Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

Resumo

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Resumo

A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é uma característica dos processos inflamatórios, mas em excesso, estresse oxidativo é amplamente envolvido em várias patologias como câncer, aterosclerose e diabetes. Mostramos anteriormente que a disfunção do fator Nuclear (eritroide-derivado 2)-tipo 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como derivado de células proteína 1 (Keap1) sinalização percurso leva ao extremo desequilíbrio ROS durante cutânea cicatrização em diabetes. Desde que os níveis ROS são um importante indicador da progressão da cicatrização, técnicas de quantificação específica e precisos são valiosas. Têm sido descritos vários ensaios em vitro para medir ROS em células e tecidos; no entanto, eles apenas fornecem uma única medida cumulativa por amostra. Mais recentemente, o desenvolvimento de indicadores baseados em proteína e as modalidades de imagem permitiram análises spatiotemporal exclusivas. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂) é um derivado de luminol que pode ser usado tanto em vivo e em vitro quimioluminescente deteção de ROS gerado pelo oxidase NAPDH. L-012 emite um sinal mais forte do que outras sondas fluorescentes e tem se mostrado sensível e confiável para a detecção de ROS. A aplicabilidade de lapso de tempo de L-012-facilitou a imagem fornece informações valiosas sobre processos inflamatórios, reduzindo a necessidade de sacrifício e globalmente, reduzindo o número de animais de estudo. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando L-012-facilitado na vivo por imagens para quantificar o estresse oxidativo em um modelo de cicatrização de feridas excisional usando ratos diabéticos com localmente disfuncional Nrf2/Keap1.

Introdução

Metabólitos de oxigênio gerados através de processos inflamatórios contribuam para diversas cascatas de sinalização, bem como alteração destrutiva de componentes celulares¹. Utilizando técnicas sensíveis e específicas para medir ROS é crítico para estudar processos inflamatórios e caracterizar os efeitos do estresse oxidativo. Imagem latente na vivo é valioso devido à sua capacidade para fornecer dados de dinâmicos espaciais e temporais em tecido vivo. L-012 é uma sonda quimioluminescente sintética que é altamente sensível para ânions superóxido e produz uma intensidade de luz mais elevada do que outras sondas fluorescentes em células,....

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da New York University School of Medicine. Todos os ratos estão alojados atrás de uma barreira e todo o pessoal usa equipamento de protecção adequado.

1. dia 0: Preparação do modelo murino de cicatrização Excisional

1. Anestesia o diabéticos ratos (Lepr^db/db), com idades entre 8 a 12 semanas, com isoflurano inalatório de 2%. Confirme que cada rato tem sido devidamente anestesiado utilizando o teste do beliscão pé almofada. Aplique lubrificante ocular esterilizada para cada olho para evitar a irritação do ressecamento. Pesquisa....

Resultados

Três dias depois de criar feridas bilaterais de acordo com um modelo estabelecido ferida excisional (figura 1A), ratos diabéticos estão posicionados na câmara de imagens. Uma fotografia inicial e uma medida de bioluminescência são tomadas antes da injeção de L-012 a conta para o sinal de fundo (figura 1B). Após injeção intraperitoneal com a solução de L-012, os ratos são reposicionados na câmara e bioluminescência é visualizada e.......

Discussão

Técnicas comuns de medição ROS tem sido limitadas pela protocolos complexos que requerem a extração do tecido ou da mesma forma técnicas invasivas. Nos últimos anos, as medidas de estresse oxidativo têm sido relatadas com base nas modalidades de imagem inovadoras, permitindo assim que para avaliações spatiotemporal^9,10,11. L-012 tem várias vantagens, como uma sonda quimioluminescente relativo MCLA^1,<.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bks. Camundongos Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Folha de silicone (0,6 mm)	Sigma Aldrich
Curativos de Filme Transparente Tegaderm 3M	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Reagente de Transfecção	Life Technologies
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer controle negativo	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Soro Reduzido	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Metil-celulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR Sistema de Imagem In Vivo	PerkinElmer

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