Artigo de método

Geração de culturas de tecido de pulmão humano de 3D (3D-CTIs) para modelagem de doença

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DOI:

10.3791/58437

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12 de fevereiro de 2019

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1Comprehensive Pneumology Center, Ludwig-Maximilians-Universität and Helmholtz Zentrum Munich, 2German Center of Lung Research (DZL), 3Translational Lung Research and CPC-M bioArchive, Helmholtz Zentrum München, Comprehensive Pneumology Center Munich DZL/CPC-M, 4Department of Experimental Medical Science, Lung Bioengineering and Regeneration, Lund University, 5Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University, 6Stem Cell Centre, Lund University, 7Asklepios Fachkliniken Munich-Gauting, 8Department of Medicine, Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação de fatias de cheias de agarose humano pulmão de precisão de corte de tecido ressecado de pacientes que são adequados para a geração de culturas de tecido de pulmão 3D para doenças de pulmão humano modelo em estudos biológicos e biomédicos.

Resumo

Tradução do romance descobertas a doença humana é limitada pela disponibilidade de modelos baseados em tecidos humanos da doença. Pulmão de precisão de corte fatias (PCLS) utilizado como culturas de tecido de pulmão 3D (3D-CTIs) representam um elegante e modelo de cultura de células 3D biologicamente altamente relevantes, que se assemelham a altamente tecido no local devido à sua complexidade, biomecânica e molecular composição. Corte o tecido é aplicado extensamente em vários modelos animais. 3D-CTIs derivados PCLS humana podem ser usados para analisar as respostas a novos medicamentos, o que mais podem ajudar a compreender melhor os mecanismos e efeitos funcionais de drogas em tecidos humanos. A preparação de PCLS de amostras de tecido pulmonar cirurgicamente ressecado de pacientes, que experimentaram a lobectomia pulmonar, aumenta a acessibilidade dos doentes e tecido de natureza. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a geração de PCLS humana do tecido pulmonar de pacientes cirurgicamente ressecado macio-elástica. Agarose foi introduzido no espaço de lavado broncoalveolar a resectates, assim preservando a estrutura pulmonar e aumento da rigidez do tecido, que é crucial para fatiar subsequentes. 500 µm de espessura foram preparadas a partir do bloco de tecido com um vibratome. Socos de biópsia retirados PCLS garantir comparável tecido tamanhos de amostra e aumentam ainda mais a quantidade de amostras de tecido. As culturas de tecido de pulmão gerado pode ser aplicadas em uma variedade de estudos em biologia de pulmão humano, incluindo a fisiopatologia e mecanismos de doenças diferentes, tais como processos fibróticos em seus níveis de celulares melhores no (sub-). O maior benefício do modelo ex vivo de 3D-LTC é sua representação perto do pulmão humano in situ em relação a arquitetura do tecido 3D, diversidade de tipo de célula e anatomia do pulmão, bem como o potencial para a avaliação do tecido de pacientes individuais, que é relevante para continuar a desenvolver novas estratégias para a medicina de precisão.

Introdução

Doenças pulmonares crônicas e agudas são das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo1. Para pacientes com doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva (DPOC)2, asma grave3, câncer de pulmão4 e de doenças pulmonares parenquimatosas difusas5, terapias curativas atualmente não estão disponíveis. Embora estudos em modelos animais de doenças pulmonares aprofundaram a compreensão da doença pathomechanisms6 e conduziram à identificação de potenciais novos alvos terapêuticos7,8,9, Estes modelos apresentam diferenças biológicas e fisiológicas relevantes quando comparado com os humanos10. Para superar estas discrepâncias entre biologia murino e humana, bem como a anatomia, humana ex vivo cultura do tecido de pulmão 3D (3D-LTC) sistemas são utilizados em diversas áreas de investigação biomédica. Estes sistemas de cultura 3D-LTC baseiam-se em fatias de precisão de corte de pulmão (combustível). A geração de PCLS ex vivo permite a análise de uma terceira dimensionalidade espacial, que permite a investigação das relações espaciais e funcionais de células em toda alvéolos e vias aéreas11, bem como o interstício, vascularização e mesotélio. Notavelmente, PCLS ex vivo modelos são pluricelulares, significando que eles contêm células mais funcionais dos pulmões no local, representando assim pròxima ambiente biológico nativo das células e assim superar o limitado célula-célula e interação célula-matriz em 2D mais abordagens de cultura de células. Até agora, ex vivo PCLS murino foram usadas para modelar doenças pulmonares, como a DPOC12, pulmão fibrose13, câncer de pulmão14, infecção viral15,16, de displasia broncopulmonar17, e asma,18. No entanto, uma proporção considerável de terapias de droga romance em doenças de pulmão humano que foram investigadas em ensaios clínicos não traduzir para a clínica devido à sua falta de eficácia ou segurança, assumingly devido a ainda consideráveis diferenças entre humanos e murino biologia e doença19,20,21.

Ao longo de vários anos, PCLS humanas têm sido largamente utilizados para avaliar a toxicidade pulmonar de produtos químicos e drogas. Apenas recentemente, tecido pulmonar humano tem sido utilizado em pacientes com DPOC22,23, asma24e de fibrose pulmonar25, para prosseguir estudos fisiopatológicos e farmacológicos. Usando o material ressecado órgão doente e gerando PCLS, um pode recapitular características das principais doenças em um tecido complexo 3D ambiente22 representando e mantendo a maioria da diversidade celular nativa do órgão. Além disso, mostrou-se tecido doente, aplicado em uma variedade de configurações experimentais para imitar a doença, como alterações no fígado, intestino e rim26,,27,28,29.

No entanto, o processamento do tecido pulmonar permanece desafiador por várias razões. Ao contrário de tecido sólido, parênquima pulmonar nativa tende a entrar em colapso sem ventilação e exibe baixa rigidez do tecido. Essas propriedades impedem o corte do tecido. Assim, o enchimento de vias aéreas e o espaço alveolar com baixo ponto de fusão ponto de agarose preserva a estrutura do pulmão nativo e fornece a rigidez necessária para precisão de corte, corte de murino e humano pulmões30. Resectates de pulmão humano doados para fins de pesquisa são por sua natureza anatomicamente, geneticamente e fisiologicamente altamente diversificada, assim, muitas vezes apresentando uma alta variabilidade inter paciente ao realizar experimentos25. Em contraste com o lobo inteiro ou todo pulmão explantes, amostras de pulmão ressecadas por meio de cirurgia torácica não necessariamente seguir os segmentos anatômicos e, portanto, exigem preparação especial. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo detalhado e otimizado para a geração de PCLS humana do tecido pulmonar ressecado e sua subsequente cultivo e uso experimental para doença pulmonar de modelo.

Protocolo

A utilização de tecido humano foi aprovada pelo Comitê de ética da Universidade Ludwig-Maximillian [Munique (número do projeto 455-12)]. Ressecções pulmonares livre de tumor humano foram fornecidas pela Asklepios Biobank para doenças pulmonares (Gauting, Alemanha, projeto n º 333-10).

Nota: Todos os procedimentos de produção de PCLS humana (Figura 1) são feitos sob uma capa de estéril de fluxo laminar.

1. preparação de instrumentos e materiais

  1. Prepare todos os materiais para a inflação do tecido pulmonar com agarose conforme descrito abaixo.
    1. Preparar o meio de cultivo: modificado águia médio (DMEM) F-12 de Dulbecco, suplementada com L-glutamina, HEPES, 10.000 IE penicilina, estreptomicina 10.000 do IE e 0,1% (v/v) de soro fetal bovino.
      Nota: Médio é usado a 37 ° C.
    2. Prepare uma bandeja de metal estéril coberta com papel absorvente. Coloque numa placa de cultura de pilha de estéril 15 cm sobre a bandeja.
    3. Encha o prato de cultura celular com o 15 mL de meio de cultivo.
    4. Prepare uma solução de agarose de 3% (p/v), dissolvendo a quantidade adequada de baixo ponto de fusão ponto de agarose em um mínimo de 30 mL de meio de cultivo.
    5. Aqueça a solução em um microondas até ferver. Legal a solução de agarose a 42 ° C em banho-maria. Manter a solução de agarose líquido armazenada em banho-maria.
    6. Prepare-se diversos tubos cónicos 50 mL enchidos com o líquido do agarose.

2. tecido pulmonar ressecado

  1. Loja fresca tumor tecido de pulmão livre de Lobectomia resectates imediatamente após a ressecção em meio DMEM F-12 a 4 ° C até o passo 3.
  2. Não exceda o tempo de isquemia fria de 4-8 h antes da transformação.

3. inspeção e seleção do tecido ressecado antes do enchimento do Agarose

  1. Levante o tecido do meio com uma pinça. Para evitar danos aos tecidos, especialmente à pleura, lidar com o tecido com uma pinça em vias aéreas apenas.
  2. Marca a qualidade do tecido pelos critérios da pulmão Agarose enchimento pontuação definida no quadro 1.
  3. Siga para o passo 4 se a qualidade do tecido é pontuada acima ou igual a 72. Se a qualidade do tecido é pontuada abaixo de 60, não continuar mais com enchimento de agarose.
    Nota: Se a pontuação de tecido é entre 60 e 68, o preenchimento de agarose e tecido corte ainda podem produzir resultados razoáveis, e uma decisão final para o prolongamento da experiência tem que ser feita caso a caso. No entanto, o tecido pulmonar que não cumprem os requisitos acima mencionados, principalmente falha no enchimento de agarose.

4. pulmão inflação de tecido de enchimento de Agarose

  1. Levante o tecido do meio de armazenamento e drenar o excesso de mídia de tecido. Transferi o tecido pulmonar para a placa de cultura de 15cm preparada em 1.1.2.
  2. Encha uma seringa de 30 mL com a agarose ponto baixo ponto de fusão de 1.1.3.
  3. Preparar um cateter venoso periférico, removendo o obturador e anexá-lo a uma seringa de 30 mL
  4. Identificar um brônquio (0.5-3 mm de diâmetro) no tecido que é ventilar uma seção intacta do tecido (ver Figura 2).
  5. Inserir a cânula do brônquio selecionado (0.5-3 mm de diâmetro).
  6. Empurre suavemente a cânula suavemente para a frente, na medida do possível.
  7. Selo do brônquio à volta da cânula comprimindo a parede brônquica à volta da cânula com fórceps, idealmente de aperto qualquer artéria pulmonar adjacente ao mesmo tempo.
  8. Occlude outras vias aéreas adicionais com uma pinça cirúrgica para prevenir vazamento através destas vias aéreas de agarose.
  9. Levante o tecido com a pinça do prato a cultura.
  10. Manualmente, despeje o agarose não mais rápido do que 0,3 mL/s com a seringa. A velocidade de enchimento de agarose pode variar entre aproximadamente 0,05 e 0,3 mL/s devido à resistência heterogênea de vias aéreas e/ou atelectasias.
  11. Se for observada a alta resistência ao enchimento ou agarose vazando do tecido, repetir todo o processo com um brônquio diferente da etapa 4.4. Execute a solução de problemas, conforme descrito abaixo.
    Nota: O grau de enchimento de agarose é altamente dependente da posição do cateter no tecido e a penetração profunda dos resultados de cateter em agarose enchimento do cone pequeno como regiões (*) do tecido pulmonar (Figura 2).
    1. Em caso de alta resistência, Tente posicionar o cateter leva ao enchimento adequado da maioria das regiões do tecido (#) (Figura 2D).
    2. Como plugues de início agarose solidificado em brônquios proximais ou outras vias aéreas obstruções (seta) podem levar a um preenchimento incompleto do tecido (Figura 2E), não force a agarose enchimento como isto pode levar a defeitos na área preenchida, mas não em um enchimento de as peças de tecido obstruído.
    3. Se a árvore respiratória, derivada do brônquio canulado é danificada durante a ressecção e o agarose enchimento resulta em uma constante fuga do líquido agarose (seta na Figura 2F), introduza o cateter em uma parte mais periférica do sistema de vias aéreas Preencha pelo menos uma pequena parte do tecido (*) (Figura 2). Além disso, sele a via aérea periférica danificada com uma pinça cirúrgica (seta) (Figura 2 H).
  12. Aplica a agarose até que o tecido pulmonar é preenchido completamente. Não infle excessivamente o tecido pois isso pode causar danos irreversíveis para a estrutura do tecido e suas células.
  13. Braçadeira do brônquio que foi usado para o enchimento imediatamente. Remova a cânula antes da fixação.
  14. Incube o tecido do meio de cultura a 4 ° C por 30 min garantir a solidificação da agarose.
  15. Se o tecido ressecado tem várias entradas brônquicas, repita o passo 4.2 a 4.13 até que todas as partes do tecido são preenchidas com agarose.
  16. Armazene as seções de tecido de pulmão cheio de agarose em meio frio de 4 ° C até cortar.

5. precisão de corte de pulmão fatiar

  1. Identifica regiões no tecido pulmonar que solidamente são preenchidas com o agarose. Regiões solidamente preenchidas não entrará em colapso quando são pressionadas suavemente com uma pinça contra o fundo do prato de cultura celular.
    1. Impostos especiais de consumo um bloco de3 de 1 a 1,5 cm das regiões descritas no ponto 5.1, Considerando que um dos lados ainda deve ser coberto com a pleura.
  2. Anexe cada bloco individual de tecido com o lado pleural contactar o titular do vibratome por meio de uma cola de cianoacrilato.
    Nota: A pleura é ligeiramente elástica e, portanto, impede o corte com a lâmina de vibratome. Colocado sobre o suporte do tecido, a pleura não interferirá com o corte e, importante, forma uma barreira natural entre a cola de cianoacrilato e parênquima do tecido, permitindo a difusão mínima da cola.
  3. Cortar o tecido pulmonar com o vibratome com as seguintes configurações: espessura: 500 µm, frequência: 100 Hz, amplitude da faca: 1.2 mm, velocidade da lâmina de 3-12 µm/s, que depende da rigidez do tecido. Reduza a velocidade de protrusão da lâmina se a fatia não é cortada corretamente, ou se o bloco de tecido em si começa a vibrar.
  4. Delicadamente, transferi a fatia levantando-a com o fórceps da bandeja de vibratome em um poço de uma placa de 12 preenchido com meio de cultivo. Finalmente, Incube as fatias de pulmão na incubadora, em condições de cultura celular padrão.
  5. Batente de corte quando são deixados de 2 a 3 mm do bloco de tecido fatiado desde que a cola de cianoacrilato pode ter comprometido a integridade do tecido desta região.

6. geração de PCLS socos

  1. Transfira as fatias do pulmão de um único poço para um prato vazio de 10 cm.
  2. Coloque um perfurador de biópsia de 4mm ortogonalmente à superfície superior de um combustível e começam a se mover o socador em rotações no sentido horário e anti-horário.
  3. Encha o meio de cultura celular nos poços de uma placa de 96 poços. Levante os tecido socos com fórceps e transferir os socos em poços de uma placa de 96 poços. Finalmente, incube os socos de pulmão submergidos no meio preparado em 1.1.1. uma incubadora de cultura celular em condições padrão (oxigênio 21% (v/v), umidade de dióxido de carbono e 95% 5% (v/v), a 37 ° C).

7. cultura de tecidos e de colheita de amostra

  1. Cultura do combustível e socos durante a noite em uma incubadora, em condições de cultura celular padrão.
  2. Cultura PCLS e socos sob condição de contorno para um máximo de 120 horas após sua geração para assegurar a função e viabilidade celular.
  3. Para a colheita da proteína, bem como RNA, lavar PCLS e socos três vezes em salina tamponada fosfato (PBS), transferi-los para cryovials e snap-congelamento em nitrogênio líquido.
  4. Sobrenadante médio de amostra de PCLS culta socos para a análise das proteínas secretadas.
    1. Para análise histológica, lave o PCLS e socos três vezes com PBS e corrigi-los com paraformaldeído 4% incubando durante 30 min a 37 ° C. Finalmente, armazene o combustível em PBS a 4 ° C para manchar ainda mais a jusante.

Resultados

Geração de motores
A geração de combustível pode ser separada em quatro etapas essenciais: ressecção do tecido pulmonar cirúrgica, enchimento de agarose, baseada em vibratome PCLS geração e cultura de PCLS. O tecido de pulmão ressecado é preenchido com baixo ponto de fusão ponto de agarose, que adiciona a rigidez necessária para cortar o tecido do pulmão e preserva a arquitetura e a estrutura do pulmão nativo. Digno de nota, PCLS geração é muito demorada, assim frequentemente armazenamento durante a noite, o tecido de pulmão cheio em meio DMEM F-12 pode ser incluído como uma etapa adicional e geração de PCLS é iniciada no dia seguinte. Dependendo a seguinte configuração experimental, PCLS gerado pode ser incubadas durante a noite, em meio de cultura de célula padrão contendo 0,1% (p/v) de soro fetal bovino, antes que as condições experimentais sejam aplicadas. 3D-CTIs foram viáveis e exibiu a funcionalidade celular (tais como a secreção de proteína surfactante) por até 120 h22 nas condições de cultura descritas neste protocolo (Figura 1) e pode ser otimizado em cima mais melhoria disso.

Enchimento de agarose
Para o enchimento de agarose do tecido, uma cânula de um cateter venoso periférico com um diâmetro de 1,3 mm anexado para a seringa cheia de agarose foi inserida um brônquio na superfície do tecido corte (Figura 2A). Brônquios são frequentemente localizados perto de uma artéria pulmonar. Enquanto as artérias têm paredes mais finas e tendem a entrar em colapso, brônquios exibiram um lúmen bem visível. Dependendo da integridade do tecido, o cateter pode ser avançado através de várias gerações da árvore respiratória para a periferia do pulmão. O brônquio penetrou foi selado em torno da cânula, usando uma pinça (Figura 2B). Artéria pulmonar pode ser pinçada com a pinça, ao mesmo tempo. Posteriormente, o tecido é levantado e agarose líquido suavemente é instilada em vias aéreas.

Dependendo da posição do cateter, a maioria do tecido pode ser preenchida com líquido agarose (Figura 2D). Opcionalmente, cone como partes do tecido pulmonar, que reflectem o parênquima do pulmão ventilada pelo brônquio penetrou, pode enche o agarose (Figura 2). Em ambos os cenários, pode-se observar um padrão característico de regiões do tecido solidamente cheia: em primeiro lugar, uma parte importante do tecido é preenchida em cunhas (Figura 2D), ou em segundo lugar, menores salientes completamente redonda áreas de tecido enchido regiões aparecem ( Figura 2). Se obstruam a partes das vias aéreas devido a coágulos de agarose ou outras causas, partes do tecido não podem ser corretamente preenchidas com agarose. Assim, apenas partes do tecido podem ser aplicáveis para fatiar. Em caso de fugas durante o procedimento de enchimento agarose, partes da árvore respiratória preenchida podem ser perfuradas e enchimento do tecido pulmonar fica quase impossível, no entanto, soluções alternativas possíveis incluem o enchimento através de um brônquio mais periférico, um mais profundo penetração da cânula em vias aéreas distais (Figura 2), ou potencial de aperto da área de escapamento (Figura 2 H).

Corte de precisão de corte de pulmão
Blocos de tecido em um comprimento e largura de 1-1,5 cm foram extirpados da regiões de tecido, que estavam completamente cheios de agarose solidificado (Figura 3A-3B). Em seguida, os blocos de tecido individuais foram colados no suporte de tecido da vibratome (Figura 3). 500 µm de espessura PCLS foram gerados, Considerando que o bloco de tecido no vibratome estava avançando para a frente com velocidades entre 3-12 µm/s. (Figura 3D-3F). Finalmente, o combustível foram submersos em meio de cultura celular contendo 0,1% (p/v) de soro fetal bovino e cultivadas em condições de cultura celular padrão, como descrito passo 7.

Leituras de experimentais de 3D-LTC humano após 48h de cultivo
Uma mancha de representante da imunofluorescência, conforme descrito por Alsafadi et al.25, é mostrado na Figura 4A-4 C. Immunolabeling de fibronectina (vermelha) e do núcleo de células (DAPI, azul), permitido para a imagem latente da estrutura alveolar preservada o humano 3D-LTC ex vivo. Tratamento do ser humano PCLS socos com uma citocina profibrotic cocktail (incluindo transformadora fator de crescimento beta 1, fator de crescimento derivada de plaquetas AB, ácido lipophosphatidyl e fator de necrose tumoral alfa) para 48 h resultou em fibrose, como mudanças no ser humano 3D-CTIs. Por qPCR, observou-se uma significativa indução de fibrose relevantes da matriz extracelular componentes colágeno tipo 1 e fibronectina genes em 3D-LTC socos após tratamento com o coquetel de profibrotic (Figura 4). Além disso, os níveis de proteína de vimentina o marcador mesenquimal foram encontrados upregulated em 3 em cada 4 pacientes após o tratamento de socos 3D-LTC (Figura 4E).

Processo PCLS: ressecção tecidual, obturação de agarose, preparo de fatias, cultura; diagrama de linha do tempo.
Figura 1: fluxo de trabalho de geração de PCLS. As áreas livres de tumor de ressecções pulmonares são inspecionadas completamente devido à sua integridade do tecido. Se for marcado o tecido adequado para utilização posterior (a pontuação é explicado em detalhes na seção de material e métodos), em seguida é cheio de líquido agarose. Blocos de tecido cheios de agarose solidificado posteriormente são cortados com uma vibratome. Submersa em meio de cultura celular, 3D-LTC são cultivadas até 120 h após sua geração. Análises a jusante dos 3D-CTIs envolvem - ou RNA-expressão de proteínas, fluorescência de tecido vivo de imagem, bem como a mancha após a fixação do tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Configuração do experimento de perfusão pulmonar com diagrama de artéria e brônquio, demonstrando processo de injeção.
Figura 2: enchimento de tecido pulmonar com baixo ponto de fusão ponto agarose. O tecido pulmonar é canulado com um cateter venoso periférico, que é inserido em um brônquio adjacente à artéria pulmonar (Figura 2A). Pinças são usadas para fixar a cânula do brônquio e a braçadeira com a artéria pulmonar, para evitar vazamento de agarose o líquido. Agarose líquido a 42 ° C é derramado no tecido pulmonar com uma seringa de 30 mL (Figura 2B). Um posicionamento distal da cânula durante o enchimento resultará em pequenas áreas de tecido cheia (Figura 2), enquanto o posicionamento proximal garantirá o enchimento de um volume maior de tecido (Figura 2D). Qualquer obstrução das vias aéreas irá reduzir a quantidade de tecido o volume que pode ser preenchido (Figura 2E). Em caso de vazamento de agarose, uma cânula distal, posicionamento e/ou aperto do lado de escapamento permite agarose adequado enchimento do tecido pulmonar (Figura 2F-2 H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Processo de seccionamento de tecidos; diagrama, preparação de blocos de tecido, corte de micrótomo, configuração experimental.
Figura 3: corte de pulmão de precisão de corte. Um tecido de pulmão cheio de agarose com êxito é usado para retirar um pedaço de um bloco de tecido (1 x 1,5 cm x 1 cm) com um bisturi (Figura 3A). Em seguida o bloco do tecido excisado é colado ao titular do tecido, barra de escala indica 1 cm (Figura 3B). De preferência, o tecido é colado com sua superfície pleural à superfície do titular do tecido, como mostrado na Figura 3. 500 µm de espessura é cortadas pelo vibratome com uma safira faca em um ângulo de 10° - 15° em relação ao tecido (Figura 3D e 3E). O procedimento de corte resulta em fatias de 2-3 cm3 grande pulmão intacta, escala bar = 5 mm (Figura 3F). Além disso, usando um perfurador de biópsia, pequenos socos podem ser reproduzidos com um diâmetro de 4 mm podem ser gerados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de cultura celular; imunofluorescência (A-C), expressão gênica (D) e comparação dos níveis de proteína (E).
Figura 4: leituras experimentais de 3D-CTIs humanos após 48h de cultura. Um soco de 3D-LTC humana de 4 mm de diâmetro foi immunostained para fibronectina (em vermelho) e DAPI (em azul) (Figura 4A-4C). Escala de barras = 1.000 µm. a Figura 4 mostra a imagem mesclada. Análise de RNA de PCLS por RT-PCR quantitativo mostra um aumento significativo da expressão do gene COL1A1 e FN1 pelo cocktail de profibrotic25. Figura 4E exibe um immunoblot de toda proteína lysates do combustível, que foram tratados com um cocktail fibrótico25. Sondagem para vimentina e β-actina demonstrou uma expressão aumentada da proteína do marcador mesenquimal (vimentina) após tratamento com profibrotic fatores em amostras de pacientes 1, 3 e 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

CritérioPontos
A amostra de tecido tem superfície pleural intacta.20
A amostra de tecido parece macroscopicamente intacta, sem incisões, esmagamento, rupturas e distorções.20
A amostra de tecido contém pelo menos um brônquio com diâmetro > 1mm.20
A amostra de tecido não contém nenhuma ou apenas pouco eleva-se de sangue.4
A amostra de tecido foi armazenada totalmente no meio e não mostra nenhum sinal óbvio de atelectasias.4
A amostra de tecido foi ressecada nas últimas quatro horas.4
A amostra de tecido é maior do que 5cm em seu maior diâmetro.4
Pontuação na soma:

Tabela 1: pulmão Agarose enchimento Pontuação. O pulmão do Agarose enchimento Pontuação (LAFS) correlaciona-se com a taxa de sucesso para preencher uma ressecção de tecido com agarose para sua subsequente produção de PCLS baseada em vibratome. A pontuação resume todos os pontos de critérios que conheci pelo tecido. Um LAFS igual ou acima de 72 prevê agarose boa Propriedades de enchimento, uma pontuação abaixo de 60 prevê uma altamente provável falha de enchimento de agarose do tecido.

Discussão

O protocolo descrito neste manuscrito abrange a geração de combustível de resectates de tecido de pulmão humano enchendo-o com líquido agarose e subsequente vibratome corte. Geração de fatias de tecido foi demonstrada antes por um par de órgãos, como fígado e cérebro, Considerando que a rigidez inerente destes órgãos autorizados direta de corte sem nenhuma modificação do tecido. De nota, a correcta preparação inicial do tecido pulmonar é a etapa mais crucial na geração de combustível. Enchimento de agarose do pulmão é o método de escolha para estabilizar sua natureza macia e elástica e para garantir uma geração de PCLS homogénea e reprodutível. Grandes vias aéreas do tecido pulmonar ressecado são canuladas para fornecer acesso às pequenas vias aéreas, bem como o parênquima pulmonar intacto. A falta de uma pleura intacta, que agarose enchimento torna quase impossível, é das principais razões porque o tecido pulmonar principalmente não é utilizável para corte de pulmão. Prospectivamente, um sintético pleura originalmente projetado para realizar experiências funcionais em andaimes decellularized potencialmente poderia ser aplicada para alcançar o sucesso agarose enchimento de explantes que falta uma pleura intacta31. Ressecções, resultando em um pedaço de tecido de pulmão humano com pleura intacta são essenciais para a geração de blocos de tecido para cortar. Tecido ressecado é mais disponível devido ao tecido livre de tumor de resseção de câncer do que lobos totalmente intactos ou explantes todo-pulmão de pacientes submetidos a transplante de pulmão.

Comumente, dois sistemas são usados para produzir combustível: o Krumdieck tecido fatiador15 e micrótomos vibratórios (vibratomes). Segmentações de dados tecido geram fatias passando um bloco de tecido através de um vaso de metal, que corta o combustível a 90° no final deste navio. Vibratomes gerar PCLS movendo uma vibração faca horizontalmente sobre um bloco ancorado de tecido que está submersa em um banho médio refrigerado, que em comparação com o cortador de Krumdieck exerce menos força de cisalhamento sobre o tecido. Isso resulta em menos tratamento severo do tecido antes de cultivo. Por outro lado, a corte de vibratome é mais tempo e trabalho consumindo. Em nossas mãos, vibratome corte permitiu a produção de um máximo de 100 PCLS ou 500 PCLS socos em um dia, suficiente para estudos mais experimentais. PCLS pode ser cultivado de várias formas: (a) anexado ao Trans-poços, gerando assim uma interface líquido ar sistema (ALI), (b) como cultura órgão dinâmico (DOC), ou (c) submerso em meio de cultura celular em condições de cultura celular padrão. O cultivo em detalhes de PCLS foi descrito anteriormente22,23,25; no entanto, um padrão comum de condições de cultivo entre seu uso em vários laboratórios ao redor do mundo ainda está desaparecido. Em particular, o tempo de cultura pode ser crítico: como PCLS murino, uma perda de células do tipo alveolar positiva 2 SFTPC é observada após 144 h, mas não após 120 h22. Além disso, atividade metabólica parece permanecer estável em22 de murino e humano PCLS25 para 120 h.

Há um par de limitações técnicas para a geração de combustível: o número e o tamanho da resectates varia ao longo do tempo; a eficiência da agarose de enchimento, que depende da presença da pleura intacto dentro do tecido obtido, determina o sucesso final da geração PCLS; e destruição tecidual causada por alterações patológicas dentro do tecido pulmonar (doentes) obtidos pode interferir com a preparação de motores. Obstruções das vias aéreas e tecido fibrótico falta espaço alveolar intacto impedem com enchimento de agarose e, assim, fazem o corte do tecido fibrótico uma tarefa exigente. Enfisematoso tecidos como encontraram em doenças como DPOC ou deficiência de alfa-1-antitripsina não pode suportar a pressão de enchimento de agarose e irá resultar em ruptura dos alvéolos e artefatos arquitetônicos. Nesses casos, o uso de agarose baixa concentração, por exemplo,, 1% (p/v), pode ser útil para diminuir a pressão e a velocidade durante o enchimento de agarose. No geral, o estado de doença do tecido drasticamente pode limitar o uso do tecido para a geração de combustível. Todos estes parâmetros determinam a quantidade de combustível que pode ser gerado a partir do tecido pulmonar, e também a quantidade de tempo necessário para produzir o combustível. Outras limitações de PCLS são inconsistências entre as fatias de pulmão diferente em relação ao conteúdo de tamanho ou tecido, o que requer mais etapas de normalização para experimentos. Para superar isso, socos de biópsia das regiões similares da mesma fatia podem ser gerados. Este procedimento é capaz de reduzir a variabilidade de tecido e, como benefício adicional, aumentar o número de amostras de combustível que pode ser usado para experiências.

Em conclusão, culturas de tecido humano pulmão 3D de agarose preenchido PCLS fornecer um complexo modelo humano para estudar a fisiologia do pulmão e doenças. O protocolo fornece uma descrição detalhada da preparação de PCLS de tecido pulmonar ressecado e seu cultivo e além disso aborda desafios em agarose enchimento de ressecções de pulmão humano e como superá-las.

Divulgações

Todos os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Marisa Neumann para assistência técnica especializada. Todos os tecidos do pulmão foram gentilmente fornecidos pelo CPC-M Bio-arquivo. Este trabalho foi apoiado pelo centro alemão de bolsas de pesquisa do pulmão (DZL), a Helmholtz-gemeinschaft e CPC pesquisa escolar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Vibratome Hyrax V50Zeiss-Hyrax
65Zeiss-Vasofix
Braunü le 18 GB. Braun Melsungen AG4268130B
30 mL NORM-INJECTHenke Sass Wolf4830001000
Bisturis descartáveis protegidos, estéreisSwann-Morton
Loctite 406HenkelLOCTITE 406
Facas de diamante sintéticas de cristal único SapphireDelaware-
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamina + 15mM HEPESGibco31330-038
Penicilina EstreptomicinaGibco da Life Technologies15070-063
Processo especial de soro fetal bovino (Sera Plus)Pan BiotechP30-3702
Punção de Biópsia Descartávelpfm medical48401
96 Poços, Preto/Transparente, Placa Tratada para Cultura de Tecidos, Fundo Plano com Tampa,Falcão Estéril / Corning353219
Agarose, baixa temperatura de gelificaçãoSigmaA9414-100G

Referências

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
  2. Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
  3. Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
  4. Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
  5. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
  6. Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
  7. Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
  8. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
  9. Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
  10. Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
  11. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  12. Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
  13. Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
  14. Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73(2014).
  15. Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
  16. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  17. Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
  18. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
  19. Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  20. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  21. Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
  22. Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
  23. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
  24. Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
  25. Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
  26. Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
  27. Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
  28. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
  29. Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
  30. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  31. Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).

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