O protocolo descreve intubação zebrafish adulto com um biológico; em seguida, dissecando e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e qPCR. Este método permite a administração de compostos bioativos para monitorar a absorção intestinal e o estímulo imune local evocado. É relevante para a dinâmica intestinal da profilaxia oral de teste.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A maioria dos patógenos invadem organismos por meio de sua mucosa. Isto é particularmente verdadeiro em peixe como eles estão continuamente expostos a um ambiente de água rica em microbiana. Desenvolver métodos eficazes para entrega oral de Imunoestimuladores ou vacinas, que ativam o sistema imunológico contra doenças infecciosas, é altamente desejável. Na concepção de ferramentas profiláticas, bons modelos experimentais são necessários para testar seu desempenho. Aqui, nós mostramos um método para intubação oral de zebrafish adulto e um conjunto de procedimentos para dissecar e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e análise (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativa. Com este protocolo, estamos precisamente pode administrar volumes até 50 µ l de pescar pesando cerca de 1 g simplesmente e rapidamente, sem prejudicar os animais. Este método nos permite explorar a absorção direta na vivo de compostos fluorescente rotulados pela mucosa intestinal e a capacidade de imunomoduladores de tais produtos biológicos no local após a intubação. Combinando métodos a jusante como citometria de fluxo, histologia, qPCR e microscopia confocal do tecido intestinal, podemos entender como Imunoestimuladores ou vacinas são capazes de atravessar as barreiras da mucosa intestinais, passar a lâmina própria, e atingir o músculo, exercendo um efeito sobre o sistema imunológico da mucosa intestinal. O modelo pode ser usado para testar a profilaxia oral candidato e sistemas de entrega ou o efeito local de qualquer composto Bioativo administrado por via oral.
Introdução
O objetivo deste artigo é descrever em profundidade um método simples para intubação oral de zebrafish, juntamente com procedimentos de jusante associados útil. Intubação oral usando zebrafish tornou-se um modelo prático no estudo da dinâmica de doenças infecciosas, vacina oral/imuno-estimulantes, drogas/nanopartículas absorção e eficácia e imunidade da mucosa intestinal. Por exemplo, zebrafish intubação oral tem sido usada no estudo de Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum infecção1. Lovmo et al . também utilizado com sucesso este modelo para entregar o trato gastro-intestinal de adultos do zebrafish
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos experimentais envolvendo peixe-zebra (Danio rerio) foram autorizados pelo Comitê de ética da Universitat Autònoma de Barcelona (número CEEH 1582) de acordo com os princípios orientadores do Internacional para pesquisa envolvendo animais ( EU 2010/63). Todos os experimentos com zebrafish ao vivo foram realizados em 26 e 28 ° C.
1. preparar o equipamento para intubação Oral
- Coloque aproximadamente 1 cm de um tubo de silicone fino sobre uma agulha de bloqueio de Luer de 31 mil para cobrir a ponta da agulha.
- Corte uma pipeta de filtro estéril 10 µ l de ponta (cerca de 2 cm), pegue a ponta mais....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Zebrafish (peso médio: 1.03 ± 0,16 g) de sexo misturado com êxito foram intubados com nanopartículas de diferentes proteínas recombinantes (corpos de inclusão bacterianas) usando nosso dispositivo de intubação oral caseiro (Figura 1). Nós temos com sucesso realizada a intubação oral e alcançado uma percentagem média baixa mortalidade (6,8%) (Tabela 1). Zebrafish foram também intubado com 30 µ l ou 50 µ l de suspensões de nanopartículas e a mo.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo é um aperfeiçoamento da técnica descrita anteriormente para intubação oral por Collymore et al 4 nosso protocolo descreve em detalhes o método de intubação oral e inclui a preparação do intestino para análises a jusante. Nosso método melhora a velocidade de manipulação de peixes permitindo que uma pessoa para executar o protocolo rapidamente, sem muita variação entre os operadores. A principal diferença do nosso protocolo com a anterior é que avaliamos o sucesso de um exper.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência, espanhol AGAUR fundos para NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Comissão Europeia. RT detém uma bolsa doutorandos de AGAUR (Espanha), JJ foi apoiada por uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China (China) e NR é suportado pelo programa de Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Agradecemos o Dr. Torrealba por consultoria especializada na produção de proteína, s. Botelho da "Servei de Microscopia" e Dr. M. Costa desde o "Servei de Citometria" da Universitat Autònoma de Barcelona, para assistência técnica útil.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de silicone | Dow Corning | 508-001 | 0,30 mm de diâmetro interno e 0,64 mm de diâmetro externo |
| Agulha Luer lock | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock seringa | Hamilton | 81020/01 | 100 μ L, Ponta |
| de pipeta filtrada | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μ L |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | pó |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Papel de filtro | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicilina e estreptomicina | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µ m filtros de malha com reservatório de 2 mL |
| Composto Tissue-Tek O.C.T. SAKURA | 4583 | ||
| Moldes de plástico para criossecções | SAKURA | 4557 | Moldes de vinil descartáveis. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus |
| slide Cover óculos | Labbox | COVN-024-200 | 24&agudo; 24 mm |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS éster | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Tioglicerol / Homogeneização solução | Promega | Dentro do Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adicionando 20 μ l 1-Tioglicerol para 1 mL de solução de homogeneização (2%) |
| rotador vertical de laboratório | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Homogeneizador | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Citômetro de fluxo | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL tubo de fundo redondo | Falcon | 352058 | |
| Microscópio Confocal | Leica | SP5 | |
| Capuz de Fumaça | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Espectrofotômetro |
| Agilent 2100 Sistema Bioanalisador Agilent | G2939A | bioanalisador de RNA | |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| Kit de síntese de cDNA iScript | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 PCR em Tempo Real Sistema | de Detecção Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Água | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Frasco criogênico | Frasco Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube |
| Meio de montagem | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield com DAPI |
Referências
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
