Citometria de fluxo phospho com Barcoding fluorescente de célula para célula única sinalização análise e descoberta de Biomarker

Summary

Aqui, apresenta-se um protocolo para análise de médio - a elevado-produção de eventos de fosforilação de proteínas no nível celular. Phospho citometria de fluxo é uma poderosa abordagem para caracterizar as aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.

Abstract

Sinalização celular aberrante desempenha um papel central no desenvolvimento do câncer e progressão. Terapias alvo mais romance na verdade são dirigidas a proteínas e funções de proteínas, e aberrações de sinalização celular, portanto, podem servir como biomarcadores para indicar as opções de tratamento personalizado. Ao contrário de análises de DNA e RNA, alterações na atividade da proteína mais eficientemente podem avaliar os mecanismos subjacentes a sensibilidade de drogas e resistência. Phospho citometria de fluxo é uma técnica poderosa que mede eventos de fosforilação de proteínas a nível celular, uma característica importante que distingue este método de outras abordagens de anticorpo. O método permite a análise simultânea de várias proteínas de sinalização. Em combinação com código de barras fluorescente célula, médio-alto rendimento-conjuntos de dados maiores podem ser adquiridos pelo hardware padrão citômetro em curto espaço de tempo. Citometria de fluxo phospho tem aplicações tanto em estudos de biologia básica e em pesquisa clínica, incluindo a sinalização de análise e descoberta de biomarcador de farmacodinâmica. Aqui, um protocolo experimental pormenorizado é fornecido para análise de fluxo phospho de células mononucleares de sangue periférico purificada, utilizando células de leucemia linfocítica crônica como exemplo.

Introduction

Phospho citometria de fluxo é utilizada para analisar os níveis de fosforilação de proteínas em célula única resolução. O objetivo geral do método é mapear os padrões de sinalização celulares sob condições especificadas. Explorando a capacidade multiparâmetro da citometria de fluxo, várias vias de sinalização podem ser analisadas simultaneamente em diferentes subconjuntos de uma população celular heterogênea como sangue periférico. Estas características oferecem vantagens sobre outras tecnologias baseadas em anticorpos como imuno-histoquímica, ensaio imunoenzimático (ELISA), matriz de proteína e proteína de fase inversa matriz (RPPA)¹. Phospho citometria de fluxo pode ser combinada com células fluorescentes barcoding (FCB), que significa que amostras de células individuais são rotuladas com assinaturas exclusivas de corantes fluorescentes para que eles podem ser misturados, manchados e analisados como uma única amostra². Isso reduz o consumo de anticorpos, aumenta a robustez de dados através da combinação de controle e amostras tratadas e aumenta a velocidade de aquisição. A população combinada de FCB pode ser dividida em pequenas amostras e manchada com até 35 distintos Anticorpos fosfo-específicos, dependendo da quantidade de material começar. Grandes experiências de criação de perfil podem, assim, ser executadas com hardware citômetro padrão. Phospho citometria de fluxo tem sido aplicada ao perfil sinalização percursos em amostras de pacientes de vários cancros hematológicos, incluindo a leucemia linfocítica crônica (CLL)^3,4,5, leucemia mieloide aguda (LMA) ⁶ e não-Hodgkin linfomas⁷. Phospho citometria de fluxo é, portanto, uma abordagem poderosa para caracterizar as aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.

Aqui, o protocolo otimizado para análise de amostras de pacientes CLL por citometria de fluxo phospho é fornecido (figura 1A). São mostrados exemplos de caracterização de sinalização basal, estimulação do receptor de células B/anti-IgM e perturbação de drogas. É fornecida uma descrição detalhada de uma matriz FCB. O protocolo pode ser facilmente adaptado para outros tipos de células de suspensão.

Protocol

Amostras de sangue foram recebidas após consentimento escrito de todos os doadores. O estudo foi aprovado pelo Comitê Regional para médicos e de saúde investigação ética do sudeste da Noruega e a pesquisa sobre o sangue humano foi realizada em conformidade com a declaração de Helsinque,⁸.

Nota: Passos 1-3 devem ser realizados sob condições estéreis de um capuz de cultura de tecidos.

1. isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) das amostras de sangue de paciente CLL

Atenção: O sangue humano deve ser tratado de acordo com as normas de biossegurança nível 2.

1. Diluir o sangue de 1:1 com tampão fosfato salino (PBS: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) e a transferência para tubos de 50 mL (30 mL/tubo).
2. Cuidadosamente, camada 10 mL de um médio gradiente de densidade (por exemplo, Lymphoprep) para o fundo do tubo com uma pipeta de 10 mL.
3. Centrifugar 800 x g por 20 min a 4 ° C. Os PBMCs são agora visíveis no topo da camada Médio gradiente de densidade.
4. Use uma pipeta Pasteur para transferir as células em dois novos tubos de 50 mL. Lave duas vezes com PBS (encher os tubos).
5. Centrifugar a 350 x g, durante 15 min. descartar o sobrenadante e ressuspender em 3 mL de PBS.
6. Conte as células usando um método preferido.
7. Centrifugar as células a 350 x g por 5 min. descartar o sobrenadante. Nota: Etapas de 1.8 para 3.2 são opcionais. É possível proceder directamente à etapa 3.3.
8. Ressuspender as células em soro bovino fetal (FBS) suplementado com 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e congelar para baixo em alíquotas apropriadas usar tubos de criogenia.
   Nota: DMSO é tóxico para as células. Trabalho rápido, uma vez que as células são misturadas com FBS/DMSO. Células podem ser armazenados de longo prazo em nitrogênio líquido.

2. descongelamento das células

1. Descongele rapidamente as células em banho maria a 37 ° C.
   Nota: DMSO é tóxico para as células. Trabalho rápido para limitar a exposição ao DMSO.
2. Lave as células uma vez com 10 mL de meio de Roswell Park Memorial Institute frio (RPMI 1640 com GlutaMAX suplementar, consulte a Tabela de materiais).
3. Centrifugar a 300 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
4. Ressuspender as células em meio RPMI 1640 suplementado com piruvato de sódio, MEM não aminoácidos essenciais e penicilina/estreptomicina (adicionado a diluição 1x de acordo com as instruções) e 10% FBS. As células de transferência para um balão de cultura de células pequenas e deixar em uma incubadora a 5% CO₂, 37 ° C por 1 hora permitir que as células calibrar.

3. preparação de células

1. Conte as células viáveis usando um método preferido.
2. Transfira as células para um tubo de 50 mL e centrifugar 300 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
3. Ressuspender as células em meio RPMI 1640 (passo 2.2) suplementadas com 1% FBS a não mais de 50 x 10⁶ células/mL.
4. Transferi a quantidade necessária de suspensão de células para poços em uma placa de V-fundo bem 96.
   Nota: Número de poços corresponde ao número de condições a serem testadas. Amostras para um tempo de estimulação-curso são retiradas de um único poço. Calcule 50 µ l da amostra por ponto de tempo + 50 µ l de volume morto. Salve amostras para controles de compensação (um exemplo imaculado + uma amostra por corante de código de barras).
5. Transferi a placa bem 96 para um banho de água pré-aquecida a 37 ° C. Descanse as células por 10 min.

4. a estimulação e a fixação das células

Nota: Execute as etapas 4-8 no banco do laboratório (ou seja, não estéril).

Cuidado: O ingrediente principal do Buffer de corrigir eu é o paraformaldeído, que é tóxico (contato de pele e inalação). Manuseie com cuidado.

1. Preparar um prato de V-fundo bem 96 com 60 µ l de tampão Fix eu por alvéolo por amostra. Deixe em banho-maria a 37 ° C.
   Nota: Células: Buffer de correção deve ser 1:1. Para permitir a 37 ° C, a reserva de correção é inicialmente em abundância.
2. Opcionalmente, trate as células com drogas antes de estimulação.
3. Transferi uma amostra de 50 µ l de controlo para a placa de correção. Misture pipetando para cima e para baixo.
4. Opcionalmente, inicie o tempo de estimulação-curso pela adição de 10 µ g/mL anti-IgM para as células. Misture pipetando para cima e para baixo.
5. Transferi um 50 µ l da amostra para a placa de correção em cada ponto de tempo. Misture pipetando para cima e para baixo.
   Nota: Anti-IgM induzida geralmente é iniciada no início de sinalização (minutos).
6. Deixe o prato de correção a 37 ° C por 10 min após a última amostra foi adicionada.

5. fluorescente célula Barcoding (FCB)

Nota: Consulte a tabela 1 para obter uma lista de reagentes de código de barras.

1. Lavar as células fixas 3 x com PBS (encher os poços).
2. Centrifugar a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
3. Prepare um prato de V-fundo bem 96 com reagentes de código de barras. Pipetar 5 µ l de cada reagente de código de barras por alvéolo no número de combinações necessárias para manchar todas as amostras após coloração matrix, por exemplo, na figura 1B. Cada amostra terá uma combinação única de código de barras diferentes concentrações.
4. Ressuspender as células em 190 µ l de PBS e transferência para a placa de código de barras. Misture bem.
   Nota: Manchar uma amostra de compensação com a maior concentração final usada para cada reagente de código de barras e guardar uma amostra imaculada.
5. Deixe as células por 20 min à temperatura ambiente, no escuro.
6. Lavar as células coradas 2 x com lavagem de fluxo (PBS, 1% FBS, 0,09% de azida de sódio) (encher os poços).
7. Centrifugar a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
8. Adicionar µ l 190 de lavagem de fluxo para as células e combinar as amostras de código de barras em um tubo de 15 mL. Transferi cada controle de compensação para um tubo separado 1,7 mL.
9. Centrifugar a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.

6. célula permeabilização para coloracao intracelular do antígeno

Cuidado: O ingrediente principal de Perm Buffer III é metanol, que é tóxico (contato de pele e inalação) e inflamável. Manuseie com cuidado.

1. Transferência de 2 mL de Perm III de Buffer para um tubo de 15 mL. Deixe a-20 ° C é gelada após o uso.
   Nota: O Buffer de Perm pode ser deixado a-20 ° C, desde o início do experimento.
2. Adicione 1,5 mL de tampão de Perm gelada para a população de células de código de barras (em um tubo de 15 mL) e 100 µ l de cada controle de compensação (em tubos de 1,7 mL) drop-wise enquanto num Vortex para evitar que as células aglutinar-se.
3. Transferir as células diretamente a-80 ° C. Deixe por um período mínimo de 30 min.
   Nota: É natural que o experimento uma pausa neste ponto. Células de Perm Buffer podem ser armazenado a longo prazo a-80 ° C.

7. anticorpos

Nota: Consulte Tabela de materiais para obter uma lista dos relatados Anticorpos fosfo-específicos.

1. Transferi as células de-80 ° C para uma caixa de gelo.
2. Lave 3x com lavagem de fluxo.
   Nota: É importante adicionar fluxo de lavagem em excesso para ver o centrifugado, por exemplo, adicionar 3 mL de lavagem de fluxo para a população de células de código de barras e 1 mL de cada controle de compensação.
3. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
4. Resuspenda população celular de código de barras em um volume de lavagem de fluxo, que permite que 25 µ l de suspensão de células por mancha phospho-anticorpo. Resuspenda os controles de compensação em 200 µ l de lavagem de fluxo.
5. Prepare-se anticorpos para coloração em uma placa de V-fundo bem 96. O volume final será 50 µ l/poço. Por bem, acrescentar phospho-específico do anticorpo diluído em lavagem de fluxo para um volume final de 10 µ l, marcador de superfície diluído em fluxo de lavagem até um volume final de 15 µ l e 25 µ l de suspensão de células.
   Nota: Diluições de anticorpo devem ser tituladas antes do experimento. Inclua do isotipo controle.
6. Deixe as células por 30 min à temperatura ambiente, no escuro.
7. Lavar as células coradas 2 x com lavagem de fluxo (encher os poços).
8. Centrifugar a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
9. Ressuspender as células em 150 µ l de lavagem de fluxo.

8. elaboração de controles de compensação

1. Prepare-se controles de compensação para os anticorpo conjugado fluorochromes em paralelo com a mancha do anticorpo. Use contas de compensação, de acordo com instruções do fornecedor.

9. fluxo Cytometry Analysis

Nota: O experimento pode ser executado em um citômetro de fluxo com uma alta taxa de transferência Sampler (HTS).

1. Otimize a tensão do tubo (PMT) fotomultiplicador com o controle imaculado.
2. Executar os controles de compensação e calcular a matriz de compensação.
3. Execute amostras. A taxa de evento deve ser em conformidade com as especificações do instrumento.

10. retenção de estratégia e análise de dados

1. Importe os arquivos FCS do experimento para um software de análise de citometria de fluxo como FlowJo ou Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. Estratégia de retenção
   1. Selecione os linfócitos plotando SSC-A contra o FSC-A em uma trama de pontos de densidade.
   2. Exibir os linfócitos e selecionar os singletos plotando SSC-A contra o FSC - W.
   3. Exiba as células únicas e portão a célula digite plotando SSC-A contra o marcador de superfície.
   4. Exibir a população de tipo de célula em uma trama de SSC-A densidade versus Pacific Blue e selecionar as diferentes populações de FCB baseadas sua intensidade de coloração Pacific Blue (ver figura 1A).
   5. Sinopse o canal de Anticorpos fosfo contra o canal do FCB, ou como um heatmap (ver Fig. 1A) para exibir os eventos de fosforilação.
3. Calcular usando o seno hiperbólico inverso (arcsinh) de IFM (mediana intensidade fluorescente) de fosfo-sinal contra isotipo controle phospho-sinais (níveis basais de fosforilação, ver Figura 1), ou de estimulada contra populações de células unstimulated (ver Figura 1E).

Results

As principais etapas do protocolo de citometria de fluxo phospho estão ilustradas na figura 1A. No exemplo apresentado, células CLL estavam manchadas com o reagente de barcoding Pacific Blue em quatro diluições. Barcoding tridimensional pode ser realizada através da combinação de três corantes de código de barras, conforme ilustrado na figura 1B. As amostras individuais são então deconvoluted pelo gating subsequentes em cada códi...

Discussion

Phospho citometria de fluxo é uma técnica poderosa para medir os níveis de fosforilação de proteínas em células únicas. Desde que o método se baseia na coloração com anticorpos, phospho citometria de fluxo é limitada pela disponibilidade de anticorpos. Além disso, a fim de obter resultados fiáveis, todos os anticorpos devem ser titulados e verificados antes do uso. Um protocolo detalhado para titulação de Anticorpos fosfo-específicos tem sido descrito em outro lugar¹². Durante o projeto do painel,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Meio de cultura celular
Soro fetal bovino	ThermoFisher Scientific	10270169	Aditivo para meio de cultura celular
Piruvato de sódio	ThermoFisher Scientific	11360-039	Aditivo para meio de cultura celular
Aminoácidos não essenciais MEM	ThermoFisher Scientific	11140-035	Aditivo para meio de cultura celular
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Meio de gradiente de densidade
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Para estimulação do receptor de células B
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Tampão de fixação
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Tampão de permeabilização
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Reagente de código
de barras Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Reagente de código de barras
Pacific Orange Succinimidyl Ester, sal de trietilamônio	ThermoFisher Scientific	P30253	Reagente de código de barras
Contas de compensação	Definido pelo usuário		Espécies corretas reatividade
Tubos Falcon	Definido pelo usuário
Eppendorf tubes	Definido pelo usuário
96 placas de fundo em V de 96 poços	Definido pelo usuário		Compatível com o citômetro de fluxo
Centrífugas	Definido pelo usuário		Para tubos Eppendorf, tubos Falcon e placas
Banho-maria	Definido pelo usuário		Citômetro de fluxo regulado por temperatura
	Definido pelo usuário		Com amostrador de alto rendimento (HTS)
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
< strong>Antígeno
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Os inibidores da tirosina quinase do baço reduzem…, Hematológica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Referência: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284 < br / > Parente-Ribes et al., 2016, Inibidores de tirosina quinase do baço reduzem…, Haematologica, 101 (2): e59-62 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
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Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Clone: 24a/BTK (Y551)  Referência: Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Inibidores da tirosina quinase do baço reduzem…, Hematológica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pág. 142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Reference: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
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LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Clone: I58-1169 Referência: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κ B p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, A interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
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p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)	Cell Signaling Technologies	4375	Clone: E10 Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Inibidores de tirosina quinase do baço reduzem…, Haematologica, 101 (2): e59-62 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, A interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
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p53 (pS20)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Referência: Irish et al., 2007, Duplicação Flt3 Y591 e superexpressão de Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, duplicação Flt3 Y591 e superexpressão de Bcl-2…, Sangue, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicação e superexpressão de Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicação e superexpressão de Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
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Rb (pS807/pS811)	Beckton Dickinson Pharmingen	558590	Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, A interleucina-33 impulsiona um endotélio pró-inflamatório…, Trombomba Arterioscler Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)	Tecnologias de Sinalização Celular	4851	Clone: D57.2.2E Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)	Tecnologias de Sinalização Celular	9257	Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	Clone: J141-668.36.58  Reference: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)	Beckton Dickinson Pharmingen	557815	Clone: 4/P-STAT3 Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Clone: Polyclonal Referência: Uzel et al., 2001, Detecção de STAT-4 fosforilada intracelular por citometria de fluxo, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/P-Stat6 Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284
SYK (pY525 / Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	< strong > Clone: < / strong> C87C1 < br / > Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Inibidores de tirosina quinase do baço reduzem…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770