Citometria de fluxo phospho com Barcoding fluorescente de célula para célula única sinalização análise e descoberta de Biomarker

Resumo

Aqui, apresenta-se um protocolo para análise de médio - a elevado-produção de eventos de fosforilação de proteínas no nível celular. Phospho citometria de fluxo é uma poderosa abordagem para caracterizar as aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.

Resumo

Sinalização celular aberrante desempenha um papel central no desenvolvimento do câncer e progressão. Terapias alvo mais romance na verdade são dirigidas a proteínas e funções de proteínas, e aberrações de sinalização celular, portanto, podem servir como biomarcadores para indicar as opções de tratamento personalizado. Ao contrário de análises de DNA e RNA, alterações na atividade da proteína mais eficientemente podem avaliar os mecanismos subjacentes a sensibilidade de drogas e resistência. Phospho citometria de fluxo é uma técnica poderosa que mede eventos de fosforilação de proteínas a nível celular, uma característica importante que distingue este método de outras abordagens de anticorpo. O método permite a análise simultânea de várias proteínas de sinalização. Em combinação com código de barras fluorescente célula, médio-alto rendimento-conjuntos de dados maiores podem ser adquiridos pelo hardware padrão citômetro em curto espaço de tempo. Citometria de fluxo phospho tem aplicações tanto em estudos de biologia básica e em pesquisa clínica, incluindo a sinalização de análise e descoberta de biomarcador de farmacodinâmica. Aqui, um protocolo experimental pormenorizado é fornecido para análise de fluxo phospho de células mononucleares de sangue periférico purificada, utilizando células de leucemia linfocítica crônica como exemplo.

Introdução

Phospho citometria de fluxo é utilizada para analisar os níveis de fosforilação de proteínas em célula única resolução. O objetivo geral do método é mapear os padrões de sinalização celulares sob condições especificadas. Explorando a capacidade multiparâmetro da citometria de fluxo, várias vias de sinalização podem ser analisadas simultaneamente em diferentes subconjuntos de uma população celular heterogênea como sangue periférico. Estas características oferecem vantagens sobre outras tecnologias baseadas em anticorpos como imuno-histoquímica, ensaio imunoenzimático (ELISA), matriz de proteína e proteína de fase inversa matriz (RPPA)¹. Phospho ....

Protocolo

Amostras de sangue foram recebidas após consentimento escrito de todos os doadores. O estudo foi aprovado pelo Comitê Regional para médicos e de saúde investigação ética do sudeste da Noruega e a pesquisa sobre o sangue humano foi realizada em conformidade com a declaração de Helsinque,⁸.

Nota: Passos 1-3 devem ser realizados sob condições estéreis de um capuz de cultura de tecidos.

1. isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) das amostras de sangue de paciente CLL

Atenção: O sangue humano deve ser tratado de acordo com as no....

Resultados

As principais etapas do protocolo de citometria de fluxo phospho estão ilustradas na figura 1A. No exemplo apresentado, células CLL estavam manchadas com o reagente de barcoding Pacific Blue em quatro diluições. Barcoding tridimensional pode ser realizada através da combinação de três corantes de código de barras, conforme ilustrado na figura 1B. As amostras individuais são então deconvoluted pelo gating subsequentes em cada códi.......

Discussão

Phospho citometria de fluxo é uma técnica poderosa para medir os níveis de fosforilação de proteínas em células únicas. Desde que o método se baseia na coloração com anticorpos, phospho citometria de fluxo é limitada pela disponibilidade de anticorpos. Além disso, a fim de obter resultados fiáveis, todos os anticorpos devem ser titulados e verificados antes do uso. Um protocolo detalhado para titulação de Anticorpos fosfo-específicos tem sido descrito em outro lugar¹². Durante o projeto do painel,.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Meio de cultura celular
Soro fetal bovino	ThermoFisher Scientific	10270169	Aditivo para meio de cultura celular
Piruvato de sódio	ThermoFisher Scientific	11360-039	Aditivo para meio de cultura celular
Aminoácidos não essenciais MEM	ThermoFisher Scientific	11140-035	Aditivo para meio de cultura celular
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Meio de gradiente de densidade
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Para estimulação do receptor de células B
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Tampão de fixação
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Tampão de permeabilização
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Reagente de código
de barras Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Reagente de código de barras
Pacific Orange Succinimidyl Ester, sal de trietilamônio	ThermoFisher Scientific	P30253	Reagente de código de barras
Contas de compensação	Definido pelo usuário		Espécies corretas reatividade
Tubos Falcon	Definido pelo usuário
Eppendorf tubes	Definido pelo usuário
96 placas de fundo em V de 96 poços	Definido pelo usuário		Compatível com o citômetro de fluxo
Centrífugas	Definido pelo usuário		Para tubos Eppendorf, tubos Falcon e placas
Banho-maria	Definido pelo usuário		Citômetro de fluxo regulado por temperatura
	Definido pelo usuário		Com amostrador de alto rendimento (HTS)
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
< strong>Antígeno
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Os inibidores da tirosina quinase do baço reduzem…, Hematológica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Referência: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284 < br / > Parente-Ribes et al., 2016, Inibidores de tirosina quinase do baço reduzem…, Haematologica, 101 (2): e59-62 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)	Beckton Dickinson Pharmingen	564846	Clone: N35-86 Referência: Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Clone: 24a/BTK (Y551)  Referência: Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Inibidores da tirosina quinase do baço reduzem…, Hematológica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pág. 142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Reference: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Iκ B&alfa;	Cell Signaling Technologies	5743	Clone: L35A5 Referência: Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Clone: I58-1169 Referência: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κ B p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, A interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κ B p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	< strong > Clone: < / strong> 93H1 < br / > Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284 < br / > Sk å nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)	Cell Signaling Technologies	4375	Clone: E10 Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Inibidores de tirosina quinase do baço reduzem…, Haematologica, 101 (2): e59-62 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, A interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: 16G8 Referência: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicação e superexpressão de Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS20)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Referência: Irish et al., 2007, Duplicação Flt3 Y591 e superexpressão de Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, duplicação Flt3 Y591 e superexpressão de Bcl-2…, Sangue, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicação e superexpressão de Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplicação e superexpressão de Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ 2 (pY759)	Beckton Dickinson Pharmingen	558498	Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)	Beckton Dickinson Pharmingen	558590	Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, A interleucina-33 impulsiona um endotélio pró-inflamatório…, Trombomba Arterioscler Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)	Tecnologias de Sinalização Celular	4851	Clone: D57.2.2E Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)	Tecnologias de Sinalização Celular	9257	Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleucina-33 conduz um endotélio pró-inflamatório…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	Clone: J141-668.36.58  Reference: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)	Beckton Dickinson Pharmingen	557815	Clone: 4/P-STAT3 Referência: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Clone: Polyclonal Referência: Uzel et al., 2001, Detecção de STAT-4 fosforilada intracelular por citometria de fluxo, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/P-Stat6 Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284
SYK (pY525 / Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	< strong > Clone: < / strong> C87C1 < br / > Referência: < / strong> Myhrvold et al., 2018, Perfil de célula única dos níveis de fosfoproteína em .., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Inibidores de tirosina quinase do baço reduzem…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skå nland et al., 2014, Co-estimulação de células T através do CD2 e CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulação da sinalização proximal em normal e transformado…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Padrões distintos de sinalização do receptor de células B em…, Sangue, 129(6): 759-770