Aqui, apresentamos um protocolo para detectar a presença de neutrófilos em seções fixas/permeabilizado histologia e avaliar o estado de ativação de neutrófilos purificados ao vivo. Em particular, o peptídeo de40 MUB vincula lactoferrina presente nos grânulos neutrófilos específicos e terciários. Exposição do conteúdo do grânulo através de permeabilização ou ativação de neutrófilos permite a marcação de neutrófilos.
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Artigo de método
O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aqui, nós fornecemos um protocolo que envolve a utilização de MUB40, um peptídeo sintetizado com a capacidade de se ligar a lactoferrina glicosilados armazenada em concentrações elevadas em grânulos específicos e terciários de neutrófilos. Este detalhes de protocolo como MUB40 conjugado diretamente com um fluoróforo pode ser usado para manchar os neutrófilos nos tecidos fixo/permeabilizado, bem como a forma como isso pode ser usado em imagens de viver-pilha a ensaiar para a granulação e ativação de neutrófilos. Métodos de deteção dos neutrófilos são limitados a espécie anticorpos monoclonais, que nem sempre são adequados para determinadas aplicações. MUB40 não penetra a membrana celular e, portanto, é excluído da lactoferrina armazenada em neutrófilos não-ativado/não-permeabilizado. MUB40 tem o benefício adicionado de reconhecer lactoferrina de um leque amplo acolhimento, tornando-se especialmente útil para comparar resultados em estudos envolvendo vários modelos de pesquisa, reduzindo o número de reagentes duplicados e simplificando os protocolos através de coloração de etapa única.
Introdução
Os neutrófilos são um dos principais braços do sistema imune inato e rotineiramente são recrutados para os locais de inflamação ao redor do corpo. O estudo de neutrófilos foi em grande parte prejudicado por sua vida curta em vitro (menos de 8 h) e ferramentas de detecção limitada em condições basais ou após a ativação. Aqui, apresentamos um protocolo bem testado para a detecção de amplo e específico de neutrófilos mamíferos em amostras fixas/permeabilizado. Nós também fornecemos um protocolo detalhado para coloração de neutrófilos ao vivo com MUB40. Usando o protocolo de coloração dos neutrófilos ao vivo, o calendário e a localização da ativação de....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram revistos e aprovados pelas organizações francesas modificaes (Comité de Recherche Clinique), CPP (des Personnes de Comité de proteção) e CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).
1. neutrófilos no tecido histopatologia com a coloração fluorescente rotulados MUB40
- Para obter o tecido para histopatologia, corrigi secções de tecido/biopsia em um volume adequado de paraformaldeído 4% (PFA) por 30 min até 4 h dependendo da espessura da amostra. Coloca as amostras em um frigorífico de 4 ° C durante a fixação.
Nota: Fixação alternativos métodos/horários pode ser substituídos ....
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Resultados
Resultados de MUB40-tecidos manchados de slides histopatologia tipicamente revelam células individuais espalhadas por todo o tecido. MUB40 manchas de lactoferrina, que está presente nos grânulos neutrófilos e compartimentada. Assim, tipicamente vistos são punctate manchas ou vários grandes áreas separadas do sinal vindo de neutrófilos individuais (Figura 1). É útil adicionar um segundo marcador de célula como DAPI para ajudar a localizar.......
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Discussão
Aqui, dois ensaios são descritos em que o peptídeo de40 MUB é usado para estudar a ativação e inflamação dos neutrófilos. Mostramos como MUB40 pode revelar os neutrófilos presentes nas seções de histopatologia ou mostram seu estado de ativação usando neutrófilos purificados ao vivo. As etapas críticas para usar MUB40 como um reagente de coloração são os mesmos que com qualquer outro método de deteção fluorescente. Deve ter cuidado para garantir a compatibilidade de sinais fluorescentes e .......
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Divulgações
B.S.M. é listado como um inventor na MUB40 patentes:
MUB40: EP11290403.2 de patente europeia, 09/09/2011.
RI-MUB40: EP patente europeia n. º 17306746.3, 12/11/17.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fondation Laurette Fugain (se-2015-15) (B.S.M.) e ANR JCJC concede (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Peptídeo fluorescente MUB40 (disponível com outros fluoróforos conjugados) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Peptídeo MUB40 fluorescente retro-inverso. Sintetizado com D-aminoácidos e resistente a proteases (disponível com outros fluoróforos conjugados) |
| Parformaldeído | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixador para histologia |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solução usada para remover o excesso de PFA |
| Composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Usado para congelar tecido antes do seccionamento do criostato |
| 2-Metilbutano | Sigma-Aldrich | M32631 | Usado para congelar tecidos antes do seccionamento do criostato |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Usado para banho de gelo seco para congelar tecidos |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Usado para seccionar tecidos |
| Lâminas de microscopia de vidro | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Lamínulas | Thor Labs | CG15CH | Caneta de alta precisão |
| Dako | Sigma-Aldrich | Z377821 | Usado para prevenir a perda de líquido durante a coloração de tecidos |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | Usado para permeabilizar células para coloração IF |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Colore DNA |
| Alexa fluor 488 Faloidina | Fisher Scientific | A12379 | Liga-se à actina |
| Prolongar o antifade de ouro Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolonga o sinal IF e a resistência ao fotobranqueamento |
| Microscópio fluorescente | Vários | Vários | Usado para obter imagens de lâminas IF |
| Gabinete Anóxico | Vários | Vários | Usado para a purificação de neutrófilos vivos inativados |
| Cloreto de sódio NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Componente de tampão de lavagem |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Componente de tampão de lavagem |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradiente para purificação de neutrófilos |
| CD235a glicoforina microesferas magnéticas | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Usado para remover hemácias contaminantes |
| Colunas LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Usado na remoção de hemácias de neutrófilos |
| RPMI-1640 sem Vermelho de Fenol | Sigma-Aldrich | R8755 | Usado para ensaios de neutrófilos |
Referências
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B....
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Reimpressões e permissões
