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Artigo de método

Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos

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DOI:

10.3791/58366

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27 de setembro de 2018

 ,  , 
1Institute of Biotechnology and Biomedicine (IBB-UAB), Universitat Autònoma de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Animal Physiology and Immunology, Universitat Autònoma de Barcelona

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve intubação zebrafish adulto com um biológico; em seguida, dissecando e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e qPCR. Este método permite a administração de compostos bioativos para monitorar a absorção intestinal e o estímulo imune local evocado. É relevante para a dinâmica intestinal da profilaxia oral de teste.

Resumo

A maioria dos patógenos invadem organismos por meio de sua mucosa. Isto é particularmente verdadeiro em peixe como eles estão continuamente expostos a um ambiente de água rica em microbiana. Desenvolver métodos eficazes para entrega oral de Imunoestimuladores ou vacinas, que ativam o sistema imunológico contra doenças infecciosas, é altamente desejável. Na concepção de ferramentas profiláticas, bons modelos experimentais são necessários para testar seu desempenho. Aqui, nós mostramos um método para intubação oral de zebrafish adulto e um conjunto de procedimentos para dissecar e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e análise (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativa. Com este protocolo, estamos precisamente pode administrar volumes até 50 µ l de pescar pesando cerca de 1 g simplesmente e rapidamente, sem prejudicar os animais. Este método nos permite explorar a absorção direta na vivo de compostos fluorescente rotulados pela mucosa intestinal e a capacidade de imunomoduladores de tais produtos biológicos no local após a intubação. Combinando métodos a jusante como citometria de fluxo, histologia, qPCR e microscopia confocal do tecido intestinal, podemos entender como Imunoestimuladores ou vacinas são capazes de atravessar as barreiras da mucosa intestinais, passar a lâmina própria, e atingir o músculo, exercendo um efeito sobre o sistema imunológico da mucosa intestinal. O modelo pode ser usado para testar a profilaxia oral candidato e sistemas de entrega ou o efeito local de qualquer composto Bioativo administrado por via oral.

Introdução

O objetivo deste artigo é descrever em profundidade um método simples para intubação oral de zebrafish, juntamente com procedimentos de jusante associados útil. Intubação oral usando zebrafish tornou-se um modelo prático no estudo da dinâmica de doenças infecciosas, vacina oral/imuno-estimulantes, drogas/nanopartículas absorção e eficácia e imunidade da mucosa intestinal. Por exemplo, zebrafish intubação oral tem sido usada no estudo de Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum infecção1. Lovmo et al . também utilizado com sucesso este modelo para entregar o trato gastro-intestinal de adultos do zebrafish2-nanopartículas e M. marinum . Além disso, Chen et al costumava intubação oral zebrafish para mostrar que drogas encapsuladas por nanopartículas, quando administrada através do trato gastro-intestinal, foram transportados através do sangue cérebro barreira3. Estes autores realizaram intubação baseada no método descrito por Collymore et al gauvage 4 , com algumas modificações. No entanto, eles não forneceu um protocolo altamente detalhado, descrevendo o procedimento de intubação oral. Aqui, apresentamos um método para intubação oral de adultos do zebrafish baseando Collymore et al 4 outras incluem a preparação do intestino para análise pertinente a jusante por citometria, microscopia confocal e qPCR.

O intestino e particularmente sua mucosa é a primeira linha de defesa contra a infecção e o local principal de absorção de nutrientes5. Quando as células epiteliais e células apresentadoras de antígeno dentro da mucosa barreiras percebem sinais de perigo, uma imediata resposta imune inata é acionada. Em seguida, a resposta imune adaptativa altamente específica é estabelecida por de6,de linfócitos T e B7. Desenvolvimento de vacinas orais é uma área de foco atual em Vacinologia. Essas vacinas seria uma ferramenta eficaz para proteger o organismo em locais expostos devido à resposta específica de células do sistema imunológico em tecidos linfoides associados a mucosa (MALT)8,9. Na aquicultura, vacinas da mucosa tem vantagens óbvias em comparação com as vacinas injetáveis. Eles são práticos para vacinação em massa, menos trabalhosa, são menos estressantes para os peixes e podem ser administrados para peixes jovens. No entanto, candidatos vacinais da mucosa devem chegar o segundo segmento de intestino sem ser desnaturada no meio oral. Eles também devem transpor as barreiras da mucosa para obter acesso a apresentadoras de antígenos (APCs) para induzir respostas locais e/ou sistêmica10de células. Portanto, testes de captação da mucosa alcançada pelo candidato oral antígenos e seus sistemas de entrega, bem como a resposta imune evocada, é essencial no desenvolvimento de vacinas orais.

Em um contexto biomédico, desenvolvendo um modelo para testar os efeitos biológicos de compostos após intubação oral é de interesse crescente. Muitas das características anatômicas e fisiológicas do intestino são conservadas entre linhagens é formado por, com mamíferos e peixes ósseos11. Este modelo de entubação oral ligado à análise a jusante pode ser uma ferramenta para fornecer insights sobre a biologia humana, bem como um campo de testes para produtos biológicos ou outros compostos na vivo.

O protocolo de intubação oral pode ser realizado por um operador, por exemplo, administrar com sucesso até 50 µ l de suspensão de nanopartículas de proteína para peixes pesando 1 g, com uma taxa de sobrevivência de alta. O procedimento é simples de configurar e rápido; 30 peixes podem ser intubados em 1h. O protocolo para a preparação do intestino é a chave para fornecer amostras de células e tecidos de qualidade para posterior análise. Exemplos de resultados a jusante são dados que mostram a utilidade do protocolo na obtenção de dados relacionados à absorção intestinal e no isolamento do RNA de qualidade para qPCR. O protocolo seria de grande utilidade para aqueles que necessitam de um modelo adequado para testar a dinâmica da profilaxia oral ou outros compostos no intestino.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo peixe-zebra (Danio rerio) foram autorizados pelo Comitê de ética da Universitat Autònoma de Barcelona (número CEEH 1582) de acordo com os princípios orientadores do Internacional para pesquisa envolvendo animais ( EU 2010/63). Todos os experimentos com zebrafish ao vivo foram realizados em 26 e 28 ° C.

1. preparar o equipamento para intubação Oral

  1. Coloque aproximadamente 1 cm de um tubo de silicone fino sobre uma agulha de bloqueio de Luer de 31 mil para cobrir a ponta da agulha.
  2. Corte uma pipeta de filtro estéril 10 µ l de ponta (cerca de 2 cm), pegue a ponta mais fina e coloque-o sobre o tubo de silicone como uma bainha. Certifique-se que a pipeta se estende para além da ponta da agulha para evitar ferir o animal.
  3. Conecte a agulha de uma seringa de fecho Luer µ l 100.
    Nota: Lave sempre com etanol, e em seguida tampão fosfato salino (PBS, ver materiais) completamente entre os tratamentos.

2. soluções necessárias

  1. Prepare a 150 mg/L (anestesia) ou 300 mg/L (eutanásia) da solução de Metanossulfonato (MS-222) etil 3-aminobenzoato com água do aquário onde o peixe-zebra são mantidas. Encher um tanque pequeno com 1 L de solução anestésica e mantê-lo arejado.
  2. Preencher outro tanque pequeno com 1 L de água do aquário sem MS-222 para recuperação do peixe e mantê-lo arejado.
  3. Fazer 50 mL de 1X PBS de uma solução estéril de 10x.
  4. Para o isolamento de célula intestinal/análise cytometry, prepare bastante fresco colagenase 0,15% solução tipo IV para 1ml por peixes de uma solução de reserva ou de pó num meio de águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 1% v/v penicilina e estreptomicina (ver materiais). Faça (1 por peixe) de alíquotas de 1 mL em tubos de centrífuga de 2 mL. Manter a 4 ° C até 30 min antes da etapa de dissecação.
  5. Para fixação de microscopia confocal/amostra, preparar 50 mL de solução de paraformaldeído (PFA) fresca de 4% em PBS ou descongelar uma solução stock de congelador-20 ° C em uma coifa.
    Atenção: O PFA é tóxico. Por favor, leia a folha de dados material de segurança antes de trabalhar com ele. Luvas e óculos de segurança devem ser usados e deixar sempre soluções dentro de uma coifa.

3. preparar a suspensão de nanopartículas fluorescentes

  1. Rotular as nanopartículas de proteína com éster Atto-488 NHS (ver Tabela de materiais) ou uma tintura fluorescente apropriada de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Resuspenda as nanopartículas em tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M na concentração de 2 mg/mL.
  3. Dissolva o éster Atto 488 NHS em amina livre dimetilsulfóxido (DMSO) 2 mg/ml. Manter uma alíquota de 10 µ l para verificar a eficiência de rotulagem (etapa 3.7 – 3.8).
  4. Misture as nanopartículas e o éster Atto 488 NHS em uma relação molar de 1:2 (proteína: tintura) por agitação no escuro.
  5. Spin para baixo as nanopartículas rotuladas por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e mantê-lo para verificar a eficiência de rotulagem (etapa 3.7 – 3.8).
  6. Lave as nanopartículas rotuladas por resuspending em 1 mL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M num Vortex e pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, descarte o sobrenadante por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Repita a etapa 3.6 por 5 vezes.
  7. Resuspenda o pellet em 5 mL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M em um tubo de centrífuga de 15 mL e faça alíquotas das nanopartículas fluorescentes em tubos de centrífuga de 1,5 mL (30 alíquotas). Spin para baixo a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente, desprezar o sobrenadante e armazenar a-80 ° C, protegido da luz.
  8. Medir a eficiência de rotulagem usando um spectrophotometer microvolume.
    1. Tomar 1 µ l da solução de Atto 488 original mantida da etapa 3.3 e diluí-lo ainda mais em DMSO (por exemplo, 01:20 de acordo com a relação de volume). Este é o volume usado para obter a relação molar de nanopartículas de proteína e Atto 488 misture no passo 3.4.
    2. Tome 1 µ l do sobrenadante da reação da rotulagem salvo na etapa 3.5. Medir a absorção (abs) no = 501 nm. É a porcentagem de rotulagem:
      (figure-protocol-1
  9. Antes do experimento, prepare a suspensão de nanopartículas na concentração desejada usando 1 x solução de PBS.

4. Zebrafish Anesthetization e intubação Oral

  1. Rápido o peixe (> 0,5 g) pelo menos 48 h antes do experimento para esvaziar o intestino.
  2. Mova o peixe (12 peixe) para os tanques experimentais (6L) uma noite antes do experimento para permitir que a aclimatação12.
  3. Vórtice a solução de nanopartículas bem (por exemplo, 2.500 rpm e 30 s) e elaborar o volume desejado de nanopartículas suspensão (por exemplo, 20 – 50 µ l) para a seringa anexada para a agulha protegida.
  4. Coloque o peixe no aerado 150mg/L MS-222 solução (ver secção 2) até que eles descem para o fundo do tanque e não respondem a uma pitada de barbatana de cauda; Este processo leva menos de 5 min.
  5. Rapidamente o peixe anestesiado com uma rede de transferência para uma bandeja de plástico molhada, orientar o animal horizontalmente para enfrentar a agulha e começar imediatamente a intubação oral.
  6. Cuidadosamente, apoiar o peixe com uma mão e abrir a boca com a outra mão usando a agulha protegida. Insira cuidadosamente a agulha até ao esófago para cerca de 1 cm da boca abrindo.
    Nota: O operador pode sentir uma ligeira resistência ao final da ponta da pipeta passou o gill. Tome cuidado para não o ângulo da entrada de agulha demais que possam perfurar o gill.
  7. Injete lentamente a suspensão de nanopartículas para os peixes. Certifique-se que a suspensão não flui para fora através de brânquias ou da boca.
  8. Delicadamente, retire a agulha e coloque o peixe no tanque de recuperação (ver secção 2). Recuperação leva geralmente dentro de 1 min.
  9. Verifique o peixe cuidadosamente para qualquer anormalidade (por exemplo, sangramento em brânquias é um sinal de perfuração).
  10. Uma vez que os peixes se recuperaram, devolvê-los para os tanques experimentais.

5. Zebrafish intestino dissecação

  1. Após um período especificado de tempo pós intubação (por exemplo, 5 h e/ou 24 h), coloque o peixe usando uma rede em 300 mg/L de MS-222 solução para eutanásia (ver secção 2). Certifique-se o opérculo para de se mover e não há nenhum reflexo de pitada de cauda. Cinco minutos é normalmente suficiente.
  2. Pegar o animal euthanized com uma rede e colocá-lo em um papel de filtro.
    Nota: O papel de filtro é muito útil para remover o tecido adesivo ao longo do intestino.
  3. Usando uma tesoura afiada dissecação, fazer uma incisão semicircular do ânus para o opérculo e incisão aberta, usando uma pinça fina. Corte as duas extremidades do intestino, tirar todos os órgãos internos e coloque-os sobre o papel de filtro.
    Cuidado: Trabalho rapidamente para reduzir a morte e o metabolismo celular.
    Nota: Como alternativa, remova o tecido adesivo em PBS e no gelo.
  4. Separe o intestino dos órgãos internos, certificando-se de manter sua orientação (anterior posterior segmento intestinal) e esticá-la. Geralmente, o segmento anterior do intestino é mais largo do que o segmento posterior. Tome cuidado para obter todos do intestino quando dissecando.
    Nota: A extremidade posterior é muito fina e frágil em peixes pequenos e podem romper, particularmente em animais < 0,7 g.
  5. Role o intestino no filtro de papel com uma pinça para desanexar o tecido adesivo no intestino.
  6. Proceda para preparar o intestino para várias análises a jusante (seções 6, 7 e 8).

6. preparar células intestinais por citometria

  1. Prepare com antecedência alíquotas da solução de colagenase de 0,15% (ver secção 2.4).
    Nota: Alíquotas devem estar à temperatura ambiente antes de prosseguir.
  2. Opcional: Continuação da etapa 5.5, cortar aberto o intestino longitudinalmente e lave com PBS 1x.
  3. Usando uma pinça, coloca o intestino no tubo de centrífuga de 2ml, preenchido com solução de colagenase de 0,15%.
  4. Coloque os tubos em rotacao laboratório vertical por 1h à temperatura ambiente no escuro.
  5. Coloque o intestino em um coador de célula de 100 µm apoiado sobre um tubo de centrífuga de 50 mL. Romper o intestino com um êmbolo da seringa de 5 mL, lavar 3 vezes com PBS 1x, coletando o fluxo através da amostra no tubo de centrífuga de 50 mL.
  6. Centrifugar o tubo de centrífuga de 50 mL a 400 x g durante 10 minutos, a 4 ° C.
  7. Pipete cuidadosamente durante a maior parte do líquido sobrenadante enquanto não perder as células, alguns dos quais podem ser associados com o muco.
  8. Ressuspender as células intestinais na parte inferior do tubo de centrífuga com 500 µ l de PBS 1x e manter no gelo até análise cytometry
  9. Amostras de filtro através de um filtro de célula 30 µm em 5 mL redonda tubos para citometria.
  10. Definir os parâmetros (por exemplo, o número de células para análise, a região de interesse, a tensão e a compensação, seleção de detectores) em um equipamento de citômetro (ver materiais).
  11. Imediatamente analise as células em um citômetro, seguindo as instruções de uso13.

7. preparação de Cryosections intestino para microscopia Confocal

  1. Encher o molde de plástico (ver Tabela de materiais) para metade do volume com a temperatura de corte ideal (O.C.T.) composta.
  2. Continuando da etapa 5.5 e imediatamente após a dissecação, coloque cuidadosamente o intestino no molde plástico. Certifique-se que o intestino é totalmente incorporado no composto O.C.T.. Se necessário, adicione mais O.C.T. composto para o molde plástico.
    Nota: É recomendável colocar o intestino com uma forma de "Z" no O.C.T. compostos facilmente seguir sua orientação natural.
  3. Coloque o molde de plástico em gelo seco até ficar opaco (menos de um minuto).
  4. Armazene o molde plástico a-80 ° C para uso a longo prazo ou processo imediatamente usando o procedimento a seguir.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
  5. Fatie o intestino congelado em 10 seções µm ou espessura apropriada usando um criostato a-20 ° C.
  6. Recolha a seção de intestino com um pincel fino para um slide.
  7. Mergulhe o slide em 4% PFA durante 15 minutos à temperatura ambiente para fixar a amostra.
    Atenção: O PFA é tóxico. Por favor, leia a folha de dados material de segurança antes de trabalhar com ele. Luvas e óculos de segurança devem ser usados e deixar sempre soluções dentro de uma coifa.
  8. Lave o slide 3 vezes com 1X PBS, 10 min cada.
  9. Adicionar uma gota de meio de montagem e coloque uma lamela sobre o espécime.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
  10. Observe a amostra sob um microscópio confocal na ampliação adequada.

8. preparar o intestino para qPCR em tempo Real (RT-qPCR)

  1. Continuando da etapa 5.5, colocar o intestino em um frasco criogênico e congelar rapidamente o intestino em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C até o uso.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
  2. Para homogeneização, adicionar solução de 1-Thioglycerol/homogeneização 200 µ l de 2% (v/v) refrigerados (ver Tabela de materiais) ou solução alternativa de homogeneização para a amostra de intestino.
  3. Trabalhar rapidamente, homogeneizar a amostra de intestino no gelo com um homogeneizador de laboratório em alta velocidade (fixado em 25-30.000 rpm) até nenhum tecido visível fragmentos permanecem. 3 vezes por 5 s é geralmente suficiente.
  4. Isolar o RNA usando um comercial kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com instruções14 as indicações do fabricante ou um método alternativo adequado. Conforme necessário, armazene o RNA a-80 ° C para uso a longo prazo.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
  5. Quantificar a concentração de RNA usando um espectrofotômetro15 e avaliar a qualidade usando um analisador de RNA16.
  6. Prepare-se 1 µ g ou uma quantidade adequada de cDNA usando um kit de síntese do cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Para análise de qPCR, por favor, siga as orientações MIQE17.
  7. Desenha pares de primer adequado para o gene/s de interesse.
  8. Selecione um gene de referência adequada e analisar a expressão de cada gene por uma detecção de RT-qPCR kit de sistema usando um comercial (ver materiais).
    Nota: por exemplo, adicione 5 µ l de supermix SYBR green, as primeiras demão de 0,5 µM, 2,5 µ l de cDNA diluído e 1,5 µ l de água em um volume final de 10 µ l de cada poço da placa de qPCR.

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Resultados

Zebrafish (peso médio: 1.03 ± 0,16 g) de sexo misturado com êxito foram intubados com nanopartículas de diferentes proteínas recombinantes (corpos de inclusão bacterianas) usando nosso dispositivo de intubação oral caseiro (Figura 1). Nós temos com sucesso realizada a intubação oral e alcançado uma percentagem média baixa mortalidade (6,8%) (Tabela 1). Zebrafish foram também intubado com 30 µ l ou 50 µ l de suspensões de nanopartículas e a mo...

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Discussão

Este protocolo é um aperfeiçoamento da técnica descrita anteriormente para intubação oral por Collymore et al 4 nosso protocolo descreve em detalhes o método de intubação oral e inclui a preparação do intestino para análises a jusante. Nosso método melhora a velocidade de manipulação de peixes permitindo que uma pessoa para executar o protocolo rapidamente, sem muita variação entre os operadores. A principal diferença do nosso protocolo com a anterior é que avaliamos o sucesso de um exper...

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Divulgações

Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência, espanhol AGAUR fundos para NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Comissão Europeia. RT detém uma bolsa doutorandos de AGAUR (Espanha), JJ foi apoiada por uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China (China) e NR é suportado pelo programa de Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Agradecemos o Dr. Torrealba por consultoria especializada na produção de proteína, s. Botelho da "Servei de Microscopia" e Dr. M. Costa desde o "Servei de Citometria" da Universitat Autònoma de Barcelona, para assistência técnica útil.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de siliconeDow Corning508-0010,30 mm de diâmetro interno e 0,64 mm de diâmetro externo
Agulha Luer lockHamilton7750-2231 G, Kel-F Hub
Luer lock seringaHamilton81020/01100 μ L, Ponta
de pipeta filtradaNerbe Plus07-613-830010 μ L
MS-222Sigma AldrichE10521pó
10x PBSSigma AldrichP5493
Papel de filtro Filter-LabRM14034252
CollagenaseGibco17104019
DMEM Gibco31966Dulbecco's modified eagle medium
Penicilina e estreptomicinaGibco15240
Cell strainerFalcon352360
CellTrics filters Sysmex Partec04-004-2326 (Wolflabs)30 µ m filtros de malha com reservatório de 2 mL
Composto Tissue-Tek O.C.T. SAKURA4583
Moldes de plástico para criossecçõesSAKURA4557Moldes de vinil descartáveis. 25 mm x 20 mm x 5 mm
SlideThermo Scientific10149870SuperFrost Plus
slide Cover óculosLabbox COVN-024-20024&agudo; 24 mm
Paraformaldeído (PFA)Sigma-Aldrich158127
Atto-488 NHS ésterSigma-Aldrich41698
Bicarbonato de sódioSigma-AldrichS5761
DMSOSigma-AldrichD8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue KitPromegaAS1340
1-Tioglicerol / Homogeneização soluçãoPromegaDentro do Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kitadicionando 20 μ l 1-Tioglicerol para 1 mL de solução de homogeneização (2%)
rotador vertical de laboratório Suministros Grupo Esper10000-01062
CryostatLeica 
HomogeneizadorKINEMATICAPolytron PT1600E
Citômetro de fluxo Becton DickinsonFACS Canto
5 mL tubo de fundo redondoFalcon352058
Microscópio ConfocalLeicaSP5
Capuz de FumaçaKottermann2-447 BST
Nanodrop 1000Thermo Fisher ScientificND-1000Espectrofotômetro
Agilent 2100 Sistema Bioanalisador AgilentG2939Abioanalisador de RNA
Maxwell InstrumentPromegaAS4500 
Kit de síntese de cDNA iScript Bio-rad1708891
CFX384 PCR em Tempo Real  Sistemade Detecção Bio-Rad1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kitBio-rad172-5120
Água Sigma-AldrichW4502
Frasco criogênico Frasco Thermo Fisher Scientific375418CryoTube
Meio de montagemSigma-AldrichF6057Fluoroshield com DAPI
Kel-F Hub CM3050S

Referências

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