Artigo de método

Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas

DOI:

10.3791/58441

⸱

10 de dezembro de 2018

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1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

Neste artigo

Resumo

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Aqui descrevemos um protocolo para expressar proteínas em protoplastas usando o método de transformação mediada por PEG. O método fornece fácil expressão de proteínas de interesse e investigação eficiente de localização da proteína e o processo de importação para as várias condições experimentais in vivo.

Resumo

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O cloroplasto é uma organela essencial que é responsável por vários processos celulares em plantas, tais como a fotossíntese e a produção de muitos metabólitos secundários e lipídios. Cloroplastos exigem um grande número de proteínas para estes vários processos fisiológicos. Mais de 95% de proteínas cloroplasto são importados em cloroplastos de citoplasma e núcleo-codificado após a tradução em ribossomas citosólica. Assim, a importação correta ou direcionamento destas proteínas codificadas núcleo cloroplasto de cloroplastos é essencial para o bom funcionamento dos cloroplastos, bem como a célula vegetal. Proteínas codificadas núcleo cloroplasto contém sequências de sinal para o direcionamento específico de cloroplastos. Máquinas moleculares localizadas para o cloroplasto ou citosol reconhecer estes sinais e realizar o processo de importação. Para investigar os mecanismos de importação de proteínas ou segmentação de cloroplastos em vivo, desenvolvemos um método baseado em protoplastos rápido e eficiente para analisar a importação de proteínas em cloroplastos de Arabidopsis. Neste método, usamos protoplastas isolados de tecidos folha de Arabidopsis. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para uso protoplastas para investigar o mecanismo pelo qual as proteínas são importadas em cloroplastos.

Introdução

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O cloroplasto é dentre as organelas mais importantes em plantas. Uma das principais funções dos cloroplastos é realizar fotossíntese1. Cloroplastos também realizam muitas outras reações bioquímicas para a produção de ácidos graxos, aminoácidos, nucleotídeos e muitos metabólitos secundários1,2. Para todas estas reacções, cloroplastos exigem um grande número de diferentes tipos de proteínas. No entanto, o genoma do cloroplasto contém apenas cerca de 100 genes3,4. Portanto, cloroplastos devem importar a maioria das suas proteínas d....

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Protocolo

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1. crescimento de plantas de Arabidopsis

  1. Preparar 1 L Gamborg B5 (B5) médio, adicionando 3,2 g de B5 médio incluindo vitaminas, 20 g de sacarose, 0,5 g de 2-(N-morpholino) etano sulfônico (MES) para cerca de 800 mL de água desionizada e ajustar o pH a 5.7 com hidróxido de potássio (KOH). Adicione mais água deionizada água traz o volume total de 1 L. adicionar 8 g de phytoagar e autoclave por 15 min a 121 ° C.
  2. Permita a médio e a arrefecer até 55 ° C e despeje uma placa de Petri (9 cm de diâmetro, 1,5 cm de altura) em uma bancada limpa 20 – 25 mL do meio de B5. Chapas secas por 2 – 3 dias, embale-os com o envoltório limpo e mantê-los em geladeira at....

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Resultados

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A importação de proteínas em cloroplastos pode ser examinada usando duas abordagens: análise de microscopia e immunoblot fluorescência após separação SDS-Página-mediada. Aqui, usamos hemácias-nt:GFP, uma fusão construir codificação os 79 resíduos de aminoácidos N-terminal de hemácias contendo o peptídeo de trânsito fundido a GFP. Quando as proteínas são importadas em cloroplastos, fluorescência verde sinaliza da proteína alvo hemácias-nt:GFP deve mesclar com os sinais fluorescentes vermel.......

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Discussão

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Nós fornecemos um protocolo detalhado para o uso de protoplastas de Arabidopsis para estudar a importação de proteínas em cloroplastos. Este método é muito poderoso para investigar o processo de importação de proteínas. Esta técnica simples e versátil é útil para examinar o direcionamento das proteínas de carga pretendida para os cloroplastos. Usando esse método, protoplastas são preparados a partir de tecidos de folha de Arabidopsis11,12 , que .......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi realizado com o suporte do programa de pesquisa cooperativa para a agricultura ciência e tecnologia de desenvolvimento (projeto n. º PJ010953012018), administração de Desenvolvimento Rural e a concessão da Fundação Nacional de pesquisa (Coreia) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (n º 2016R1E1A1A02922014), República da Coreia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GAMBORG B5 MEIO INCLUINDO VITAMINASDuchefa BiochemieG0210.0050
SACAROSEDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHIDRATADODuchefa BiochemieM1503.0250
Ágar, póJUNSEI24440S1201
Micropore Fita cirúrgica3M1530-0
Lâmina cirúrgica Tubo cônico indisponívelFEATHER
, 50mlSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Indisponível
Celulase ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.
ALBUMINA, BOVINO (BSA) VWR0332-100G
D-ManitolSIGMAM1902-1KG
CLORETO DE CÁLCIO, DI-HIDRATADOMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
Copo de tela para CD-1SIGMAS1145
Telas para CD-1Pipeta de Pasteur da placaS3895
CENTRÍFUGA DE LABORATÓRIO DE
Cloreto de sódioJUNSEI19015S0350
Cloreto de potássioSIGMAP3911-1KG
D-GLICOSE, ANIDROBIO BÁSICOGB0219
Hidróxido de potássioDUKSAN40
Nitrato de cálcio tetrahidratadoSIGMAC2786-500G
Poli (etilenoglicol)SIGMAP2139-2KG
Cloreto de magnésio hexahidratadoSIGMAM2393-500G
Tubo 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
Lâminas de microscópioMARIENFELD1000412
Óculos de cobertura de microscópioMARIENFELD101030
Câmara de contagemMARIENFELD650030
Axioplan 2 Microscópio de imagemCarl ZeissIndisponível
Microtubo 1,5mlSARSTEDT72.690.001
2- MercaptoetanolSIGMAM3148-250ML
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), Grau ProteómicoVWRM107-500G
TRIS, Grau Ultra PuroVWR0497-5KG
DTT (DL-Ditiotreitol), Grau BiotecnologiaVWR0281-25G
Sal de sódio azul de bromofenol ACSVWR0312-50G
GlicerolJUNSEI27210S0350
Anticorpo Monoclonal Living Colors AV (JL-8)TAKARA632381
inoxidável No.10 de Petri SPL LIFE SCIENCES 10090 de SIGMA 3150102 DE BANCADA VISION SCIENTIFIC VS-5500N

Referências

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  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

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Etiquetas

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

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