Aqui nós apresentamos um biossensor baseado em luciferase para quantificar a atividade da quinase do supressor do tumor grande (LATS)-uma quinase central no Hippo via de sinalização. Este biosensor tem diversas aplicações na pesquisa básica e translacional, visa investigar hipopótamo via reguladores in vitro e em vivo.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Monitoramento de hipopótamo, sinalizando o Pathway atividade usando um Tumor grande baseado em Luciferase supressor (LATS) Biosensor
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O hipopótamo via de sinalização é um regulador conservado do tamanho do órgão e tem papéis importantes na biologia do desenvolvimento e câncer. Devido a desafios técnicos, continua a ser difícil avaliar a atividade desta via de sinalização e interpretá-lo dentro de um contexto biológico. A literatura existente sobre o supressor de tumor grande (LATS) se baseia em métodos qualitativos e não podem facilmente ser escalado-acima para a seleção. Recentemente, temos desenvolvido um biossensor baseado em bioluminescência para monitorar a atividade da quinase do LATS-a principal componente da cascata da quinase hipopótamo. Aqui, descrevemos procedimentos de como este biosensor LATS (LATS-BS) pode ser usado para caracterizar reguladores de caminho de hipopótamo. Primeiro, nós fornecemos um protocolo detalhado para investigar o efeito de um candidato de proteína Blumental (por exemplo, VEGFR2) na atividade LATS usando o LATS-BS. Em seguida, mostramos como o LATS-BS pode ser usado para uma tela de inibidor de quinase em pequena escala. Este protocolo viável pode ser dimensionado-up para executar telas maiores, o que sem dúvida irão identificar novos reguladores da via de hipopótamo.
Introdução
O hipopótamo sinalização via foi identificada em Drosophila como um romance regulador do crescimento celular e animal tamanho1,2. Desde a sua descoberta inicial, evidências convincentemente demonstrou que que o percurso de hipopótamo tem um papel crítico no desenvolvimento (por exemplo, desenvolvimento embrionário precoce, controle de tamanho de órgão e tridimensional [3D] morfologia), (tumorigênese por exemplo, desenvolvimento de tumor, metástase, angiogênese, evasão imune, instabilidade genômica, resposta ao estresse e resistência às drogas) e a homeostase do tecido (por exempl....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. a investigação de um regulador putativo de hipopótamo sinalização usando o LATS-BS
-
Chapeamento e transfecção de células
- Preparação de cultura celular
- Aquecer 1X PBS, DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e 0,25% do trypsin-EDTA a 37 ° C em banho-maria por aproximadamente 30 min.
- Limpe cuidadosamente um gabinete de segurança biológica com etanol a 70%.
- Coloque pratos de cultura de tecidos, pipetas Pasteur, pipetas e pontas de pipetas ao subúrbio de cultura de tecidos, conforme necessário.
- Tiro de 1X PBS, a mídia e do trypsin-EDTA do banho, limpe-os com etanol a 70% e col....
- Preparação de cultura celular
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O LATS-BS foi cotransfected com genes diferentes para avaliar seu efeito sobre a atividade de LATS (Figura 3). Neste experimento, Renilla foi usado como um controle interno. A expressão transiente de YAP-5SA, uma forma ativa constitutiva de YAP, causas de aumento dos níveis de YAP alvos transcricionais e um subsequente aumento na atividade da quinase LATS através de um percurso de gabarito estabelecido25. MST, o ativador do mo.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Enquanto via o hipopótamo tem um papel crítico em diversos processos biológicos, e desregulação da via hipopótamo leva ao câncer6, como o caminho de hipopótamo é regulamentado em resposta a vários estímulos não é completamente compreendido. Além disso, não houve nenhum sistema em tempo real e quantitativo para avaliar a atividade dos componentes principais do hipopótamo. Recentemente, temos desenvolvido e validado um romance biosensor para medir a atividade da quinase LATS no hipopótamo caminho
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto canadense de pesquisas saúde (CIHR #119325, 148629) e a Fundação Canadense de câncer da mama (CBCF) para XY. TA é suportado pela bolsa de pós-graduação de Canadá Vanier e a bolsa de pós-graduação de Internacional de Ontário. HJJVR é suportado por uma rainha Elizabeth II bolsa pós-graduação em ciência e tecnologia.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tripsina-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0,25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM com alta glicose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Tampão de lise passiva | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Sistema de Ensaio de Luciferase | Promega | E2940 | Kit de 100 ml |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Leitor de tubo único luminometer |
| GloMax® Navegador com injetores duplos | Promega | GM2010 | luminômetro leitor de placas de 96 poços |
Referências
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
