Summary
Burada, hücresel düzeyde protein fosforilasyon olayların orta-yüksek performans analizi için bir protokol sunulmuştur. Fosfo akış sitometresi sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.
Abstract
Anormal hücre sinyallemesi kanser gelişme ve ilerleme içinde merkezi bir rol oynar. En yeni hedefli tedaviler gerçekten de protein ve protein işlevleri yönlendirilir ve hücre sinyal aberasyonları bu nedenle kişiselleştirilmiş tedavi seçenekleri belirtmek için biyolojik hizmet verebilir. DNA ve RNA analizleri aksine, protein aktivite değişiklikleri ilaç duyarlılığı ve direnç temel mekanizmaları daha verimli bir şekilde değerlendirebilir. Fosfo akış sitometresi protein fosforilasyon olaylar hücresel düzeyde, bu yöntem diğer antikor tabanlı yaklaşımlardan ayıran önemli bir özelliği ölçer güçlü bir tekniktir. Yöntemi aynı anda birden çok sinyal proteinleri analiz için sağlar. Floresan cep barkod ile birlikte, daha büyük orta-yüksek performans veri setleri kısa sürede standart sitometresi donanım tarafından elde edilebilir. Fosfo akış sitometresi uygulamaları temel biyoloji çalışmalarda ve klinik araştırmada, sinyal analizi, biyomarker keşif ve özellikler bir değerlendirme de dahil olmak üzere var. Burada, detaylı bir deneysel protokol Fosfo akışı analizi arıtılmış periferik kan mononükleer hücre, kronik lenfositik lösemi hücreleri örnek olarak kullanarak sağlar.
Introduction
Fosfo akış sitometresi protein fosforilasyon düzeyleri tek hücreli çözünürlükte analiz etmek için kullanılır. Genel yöntem belirtilen koşullar altında hücresel sinyal desenleri eşlemek için hedeftir. Akış Sitometresi multiparameter kapasitesi sömürerek, birkaç sinyal yollar aynı anda periferik kan gibi türdeş olmayan hücre nüfusunun farklı alt kümeleri olarak analiz edilebilir. Bu özellikler diğer antikor tabanlı teknolojileri immünhistokimya, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), protein dizi ve ters faz protein dizi (RPPA)1gibi avantajlar sunuyor. Fosfo akış sitometresi floresan cep Barkod (FCB), böylece onlar birlikte karışık olabilir, lekeli ve tek örnek2olarak analiz tek hücre örnekleri floresan boyalar benzersiz imzaları ile etiketlenir anlamına gelir ile kombine edilebilir. Bu antikor tüketimini azaltır veri sağlamlık, kontrol ve tedavi örnekleri birleşimiyle artar ve edinme hızını artırır. Kombine FCB nüfus daha küçük örnekleri bölünmüş ve malzeme başlayan miktarına bağlı olarak 35 farklı Fosfo-özel antikorlar ile lekeli. Büyük profil oluşturma deneyler böylece, standart sitometresi donanım ile çalıştırabilirsiniz. Fosfo akış sitometresi yollar hasta numuneleri kronik lenfositik lösemi (CLL)3,4,5, akut miyeloid lösemi (AML) dahil olmak üzere birçok hematolojik kanserlerin sinyal profil uygulandı 6 ve non-Hodgkin lenfomalarin bazilarinin7. Fosfo akış sitometresi böylece sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.
Burada, analiz Fosfo akış sitometresi tarafından CLL hasta örnekleri için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı (Şekil 1A) sağlanır. Bazal sinyal karakterizasyonu, anti-IgM/B hücre reseptörü stimülasyon ve uyuşturucu pertürbasyon örnekleri gösterilir. Bir FCB matris ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Protokol kolayca diğer süspansiyon hücre tipleri için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yazılı onam tüm bağış takip kan örnekleri alındı. Tıp ve sağlık araştırma etik ve Güney-Doğu Norveç için çalışma bölge Komitesi tarafından kabul edildi ve insan kanı üzerinde araştırma Helsinki Bildirgesi8uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Not: 1-3 adımları bir doku kültürü başlıklı steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.
1. yalıtım periferik kan mononükleer hücre (PBMCs) CLL hasta kan örnekleri
Dikkat: İnsan kanı seviye 2 için düzenlemelere göre ele alınmalıdır.
- Kan fosfat tamponlu tuz ile 1:1 oranında seyreltin (PBS: 136.9 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10,1 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 1.8 mM KH2PO4, pH 7,4) ve 50 mL tüpler (30 mL/tüp) aktarmak.
- Dikkatli bir yoğunluk gradient Orta (Örneğin, Lymphoprep) 10 mL tüp 10 mL pipet kullanarak alt katman.
- 4 ° C'de 20 dk için 800 x g, santrifüj PBMCs şimdi yoğunluğu üzerinde gradyan orta katmanı görülebilir.
- Pasteur pipet hücreleri iki yeni 50 mL tüpler içine aktarmak için kullanın. PBS (tüpler doldurmak) iki kez yıkayın.
- 15 dk. atma süpernatant 350 x g, santrifüj kapasitesi ve PBS 3 mL resuspend.
- Tercih edilen bir yöntem kullanarak hücreleri saymak.
- 350 x g 5 dk. atmak için de hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi. Not: 1.8-3.2 isteğe bağlı adımlardır. Doğrudan 3.3 tutamaçlarından mümkündür.
- % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş fetal Sığır serum (FBS) hücrelerde resuspend ve aşağı cryo borular kullanarak uygun aliquots dondurma.
Not: DMSO hücrelere toksiktir. Hızlı hücreleri FBS/DMSO ile karışınca iş. Hücreler sıvı azot içinde saklı uzun süreli olabilir.
2. hücreleri çözme
- Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu hücrelerde çözülme.
Not: DMSO hücrelere toksiktir. Hızlı DMSO maruz sınırlamak için çalışırlar. - Bir kez 10 mL soğuk Roswell Park Memorial Enstitüsü Orta (RPMI 1640 tamamlayıcı GlutaMAX ile bkz: Malzemeler tablo) içeren hücreleri yıkayın.
- 5 dakika süreyle 300 x g, santrifüj süpernatant atmak.
- Sodyum pyruvate, MEM esansiyel olmayan amino asitler ve penisilin/streptomisin (1 x seyreltme talimatlara göre ekledi) ve % 10 RPMI 1640 orta hücrelerde resuspend FBS. Hücreleri bir küçük hücreli kültür şişesi aktarmak ve bir kuluçka %5 CO2, 37 ° C hücrelere ayarlamak izin vermek 1 saat bırakın.
3. hücre hazırlanması
- Tercih edilen bir yöntem kullanarak canlı hücreleri saymak.
- Hücreleri bir 50 mL tüp aktarmak ve 5 dakika süreyle 300 x g, santrifüj süpernatant atın.
- %1 ile desteklenmiş RPMI 1640 Orta (adım 2.2) hücrelerde resuspend FBS en fazla 50 x 106 hücre/ml.
- Hücre süspansiyon gerekli miktarda 96 iyi V-alt plaka wells aktarın.
Not: Kuyu sayısı koşulları test edilecek sayısına karşılık gelir. Bir stimülasyon zamanlı kurs için örnekleri tek bir kuyudan çizilir. Zaman noktası + 50 µL ölü biriminin başına 50 µL örnek hesaplayın. Örnekleri için tazminat denetimleri (bir günahı örnek + barkod boya başına bir örnek) kaydedin. - Transfer 96 iyi plaka önceden ısıtılmış 37 ° C su banyosu. Hücreler için 10 dk bekletin.
4. stimülasyon ve hücreleri fiksasyonu
Not: 4-8 (Yani, değil steril) laboratuvar bankta adımları.
Dikkat: Arabellek düzeltmek ana madde ben olduğunu zehirli paraformaldehyde (solunum yolu ve deri temas). Özenle hallederim.
- 96 iyi V-alt plaka düzeltmek arabelleği 60 µL ile hazırlamak ben iyi örnek başına ücret. 37 ° C su banyosu içinde bırakın.
Not: Hücreler: Düzeltme arabellek 1:1 olmalıdır. 37 ° C'de buharlaşma için izin vermek için düzeltme arabellek başlangıçta bolluk içinde olur. - İsteğe bağlı olarak, uyuşturucu stimülasyon önce hücrelerle tedavi.
- 50 µL denetimi örneğini düzeltme plakasına aktarın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
- İsteğe bağlı olarak, stimülasyon zamanlı kurs 10 µg/mL anti-IgM hücrelere ekleyerek başlayın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
- 50 µL örnek her zaman-nokta düzeltme plakasına aktarın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
Not: Anti-indüklenen genellikle erken başlatılır sinyal IgM (dakika). - Son örnek eklendikten sonra 10 dk 37 ° C'de düzeltme plaka bırakın.
5. floresan cep Barkod (FCB)
Not: Barkodlama reaktifler bir listesi için bkz. Tablo 1 .
- Sabit hücreleri 3 yıkama x PBS (kuyuları doldurmak) ile.
- 5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.
- 96 iyi V-alt plaka barkodlama reaktifleri ile hazırlayın. Damlalıklı 5 µL her barkod reaktif boyama matris, Örneğin, Şekil1B takip tüm örneklerini leke için gerekli kombinasyon kuyuda başına. Her örnek farklı tedarikçilerden konsantrasyonları benzersiz bir kombinasyonu gerekir.
- PBS ve aktarma barkodlama plaka 190 µL hücrelerde resuspend. İyice karıştırın.
Not: Her barkod reaktif için kullanılan en yüksek son konsantrasyon ile bir tazminat örnek leke ve bir günahı örnek kaydedin. - Hücre içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 20 dakika bırakın.
- Lekeli hücreleri 2 yıkama ile akış yıkama (PBS, %1 FBS, %0,09 sodyum azid) x (kuyuları dolgu).
- 5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.
- Akış yıkama 190 µL hücrelere ekleme ve bir 15 mL tüp barkodlu örneklerinde birleştirir. Her tazminat ayrı 1.7 mL tüp aktaracağım.
- 5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.
6. hücre Permeabilization hücre içi antijen boyama için
Uyarı: Toksik (solunum yolu ve deri temas) ve yanıcı olan metanol perma arabellek III ana madde olduğunu. Özenle hallederim.
- Perm arabellek III 2 mL 15 mL tüp aktarın. Yani üye olmakla kullanım buz gibi-20 ° C'de bırakın.
Not: Perm arabellek-20 ° C'de deneme başından itibaren bırakılabilir. - Barkodlu hücre nüfus (15 mL tüp içinde) buz gibi perma arabelleğe 1,5 mL ve 100 µL her tazminat denetimi (1.7 mL tüpler) drop-wise vortexing hücreleri birlikte yığın önlemek için ekleyin.
- Hücreleri doğrudan-80 ° C'ye aktarma En az 30 dk için bırakın.
Not: Bu noktada deneme duraklatmak için doğaldır. Perm arabellek hücrelerde-80 ° C'de saklı uzun vadeli olabilir
7. antikor boyama
Not: Malzemeler tablo bildirilen Fosfo-özel antikorlar bir listesi için bkz:.
- Hücreleri-80 ° C'den bir buz kutusuna aktarın.
- 3 x akışı yıkama ile yıkayın.
Not: Hücre Pelet görmek için fazla akışı yıkama eklemek önemlidir, Örneğin, her tazminat denetim akışı yıkama barkodlu hücre nüfus ve 1 mL 3 mL ekleyin. - 4 ° C'de 5 min için 500 x g, santrifüj Süpernatant atmak.
- Barkodlu hücre nüfus Fosfo-antikor leke hücre süspansiyon, 25 µL sağlayan akış yıkama hacmi resuspend. Tazminat denetim akışı yıkama 200 µL içinde resuspend.
- Antikorlar 96 iyi V-alt plaka içinde boyama için hazırlayın. Son hacim 50 µL/iyi olacak. İyi 10 µL, yüzey marker son hacmi 15 µL ve hücre süspansiyon, 25 µL yıkamaya akışı içinde seyreltilmiş son hacmi yıkamaya akışı içinde seyreltilmiş Fosfo özgü antikor ekleyin.
Not: Antikor dilutions deneme önce titre. İzotip kontrol içerir. - Karanlık oda sıcaklığında 30 dk için hücreleri bırakın.
- Lekeli hücreleri 2 yıkama x akışı yıkama (kuyuları doldurmak) ile.
- 5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.
- Akış yıkama 150 µL hücrelerde resuspend.
8. tazminat denetimleri hazırlanması
- Tazminat denetimleri antikor boyama paralel olarak antikor Birleşik fluorochromes için hazır olun. Tazminat boncuk göre için satıcının yönergelerini kullanın.
9. Akış Sitometresi Analizi
Not: Deneme bir akış sitometresi bir yüksek üretilen iş örnekleyici (HTS) ile çalıştırılabilir.
- Photomultiplier tüp (PMT) gerilim günahı kontrol ile en iyi duruma getirme.
- Tazminat denetimleri çalıştırmak ve tazminat matris hesaplayın.
- Çalışma örnekleri. Olay oranı uygun olarak araç özellikleri olmalıdır.
10. geçişi strateji ve veri analizi
- Akış Sitometresi Analizi Yazılım deneme alma FCS dosyaları FlowJo veya Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) gibi.
- Perdeleme strateji
- SSC-A karşı komplo tarafından lenfositler seçin FSC-A bir yoğunluk nokta arsa.
- Lenfosit görüntüleyip SSC-A karşı FSC -W. komplo tarafından gömlek seçin
- Tek hücre ve hücre yazın SSC-A karşı yüzey işaretçiyi komplo tarafından kapı görüntüler.
- Hücre türü nüfus Pasifik mavi karşı SSC-A yoğunluğu plan yaptığını görüntülemek ve onların Pasifik yoğunluğu boyama mavi üzerinde dayalı farklı FCB nüfus seçin ( Şekil 1A' ya bakınız).
- Fosfo antikor kanal FCB kanal karşı veya bir heatmap olarak arsa (şekil 1Afosforilasyon olaylarını görüntülemek için'ya bakınız).
- Fosfo-sinyalleri Fosfo-sinyal karşı izotip kontrol MFI (medyan floresan yoğunluğu) ters hiperbolik sinüsü (arcsinh) kullanarak hesaplamak (bazal fosforilasyon, bkz: düzeyleri Şekil 1 d), ya da uyarılmış karşı unstimulated hücre popülasyonlarının (bkz. Şekil 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fosfo akış sitometresi Protokolü ana adımları Şekil 1A' gösterilmiştir. Sunulan örnekte CLL hücreleri ile dört dilutions, Pasifik mavi barkodlama reaktif lekeli. Üç boyutlu barkod Şekil 1Badımında gösterildiği gibi üç barkodlama boya, birleştirerek gerçekleştirilebilir. Bireysel örnekleri sonra sonraki her barkod reaktif karşı üzerinde SSC-A (Şekil 1 c) çoğunluğuna tarafından deconvoluted. Barkodlama reaktifler hakkında detaylı bilgi Tablo 1' de listelenmiştir.
Burada açıklanan yordamı izleyerek Fosfo-protein düzeyleri CLL hastalar ve normal denetimleri altında çeşitli koşulları3B hücrelerdeki karakterize. Her iki bazal ve stimülasyon kaynaklı fosforilasyon seviyeleri aşağı moleküllerinin B hücre reseptörü (BCR) analiz sinyal 20 ( Tablo reçetesi bildirilen Fosfo-özel antikorlar listesi için bakınız). Bazal Fosfo-protein düzeyleri normal denetimleri ortalaması göre 22 CLL hasta numuneleri eşleştirilmiş. Bu analiz gösterdi o STAT3 (pY705) upregulated (Şekil 1 d) CLL hücrelerdeki önemli ölçüde olduğunu. Kurucu STAT3 aktivasyonu diğer hematolojik maligniteler bildirdi ve direnç apoptosis9ile ilişkilidir.
Sinyal aberasyonları BCR yolu ile indüklenen tanımlamak için hücreleri ile anti-IgM 30 dakikaya kadar için teşvik. CLL unmutated IgVH durumu (UM-CLL) görüntü artmış duyarlılık anti-IgM stimülasyon10doğru ile hastaların hücreleri gösterilmiştir. Bu gerçekten de analiz proteinler çoğunluğu için gözlendi, ancak etkisi sadece AKT (pS473) için istatistiksel olarak anlamlı (Şekil 1E, UM-CLL karşı M CLL ve Normal). Anormal AKT (pS473) sinyal ters test için CLL hücreleri klinikte CLL hastalar11tedavisinde kullanılan PI3Kδ inhibitörü idelalisib maruz kaldılar. Şekil 1Fiçinde gösterildiği gibi AKT (pS473) düzeyleri önemli ölçüde idelalisib tedavi kinaz inhibitörleri CLL hücrelerinde anormal sinyal normalleştirmek için uygulanabilir olduğunu gösteren bir konsantrasyon bağımlı şekilde parçalara ayrılıp stoklandı.
Bu sonuçlar bu Fosfo göstermek akış sitometresi FCB ile birlikte sinyal analizi çalışmaları gerçekleştirmek, olası biyolojik tanımlamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.
Şekil 1. İş akışı ve uygulamalı Fosfo Akış Sitometresi Analizi örnekleri.
(A) ana adımları Fosfo akışı yordam resimli. Hücreleri ilk teşvik, sonra sabit ve permeabilization ve sonraki antikor boyama için bir tüp kombine önce FCB için tabi. Hücreleri üzerinde bir akış sitometresi çalıştırılır ve hücre popülasyonlarının veri çözümleme sırasında perdeleme tarafından deconvoluted. Sonuçları gösterildiği gibi çubuk grafikler veya heatmaps, olarak görüntülenmiştir. (B) üç boyutlu bir FCB Alexa Fluor 488 (üç dilutions), Pasifik mavi (dört dilutions) ve Pasifik Orange (üç dilutions) kullanarak matris boyama örneği. Bu matris birleştirme-in ilâ 36 örnekleri sağlar. (C) FCB hücre nüfus deconvoluted her FCB kanal karşı üzerinde Perdeleme SSC-A. Analiz yazılımı Gates'te kombinasyonu çözümleme için doğru nüfus oluşturur. (D) Unstimulated B hücreleri sağlıklı bağışçılardan (n = 25) ve CLL hastalar (n = 22) analiz için aşağıdaki yordamı(a)Fosfo akımını tabi tutuldu. Bazal floresan yoğunluğu sinyalleri IgGκ izotip denetimi göre arcsinh oranı olarak hesaplanmıştır. Sinyaller CLL B hücreleri de sonra normal denetimlerden B hücreleri sinyallere normalleştirilmiş. p < 0,01, hesaplanan tarafından unpaired bir iki örnek t-test. UM-CLL: CLL, M CLL IgVH unmutated: IgVH mutasyona uğramış CLL. Aynı renkteki sembolleri temsil hiyerarşik bir agglomerative kümesindeki 20 Fosfo-proteinler3düzeylerine göre gruplanmış hasta örnek. (E) B hücreleri, normal kontrollerinden (n = 10, ortalama + SEM) veya CLL hastalar (n = 11 [M-CLL] ve n = 8 [UM-CLL], ortalama + SEM) belirtilen zamanlı kurs için anti-IgM ile uyarılmış ve Fosfo akışı analize tabi. Floresan yoğunluğu sinyalleri unstimulated örnekleri göre ölçülen ve arcsinh oranı olarak gösterilir. p < 0,01 (Normal vs UM-CLL) ve ***p < 0,001 (M CLL vs UM-CLL), hesaplanan Holm-Sidak'ın düzeltme ile test çoklu karşılaştırma tarafından. UM-CLL: CLL, M CLL IgVH unmutated: IgVH mutasyona uğramış CLL. (F) CLL hücreleri DMSO veya anti-IgM stimülasyon 3 dk önce 20 dk için belirtildiği gibi idelalisib ile inkübe. Hücreleri sonra Fosfo akış protokolü takip işlendi. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001, çoklu karşılaştırma Holm-Sidak'ın düzeltme ile test göre hesaplanır. UM-CLL: CLL, M CLL IgVH unmutated: IgVH mutasyona uğramış CLL. (D) sembolü renk açıklaması için bkz:. (D-F)3değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Seri (hisse senedi çözüm ile başlayan) aşağıdaki gibi seyreltik | ||||||
| Barkodlama reaktif | Hisse senedi toplama | #1 | #2 | #3 | #4 | günahı |
| Alexa Fluor 488 | 10 mg/mL | 1:500 | 1:5 | x | ||
| Pasifik mavi | 10 mg/mL | 1: 2500 | 1:4 | 1:4 | 1:10 | |
| Pasifik turuncu | 2 mg/mL | 1:50 | 1:12 | 1:24 | ||
Tablo 1. Barkodlama reaktifler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fosfo akış sitometresi tek hücrelerdeki protein fosforilasyon düzeyleri ölçmek için güçlü bir tekniktir. Antikorlar ile boyama yöntemi kullanır beri Fosfo akış sitometresi göre antikor miktarı sınırlıdır. Ayrıca, güvenilir sonuçlar elde etmek için tüm antikor olmalı titre ve kullanmadan önce doğrulanmadı. Titrasyon Fosfo özgü antikorların için detaylı bir protokol oldu başka bir bölümünde12. Panel Tasarım sırasında sinyal-gürültü oranı göz önüne alınması önemlidir. Sunulan örnekte, tüm Fosfo-antikorlar Alexa Fluor 647 için Birleşik. Bu fluorophore kez düşük karşı ile örnekleri arasında en uygun diferansiyel Fosfo-protein yüksek seviyede sağlar. Ayrıca, Fosfo-proteinler için tek bir renk kullanarak diğer kanallar FCB ve yüzey marker boyama için ücretsiz kalır. Bu panel tasarım Fosfo kanal sığmayan azaltır. Aynı fluorophore Birleşik tüm Fosfo-antikor sahip olarak, veri analizi de Basitleştirilmiş.
Sunulan protokolünde fiksasyon ve hücrelerin permeabilization sonra tüm antikor stainings yapıldı. Ancak, yüzey marker boyama olumsuz fiksasyon ve permeabilization numaralı adımları denatürasyon yüzey antijeni veya artan ettiren13boyama nedeniyle etkilenebilir olduğunu akılda tutmak önemlidir. Kullanıcı bu nedenle ayrı bir dava için ayrı antikor reaktivitesi sınamanız gerekir. Uyumlu klonlar kaynaklardaki de farklı fiksasyon/permeabilization yordamlar bakış ve https://www.cytobank.org/facselect/, çeşitli antikorlar ile onların uyumluluk gibi yararlı olabilir.
Protein fosforilasyon veya de-fosforilasyon dışsal ve içsel cues yanıt olarak oluşan geçici bir değişiklik olduğunu. Fosforilasyon desenleri karşılaştırırken, bu nedenle benzer koşullar altında deneyler yapılmaktadır çok önemlidir. Ne zaman sinyal primer hücre içinde kan, sonucu etkileyen zaman faktörler eğitim ne kadar izole hücreler deneme başlanmasından önce dinlenmiş ve çizim kan, saklama koşulları sonra geçti. Korunmuş cryo hücreleri ve kan taze izole hücreleri sinyal desen karşılaştırırken, sadece çok küçük farklılıklar (Skånland, yayınlanmamış) gözlenen. Ancak, hala normal hücrelerin biobanked hasta numuneleri, örneğin okurken bir denetim olarak korunmuş cryo kullanmak için tavsiye edilir. Fosfo gerçekleştirmek için en uygun koşulları akış sitometresi deneyler ve dış faktörlerin etkisini bireysel kullanıcı tarafından test edilmiştir.
Burada, bir protokol süspansiyon hücre Fosfo akışı analizi için sunulmaktadır. İletişim kuralı diğer hücre tipleri için adapte edilebilir, ama süspansiyon tarafından Akış Sitometresi Analizi için tek hücreler olarak hücrelerdir bir önkoşuldur. Bunu başarmak için yordam korumak ve etkilemez, fosforilasyon desenleri hassas olması gerekir. Örnekler nerede yapışık hücreleri kodlamayla yemek soğuk trypsination12,14tarafından müstakil veya oldukça mikroküreler15üzerinde yetiştirilen mevcut. O sağlam doku üzerinde Fosfo akış sitometresi gelince, akciğer tümörleri nerede tek hücre hücre süzgeç16ile bir tüp ile hücreleri geçirerek elde edildi üzerinde bir rapor yok. Son zamanlarda, Fosfo akış sitometresi Fosfo-proteinler epitel doku17 ve kolorektal kanser çalışma için hücre içi sinyal tek epitel hücrelerinde doku (TEŞRİH) için yükünün olarak adlandırdığı yeni bir yaklaşım ile kombine edildi 18.
Deconvolution deneme sonunda örnekleri ayrı FCB nüfus üzerinde dayanır bu yana FCB protokolündeki kritik bir adımdır. Bunu elde etmek için hücreleri homojen lekeli gerekmektedir. Bu nedenle hücreleri eklenebilir bir tedarikçidir tabak hazırlamak önemlidir. Reaktifleri hücrelere ekleme düzensiz boyama ve karışık nüfus çoğunluğuna tarafından deconvoluted olamaz neden olur. Boyama yoğunluğu hücre tipi olarak deneme yapılmadan önce barkod dilutions bir testi çalıştırmak için önerilir bağımlı.
Protein dizi ve ters faz protein dizi (RPPA) gibi ek antikor tabanlı teknikleri için miktar Fosfo-protein düzeyleri bir ortamda yüksek üretilen iş bir şekilde uygulanabilir. Ancak, Fosfo akış sitometresi bazı nitelikleri bu yöntem diğerlerinden ayırt. Fosfo akış sitometresi önemli bir avantajı bu tek hücre profil oluşturma için sağlanmıştır. Arası hücresel heterojenite farklı hücresel alt kümeleri için yüzey işaretleri dahil olmak üzere tarafından tespit edilebilir. FCB ile birlikte ayrıca için çeşitli koşullar aynı deneysel çalıştırmak analiz sağlar. Bu özellikler Fosfo akış sitometresi gelecekteki uygulamalar için çekici bir yöntemi biyomarker bulma ve hassas tıp19' olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.
Acknowledgments
Bu eser Profesör Kjetil Taskén laboratuarda yapılmıştır ve Norveç Kanser Derneği ve Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen tarafından desteklenmiştir. Johannes Landskron ve Marianne Enger el yazması eleştirel okuma için kabul vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
References
- Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
- Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
- Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478 (2012).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
- Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
- Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61 (2017).
- Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
- Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
- Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
- Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835 (2015).
- Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11 (2016).
- Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).
