 0,18 mm de profundidade
Quadrado 22 mm x 22 mm de lamínulas	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0,16 a 0,19 mm de espessura
Meio de Montagem	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Meio de Montagem Microscópio
confocal	Carl Zeiss		LSM780; objetiva utilizada LD LCI Plan-Apochromat 25X/0,8 Imm Korr DIC M27 (óleo/ silício/glicerol/água ) (420852-9871-000)
software de imagem	Carl Zeiss		ZEN 2011
Software de imagem 3D	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI

de grau reagente analítico absoluto sem metanol