Artigo de método

Indução de diferenciação endotelial em células progenitoras cardíacas sob condições de baixo de soro

DOI:

10.3791/58370

⸱

7 de janeiro de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital and University of Basel, 2Division of Cardiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma técnica de diferenciação endotelial para células progenitoras cardíacas. Centra-se sobretudo em como concentração sérica e densidade de semeadura de célula afetam o potencial de diferenciação endotelial.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Células progenitoras cardíacas (CPCs) podem ter um potencial terapêutico para regeneração cardíaca após lesão. No coração dos mamíferos adulto, CPCs intrínsecos são extremamente escassos, mas CPCs expandidas podem ser útil para terapia celular. Um pré-requisito para a sua utilização é a sua capacidade de se diferenciar de uma forma controlada nas várias linhagens cardíacas usando protocolos definidos e eficientes. Além disso, a expansão em vitro , CPCs isolaram de pacientes ou modelos pré-clínicos doença podem oferecer ferramentas de pesquisa proveitosa para a investigação dos mecanismos da doença.

Estudos atuais usam marcadores diferentes para identificar CPCs. No entanto, nem todos eles são expressos em seres humanos, que limita o impacto translacional de alguns estudos pré-clínicos. Protocolos de diferenciação que são aplicáveis independentemente da expressão técnica e marcador de isolamento permitirá a expansão padronizada e escorva do CPCs para efeito de terapia celular. Aqui descrevemos que escorva CPCs sob uma concentração baixa de soro fetal bovino (FBS) e as condições de densidade celular baixa facilita a diferenciação endotelial dos CPCs. usando dois diferentes subpopulações de rato e rato CPCs, mostramos que a laminina é uma mais substrato adequado que fibronectina para este fim, sob o seguinte protocolo: depois para 2-3 dias em média, incluindo os suplementos que manter multipotency de cultivo e com 3,5% FBS, CPCs são semeados na laminina em < 60% confluência e cultivadas em meio livre de suplemento com baixas concentrações de FBS (0,1%) por 20-24 horas antes de diferenciação num meio de diferenciação endotelial. Porque CPCs são uma população heterogénea, concentrações séricas e tempos de incubação podem precisar ser ajustada dependendo das propriedades da respectiva subpopulação de CPC. Considerando isso, a técnica pode ser aplicada a outros tipos de CPCs também e fornece um método útil para investigar o potencial e os mecanismos de diferenciação e como eles são afetados pela doença quando usando CPCs isoladas de modelos respectivos de doença.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estudos recentes suportam a existência de células progenitoras cardíacas residente (CPCs) no coração dos mamíferos adultos1,2,3, e CPCs poderiam ser uma fonte útil para terapia celular após lesão cardíaca4, 5. Além disso, CPCs expandidas podem fornecer um modelo frutífero para rastreio de drogas e a investigação dos mecanismos da doença quando isoladas de pacientes com miocardiopatias raras ou de doença respectiva modelos6,7.

PCC isolado do coração adulto possuem tronco/progenitoras célula características1,2,3,8 como eles são multipotentes, clonogenic, e têm a capacidade de auto-renovação. No entanto, há muitos diferentes (sub) populações CPCs exibindo perfis de marcador de superfície diferentes, incluindo, por exemplo, c-kit, Sca-1 e outros, ou obtida por técnicas de isolamento diferentes (tabela 1). Vários protocolos de cultura e diferenciação foram estabelecidas1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estes protocolos variam principalmente no que diz respeito a fator de crescimento e teor de soro, que são ajustadas de acordo com a finalidade do cultivo e que pode levar a diferenças nos resultados e as consequências, incluindo a eficiência de diferenciação.

Técnicas de isolamento baseados no marcador:

PCC pode ser isolados com base em um marcador de superfície específicos expressão1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudos anteriores sugerem que a c-kit e Sca-1 podem ser os melhores marcadores para isolar residente CPCs1,11,14,19,20. Porque nenhum desses marcadores é verdadeiramente específico para CPCs, combinações de diferentes marcadores são geralmente aplicadas. Por exemplo, Considerando que CPCs expressam baixos níveis de c-kit21, c-kit é expressa também por outros tipos de células, incluindo mastócitos22, células endoteliais23e de células tronco/progenitoras hematopoiéticas24. Um problema adicional é o fato de que nem todos os marcadores são expressos através de todas as espécies. Este é o caso da Sca-1, que se expressa no rato mas não no humano25. Portanto, usar os protocolos que são independentes dos marcadores de isolamento pode ser vantajoso, tendo em conta os ensaios clínicos e estudos usando amostras humanas.

Técnicas de isolamento de marcador independente:

Existem várias técnicas principais de isolamento do CPC, que são principalmente independentes da expressão do marcador de superfície, mas que pode ser refinado pela seleção consecutiva do específicos marcador positivo subfractions conforme necessário (Veja também a tabela 1). (1) a técnica de população (SP) lado originalmente tem sido caracterizada em uma população primitiva de células-tronco hematopoiéticas baseado na capacidade de efluxo o corante de ADN Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP foram isoladas por diferentes grupos e relatadas para expressar uma variedade de marcadores com algumas pequenas diferenças entre relatórios2,8,13,14. (2) células de fibroblastos de unidade formadoras de Colônia (CFU-Fs) originalmente foram definidas com base em uma célula do estroma mesenquimal (MSC)-como fenótipo. MSCs isoladas são cultivadas em pratos para induzir a formação de colônia. Tais formadoras MSC-como CFU-Fs podem ser isolado do coração adulto e são capazes de se diferenciarem em linhagens cardíaca15. (3) Cardiosphere-derivado de células (CDC) são células únicas, derivadas de aglomerados de células cultivadas a partir de biópsias do tecido ou explants28,29,30,31. Recentemente foi demonstrado que, na maior parte o CD105+/CD90–/c-kit– fração de célula exibe cardiomyogenic e potencial regenerativo32.

Aqui, usando SP-CPCs isolados de ratos, nós fornecemos um protocolo para a indução eficiente da linhagem endotelial com base em um estudo anterior em CPCs de rato e rato SP-CPCs33. O protocolo contém adaptações específicas à cultura e técnica de expansão em relação a densidade celular, o soro que integram o meio e o substrato. Isso pode ser aplicado não só ao rato SP-CPCs mas para diferentes tipos de CPCs para o propósito para induzir um interruptor de destino de uma amplificação para um CPC endotelial-cometeu, seja tendo em conta o transplante dessas células ou sua utilização para estudos mecanicistas em vitro .

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso de ratos para efeito de isolamento de célula estava de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e com a lei Suíça de proteção Animal e foi aprovado pelas autoridades cantonais suíços.

Nota: O isolamento da Sca-1+/CD31– SP-CPCs do coração de rato foi essencialmente feito como descrito anteriormente34 com algumas modificações. Para os materiais e reagentes usados, consulte Tabela de materiais. Para todos os experimentos, SP-CPCs cardíacas isoladas de ratos foram amplificados, passadas e usados em uma maneira semelhante ao linha de celular. Passagens 7-20 foram utilizadas para este estudo.

1. tecido preparação

Nota: Todos os experimentos utilizando ratos devem ser efectuados de acordo com as diretrizes e regulamentos. Este protocolo usa quatro ratos. Placas de cultura que são de 100 mm de diâmetro são descritas como P100 e placas de cultura que são 60 mm de diâmetro são descritas como P60 para as seguintes partes do protocolo.

  1. Injetar cada rato com 200 mg/kg de pentobarbital intraperitonealmente (i.p.) e espere até que ele é totalmente anestesiado, verificando a sua resposta para toe beliscar.
  2. Limpe o peito com etanol a 70%. Corte a pele e a parede torácica com uma tesoura para expor a cavidade torácica.
  3. Levantar o coração com fórceps e cortá-la na base com uma tesoura. Colocar o coração em um P100 com 25 mL (5 mL para P60) de frio fosfato salino (PBS) (três a cinco corações por P100) ou um ou dois corações por P60.
  4. Bombear o coração com fórceps para ejetar o sangue para fora das cavidades (figura 1A).
  5. Colocar o coração em um P100 com 25 mL (5 mL para P60) de frio PBS para lavar. Remova os átrios com uma tesoura pequena. Corte o coração em dois pedaços longitudinais e lavá-los novamente em PBS gelado (25 mL/P100, 5 mL/P60).
  6. Transferi as peças para um novo P100 com 25 mL (5 mL para P60) de PBS frio. Corte os pedaços em pequenos pedaços com uma tesoura pequena (figura 1B). Adicionar uma gota de colagenase 1 mg/mL B diluída em solução salina do Hank, equilibrada (HBSS) e picar as pequenas peças cuidadosamente com uma lâmina de barbear estéril (Figura 1).

2. digestão

  1. Adicione 10 mL (2,5 mL para P60) da solução B colagenase 1 mg/mL para o prato da etapa 1.6.
  2. Colocar a solução de colagenase B contendo os pedaços de coração picada em um inclinado (cerca de 30°) P100 (ou P60) em uma incubadora de 37 ° C (Figura 1).
  3. Incubar os pedaços de coração picada por um período máximo de 30 min; Homogeneizar por várias vezes, passando-os por meio de uma pipeta Pasteur cada 10min durante a incubação (Figura 1E).
    Nota: É importante para não exceder 30 min de incubação no total para etapa 1.3.

3. filtração

  1. Adicionar 10 mL (5 mL para P60) de frio HBSS suplementado com 2% FBS em pedaços o coração picada e homogeneizado.
    Nota: HBSS suplementado com 2% FBS sacia colagenase B atividade.
  2. Filtre os pedaços de coração 100 µm filtro para remover tecido não digerido e centrifugar 470 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT) (Figura 1F, filtros amarelos).
  3. Desprezar o sobrenadante e resuspenda o pellet em (3 mL para P60) de 5 mL de tampão de lise de células vermelhas do sangue e incubar a pelota por 5 min com agitação ocasional no gelo.
  4. Adicionar 10 mL (5 mL para P60) de PBS (para parar a reação de Lise) e filtrar a amostra através de um filtro de 40 µm para excluir células maiores, incluindo cardiomyocytes residual (Figura 1F, filtros azuis).
  5. Centrifugar o tubo a 470 x g durante 5 min à RT (sem freio). Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de DMEM, incluindo 10% FBS.
  6. Conte as células em uma alíquota com um hemocytometer. Ressuspender as células com DMEM, incluindo 10% FBS, visando a uma concentração final de célula de 1 x 106 células/mL.
    Nota: Aproximadamente 5 x 106 casos e eritrócitos-depleção de células podem ser estimadas por rato.
  7. Distribuir as células em dois tubos (Figura 2): no tubo A, adicionar 1,5 mL para coloração de Hoechst 33342 com verapamil; no tubo B, adicionar 18,5 mL para coloração de Hoechst 33342 e proceder à mancha e classificar as células cardíacas de SP (etapas 4.1 e 4.2) por citometria de fluxo.

4. classificação das células cardíacas SP por citometria de fluxo

Nota: Verapamil inibe a Hoechst efluxo bloqueando multirresistência atividade de transporte do ABC (MDR). Hoechst 33342 é um corante de ligação a DNA que pode ser usado em células vivas para detectar o ciclo celular, como correlaciona com o conteúdo de DNA. Hoechst-33342-expulsando células aparecem na parte de baixo de Hoechst de ambos os canais de emissão (450 nm, Hoechst azul; 650 nm, Hoechst vermelho), isto é, aparte da Hoechst-fixação "principal população", dando-lhes o seu nome "lado população". SP, células são enriquecidas em células com propriedades de progenitor e mostram uma alta expressão de transportadores de ABC multirresistentes (como MDR1 e ABCG2). Hoechst 33342 é escrito como Hoechst para as seguintes partes do protocolo. É importante proteger os materiais sensíveis à luz, para obter resultados ideais.

  1. Coloração com Hoechst na presença e na ausência de verapamil
    1. Adicione o verapamil (com uma concentração final de 83,3 µM) e Hoechst (com uma concentração final de 5 µ g/106 células) para a solução de célula. Para o tubo A, usar Verapamil e Hoechst; para o tubo B, use somente Hoechst. Incubar em banho de água (a 37 ° C) por 90 min e reverter os tubos a cada 20 min (Figura 1).
    2. Centrifugar os tubos a 470 x g durante 5 min à RT. descartar o sobrenadante e ressuspender cada em HBSS (1 x 106 células/mL).
    3. Pegue um 1,5 mL alíquota para colorações única e o controlo negativo do tubo B (Figura 2): (i) isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugado anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-conjugado anti-CD31; (iii) nonstained células (controle negativo).
      Nota: Isotipo controles são usados aqui para configurar o protocolo de isolamento.
    4. Tubos de centrifugação A e B e as alíquotas de controle único de coloração e negativo a 470 x g durante 5 min à RT para lavagem Hoechst e verapamil.
    5. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas de tubo A e (iii) o controle negativo em 250 µ l de HBSS e mantê-los no gelo no escuro até a classificação.
    6. Resuspenda o pellet de tubo B em 200 µ l de HBSS e a pelota de (i, ii) as alíquotas single-coloração em 100 µ l de HBSS. Adicione FITC-Conjugado anti-Sca-1 (0,6 µ g/107 células) e APC-conjugado anti-CD31 (0,25 µ g/107 células). Incubar as bolinhas por 30 min no gelo e agitá-los de vez em quando no escuro.
    7. Adicione 2 mL de HBSS para os tubos. Centrifugar os tubos a 470 x g durante 5 min à RT
    8. Desprezar o sobrenadante e ressuspender todos os chumbos com 1 mL de HBSS e centrífuga como acima. Descarte os sobrenadantes. Resuspenda o pellet das alíquotas single-coloração em 200 µ l de HBSS. Resuspenda o pellet de tubo B em HBSS (20 x 106 células/mL).
    9. Mantenha as amostras no gelo e protegido da luz, até a classificação.
  2. Classificação com citometria de fluxo
    1. Preparar estéril 1,5 mL classificação tubos com 500 µ l de HBSS, incluindo 2% FBS.
    2. Manche as células com o 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µ g/106 células) no gelo por 10 min para excluir as células mortas.
    3. Classificar o SP cardíaco usando as seguintes configurações: excitar Hoechst usando 350 excitação nm (UV), coletar de emissão de fluorescência com um filtro de passa-faixa 450/50 nm (Hoechst azul) e um filtro de passa-faixa 670/30 nm (vermelho de Hoechst) e usar um tamanho de bico de 100 µm e pressão de 15 libras por polegada quadrada.
    4. Para análise, grave 5 x 105 eventos para a classificação de amostras e 1 x 105 eventos para o controle negativo, controle de verapamil e single-manchando amostras.
      Nota: A cardíaca SP é de cerca de 0,5% - 2% (Figura 1-H), mas pode variar entre laboratórios e isolados. A Sca-1+/CD31– fração é de cerca de 1% e 11% do total SP cardíaca (Figura 1I) mas pode variar entre laboratórios e isolados. SCA-1+/CD31– SP-CPCs são escritos como SP-CPCs para as seguintes partes do protocolo.

5. principal cultura de SP-CPCs isolados

Nota: Três tipos diferentes de meios foram utilizados no presente protocolo. Eles são referidos como Medium 1 (de acordo com Noseda et al) 8, 2 médio e médio 3 e são descreveram na Tabela de materiais sobre sua composição.

  1. Aquecer médio 1 a 37 ° C antes do uso e arrefecer o centrifugador a 4 ° C. Centrifugar os tubos classificação a 4 ° C e 470 x g durante 6 min e ressuspender as células em média 1.
  2. Colocar as células em um prato P60 permeável ao gás com 4 mL de meio 1. Mude o cada 3 d médio até que as células têm alcançado confluência de 70-80%.
    Nota: Passo 5.2 pode demorar cerca de 2-3 semanas.

6. expansão e diferenciação de SP-CPCs

  1. Cultura celular
    1. Cultura de 3 x 105 SP-CPCs em 8 mL de médio 1 num balão T75.
    2. Incube SP-CPCs a 37 ° C com 5% CO2 até 70% - 80% de confluência, alterando o meio d cada 2-3.
      Nota: O número de células deve ser modificado de acordo com o tipo de CPCs usado, o tempo de duplicação e o tamanho da célula.
  2. SP-CPC crescimento e viabilidade sob concentrações séricas diferentes
    1. Cultura SP-CPCs para 2-3 d no T75 frascos com 8mL de médio 1. Cuidadosamente, Aspire o meio e lave delicadamente com 5 mL de quente (37 ° C) HBSS.
    2. Tratar as células com 5 mL de Trypsin-EDTA por 5 min na incubadora celular, adicionar 5 mL de meio 1 para evitar que a atividade de tripsina e transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL.
    3. Centrifugar as células a 470 x g durante 5 min à RT
    4. Ressuspender as células em médio 1 ou 2 médios (médio de indução de linhagem) e placa de 2.5 x 105 SP-CPCs em P60 pratos com 3 mL de meio contendo concentrações séricas diferentes.
    5. Recolha o meio do prato da etapa 6.2.4 para a coleção de células mortas em um tubo de 15 mL após 2 d de cultivo em médio 1 ou 2 médio.
    6. Trypsinize células aderentes como no passo 6.2.2 e coletar a suspensão de células dentro do tubo de 15 mL de passo 6.2.5. Centrifugar as células a 840 x g durante 5 min à RT
    7. Aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio 1 ou 2 médio para a contagem de células. Mancha de SP-CPCs com azul de trypan (0,4%) e contagem trypan azul-positivo (mortos) e trypan azul-negativo (viável) células.
      Nota: A viabilidade celular (passo 6.2.7) é dado como o número de células negativas trypan azul em relação ao número total de células.
  3. Indução de diferenciação endotelial
    1. Precoat uma placa de cultura (6-bem) com 10 µ g/mL de laminina (LN) ou fibronectina (FN).
      1. Fazer uma solução de substrato contendo 10 µ g/mL de LN ou FN com F12 médio (ou PBS). Adicione 2 mL de solução de substrato para cada poço. Manter a placa durante 30 min a 37 ° C.
      2. Aspirar a solução da chapa e adicione 2 mL de PBS a cada poço até usá-lo.
    2. Aspire o meio das células da etapa 6.1.2, lave-as delicadamente com 5 mL de quente (37 ° C) HBSS, tratá-los com 5 mL de Trypsin-EDTA por 5 min na incubadora celular, adicionar 5 mL de meio 1 para evitar que a atividade de tripsina e transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL.
    3. Centrifugar as células a 470 x g durante 5 min à RT. Aspire o sobrenadante e adicionar 2 médio para a contagem de células.
    4. Células de4 sementes 8x10 por bem na placa revestida com 3 mL de meio de 2 e mantém-lo a 37 ° C por 20-24 h.. mudança do meio de 3 mL de meio 3.
      Nota: Recomendamos o uso médio que contém uma concentração baixa de soro — e sem suplementos — para as primeiras 20-24 horas. É recomendável usar < confluência de célula de 60% (ou seja, o número de células da etapa 6.3.4 deve ser ajustado dependendo da taxa de crescimento e tamanho da célula).
    5. Cultura de células para 21 d e mudar o meio de cada 3 d.
    6. Verificar a natureza endotelial de células diferenciadas pela coloração-los com um marcador endotelial, tais como a von Willebrand (vWF) de fator e realizando microscopia de fluorescência.
      1. Lavar as células com 1 mL de PBS e consertar as células em 3,7% formaldeído por 2 min em RT
      2. Permeabilize as células com 0.1% Triton X em ddH O2(ou PBS) por 30 min e bloqueá-lo com 10% de soro de cabra por 1h no RT
      3. Incube as celulas com anti-von Willebrand factor anticorpos (1: 100) 48 h a 4 ° C
      4. Lavar as células 3 x 1 ml de PBS, durante 10 minutos cada vez. Incube-os com Alexa Fluor 546 cabra anticoelho secundário de anticorpos (1: 500) 1 h no RT no escuro.
      5. Lave novamente 3x, durante 10 minutos cada, com 1 mL de PBS. Mancha o núcleo de células com 4'6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI; 1: 500) durante 5 min à RT no escuro.
      6. Lavar as células 3 x, por 5 min cada, com 1 mL de PBS. Montar as células e armazená-los em 4 ° C
        Nota: As condições de cultivo (substrato, meio, reagentes complementares e concentração de FBS) dos passos 6.1 e 6.3 são descritas na Figura 3.
  4. Ensaio de formação de tubo
    1. Preparar uma matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel, doravante referida como matriz) placa.
      1. Descongele a matriz a 4 ° C durante a noite.
      2. Revesti uma placa de 96 poços com 100 µ l da matriz no gelo.
        Nota: É importante evitar quaisquer bolhas na matriz. As placas têm de ser revestido no gelo para evitar a geleificação da matriz.
      3. Manter a placa a 37 ° C por 30 min.
    2. Aspire o meio das células (após a conclusão da etapa 6.3.5), suavemente enxaguar as células com 5 mL de quente (37 ° C) HBSS e tratá-los com Trypsin-EDTA por 5 min na incubadora de célula. Adicione 3 médio para parar a atividade de tripsina e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL.
    3. Centrifugar as células a 470 x g durante 5 min à RT. Aspire o sobrenadante, adicionar 1 mL de meio 3 e pipetar suavemente.
    4. Filtre as células com um coador de célula de 35 µm, se as células são agregadas.
    5. Contar as células e semente de 2 x 103 a 4 x 103 células em 100 µ l de meio 3 em cada matriz-revestido bem. Manter a placa a 37 ° C, a incubadora de célula para 16 h.
    6. Tire uma foto com um microscópio de campo claro na ampliação de X 2.
      Nota: No caso de uma tripsinização incompleta, prolonga o tempo de exposição para Trypsin-EDTA para um máximo de 7-8 min.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolamento do CPC-SP de mouse:

Neste estudo, nós usamos o CPCs de rato isolados de acordo com o fenótipo de SP, Considerando que os resultados do rato CPCs são modificados e adicionados de um relatório anterior com permissão (Figura 8)33.

Proliferação de célula em célula de alta e baixa densidades e com concentrações dife...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vantagens do presente protocolo:

Este protocolo fornece uma técnica de diferenciação endotelial do CPCs. Achamos que uma concentração sérica baixa e a densidade celular baixa podem melhorar a eficiência da diferenciação endotelial, pelo qual LN provou para ser um substrato mais adequado do que FN nestas condições. Nós usamos dois tipos distintos de CPCs: rato CPCs, que foram usados em uma maneira semelhante ao linha de celular e mouse SP-CPCs, que foram isoladas e expandido. Notavelmente, o proto...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecer Vera Lorenz seu apoio útil durante as experiências e o pessoal da instalação de citometria de fluxo do departamento de Biomedicina (DBM), University e University Hospital Basel. Este trabalho foi apoiado pelo programa estadia-na pista da Universidade da Basileia (para Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster é suportado por uma concessão do Swiss National Science Foundation (número de concessão de 310030_156953).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de cultura
Meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)ThermoFisher#12440
Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/Mistura de nutrientes F12 PresuntoMerck#D8437
Penicilina-estreptomicina (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal bovino Soro (FBS)Hyclone#SH300713,5% (0,1% para indução de linhagem)
L-Glutamina ThermoFisher#25030Concentração final 2 mM
GlutationaMerck#G6013
Fator de Crescimento Epidérmico Humano Recombinante (EGF)Peprotech#AF-100-15
Fator de Crescimento Básico Recombinante de Fibroblastos (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 SuplementoThermoFisher#17504044
Cardiotrofina 1 Peprotech#250-25
TrombinaDiagontech AG, Suíça#100-125
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0,05% Tripsina-EDTAThermoFisher#25300
T75 FrascoSarstedt#83.3911
Diferenciação endotelial   
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronectina Merck#F4759Diluir em solução de
Falcon#353046de placa de 6 poços
DDH2O Merck#F1635Diluito 1:10 em PBS (concentração final de 3,7%)
Triton X-100Merck#934200,1% em ddH2O
Soro de cabra normal (10%)ThermoFisher#50062Z
anticorpo anti-fator de von WillebrandAbcam#ab69941:100 in 10% soro de cabra
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 in 10% soro de cabra
4',6-diamidino-2-fenilidol, dicloridrato (DAPI)ThermoFisher#622471:500 in ddH2O 
Kit Antifade SlowFadeThermoFisher#S2828
microscópio de campo amplo BX63Olympus
Formação de tubos
96 Placa de PoçoFalcon#353072
Tubo de Fundo Redondo de 5 ml com Tampa de FiltroFalcon#352235
Matrigel Fator de Crescimento ReduzidoMicroscópio de campo amplo Corning#354230
IX50Olympus
Sca-1+/CD31- isolamento da população do lado cardíaco34 
Reagentes
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.farmácia hospitalar interna#9077862Solução de trabalho: 200 mg/kg
de solução salina tamponada com fosfato (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), vermelho de fenol (-)ThermoFisher#14175Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  para extinguir a atividade da colagenase B 
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) 1g/L de D-Glicose, L-Glutamina, PiruvatoThermoFisher#331885Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S para Hoechst Stanining
Penicilina-Estreptomicina  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Concentração final 25 mM
Soro Fetal Bovino (FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLDiluir para 1X em ddH2O e filtrar através de um 0.2 µ m filtro
Colagenase BMerck#11088807001Concentração final 1 mg/mL em HBSS, filtrada através de um 0,2 µ m filtro
bisBenzimida H33342 Tricloridrato (Hoechst)Merck#B2261Prepare 1 mg/mL em ddH2O
Verapamil-cloridrato Merck#V4629Concentração final 83.3 µ M 
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences#5512620.25 µ g/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050.6 µ g/107cells
7-Aminoactinomicina D (7-ADD)ThermoFisher#A13100,15 µ g/106cells
APC rato IgG2a k Controle de IsotipoBD Biosciences#5539320.25 µ g/107cells
FITC Rat IgG2a k Controle de IsotipoBD Biosciences#5546880.6 µ g/107cells
Material
Agulhas 27GTerumo#NN-2719R
Agulhas 18GTerumo#NN-1838S
Seringas de uso único 1 mL estérilCODAN#62.1640
Transferpipeta 3,5 mLSarstedt#86.1171.001
Cell Peneira 40 µ m azulBD Biosciences #352340
Filtro de Células 100 µ m amareloBD Biosciences#352360
Lumox Dish 50Sarstedt#94.6077.305
Culture Dishes P100Corning#353003
Culture Dishes P60Corning#353004
Mouse
LineAgeReprodução
C57BL/6NRj / macho12 semanasem casa
Nome do produtoCompanyNº de catálogo
Reagentes
Meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)ThermoFisher#12440
Meio de Águia Modificado (DMEM)/Mistura de Nutrientes F12 HamMerck#D8437
Penicilina-Estreptomicina  (P/S)ThermoFisher#15140122
Soro Fetal Bovino (FBS)Hyclone#SH30071
L-Glutamina ThermoFisher#25030
GlutationaMerck#G6013
B27 SuplementoThermoFisher#17504044
Fator de Crescimento Epidérmico Humano Recombinante (EGF)Peprotech#AF-100-15
Fator de Crescimento Básico Recombinante de Fibroblastos (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Cardiotrofina 1 Peprotech#250-25
TrombinaDiagontech AG, Suíça #100-125
Meio de Crescimento de Células Endoteliais (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Visão geral das composições médias. Algumas dessas informações são idênticas às fornecidas acima, mas classificadas de acordo com a composição da Mídia 1-3. < / strong>
Nome do produto< / strong>Medium 18< / sup>< / strong>Medium 2< / strong>Medium 3< / strong>
Reagents< / strong>Culture< / strong>Indução de linhagem< / strong>Endotelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)35%35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham65%65%
Penicilina-Estreptomicina  (P/S)1%1%
Soro Fetal Bovino (FBS)3.5%≤ 0,1%
L-Glutamina 2 mM2 mM
Glutationa0,2 nM0,2 nM
Suplemento B271,3%
Fator de Crescimento Epidérmico Humano Recombinante (EGF)6,5 ng/mL
Fator de Crescimento de Fibroblastos Básicos Recombinantes (FGF)13 ng/mL
Cardiotrofina 1 0,65 ng/mL
Trombina0,0005 U/mLTodos os componentes necessários incluídos no kit
Meio de crescimento de células endoteliais (EGM)-2 BulletKitTodos os componentes necessários incluídos no kit
formaldeído

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930(2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195(2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669(2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Terapia CelularCompromisso de LinhagemSubstrato de LamininaForma o de TubosMicroscopia de Fluoresc nciaDensidade CelularDigest o com Colagenase

Artigos relacionados