É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

6.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/58464

⸱

14 de dezembro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund University

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Resumo

Diferenciação e compromisso de célula eritroide proceder através da ativação de uma rede de linhagem restrita transcriptional orquestrada por um grupo de destino célula determinando e fatores de maturação. Estabelecemos anteriormente para definir um conjunto mínimo de factores necessários para instruir o desenvolvimento de células vermelhas do sangue, usando a linhagem direta reprogramação de fibroblastos em eritroide induzido progenitores/precursores (iEPs). Nós mostramos a superexpressão de Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) podem rapidamente converter murino e humano fibroblastos diretamente para iEPs que se assemelham a bona fide eritroide de células em termos de morfologia, fenótipo, e expressão gênica. Pretendemos que iEPs irá fornecer uma ferramenta valiosa para estudar o Regulamento de eritropoiese e célula de destino. Aqui descrevemos o processo gradual de conversão de fibroblastos de ponta de cauda murino em iEPs através da transcrição orientada por fator linhagem direta reprogramação (DLR). Neste exemplo, podemos realizar a reprogramação de fibroblastos de camundongos de linhagem traçagem eritroide que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) sob o controle do promotor eritropoietina receptor gene (EpoR), permitindo a visualização da célula eritroide indução de destino após reprogramação. Na sequência deste protocolo, os fibroblastos podem ser reprogramados em iEPs dentro de cinco a oito dias.

Enquanto melhorias ainda podem ser feitas para o processo, nós mostramos que mediada por GTLM reprogramação é um processo rápido e directo, produzindo células com propriedades de bona fide células progenitoras e precursor de eritroide.

Introdução

Glóbulos vermelhos (hemácias) são essenciais em todos os vertebrados e somam 84% de todas as células do corpo humano1. De embrionário para a vida adulta, nossa saúde é altamente dependente de regulação exata da homeostase de RBC. A produção contínua de hemácias maduras durante todo o desenvolvimento na idade adulta é conhecida como eritropoiese. Um grande desafio na pesquisa de eritropoiese é definir os mestre reguladores que coordene o desenvolvimento de RBC e o interruptor entre eritropoiese primitivo e definitivo. Reprogramação de linhagem direta dos progenitores eritroide apresenta uma oportunidade de entender melhor eritroide desenvolvimento em vivo.

Linhagem direta reprogramação (DLR), também conhecido como transdiferenciação celular, é o processo de reprogramação de um tipo de célula diretamente em outro, ignorando pluripotentes e multipotentes progenitoras estágios. DLR até agora tem sido usado para produzir vários tipos de células, incluindo neural2e nefrótica7, células progenitoras hematopoiéticas3,4,5, hepática6 . Para os biólogos do desenvolvimento, DLR tornou-se uma ferramenta importante para interrogar os aspectos de compromisso linhagem e processos de diferenciação terminal8,9. DLR pode complementar e substituir parcialmente na vivo estudos para mecanismos de compreensão do destino célula fatores determinantes durante o desenvolvimento. O protocolo DLR para reprogramação de progenitores eritroide descritos neste artigo fornece o campo um método complementar para estudos do desenvolvimento da eritropoiese.

Nós demonstramos anteriormente que a superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente de progenitores eritroide induzida (iEPs) 10. the GTLM-reprogramado eritroide células assemelham-se grandemente bona fide eritroide primitivo progenitores em termos de morfologia, fenótipo e gene expressão10. Assim iEPs tem limitada capacidade de proliferação e amadurecer-se hemácias nucleadas similares àqueles produzidos transitoriamente no embrião precoce antes do início da eritropoiese definitivo. Fazendo alterações nas condições de reprogramação (por exemplo, mutações pontuais em reprogramação fatores ou adição de outros factores), pode-se entender como isso leva a alterações no desenvolvimento eritroide e diferenciação. Por exemplo mostramos que a adição de Klf1 ou Myb ao coquetel GTLM altera o padrão de expressão de globina de predominantemente embrionário (primitivo) para principalmente adultos (definitivo). Esta constatação corrobora a validade do uso de DLR como uma ferramenta para a definição de fatores do desenvolvimento na eritropoiese.

Aqui, podemos descrever o processo de geração iEPs de fibroblastos de ponta de cauda de rato (TTF). Em nossos resultados representativos, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expressam a proteína fluorescente amarela (eYFP) do locus Rosa26 em todas as células que expressaram o receptor de eritropoetina, permitindo a fácil visualização do compromisso com a linhagem eritroide. Usando esse método, YFP positivo (EpoR +) células estão presentes logo em cinco dias depois de transdução. Este protocolo, portanto, oferece uma técnica rápida e robusta para a geração de eritroide progenitores em vitro.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. estabelecimento e manutenção da cauda do rato principal dica culturas de fibroblastos

  1. Prepare pratos de gelatina-revestido (recomendo um prato de 10 cm para uma cauda), cobrindo a superfície com 0.1% de gelatina e incubando os pratos por aproximadamente 20 min a 37 ° C. Aspirar a solução de gelatina do prato e deixe-o secar pelo menos 2 h.
  2. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical. Retire o rabo com uma tesoura, corte na base da cauda. Coloque o rabo no fosfato salino de Dulbecco (DPBS) com 2% de soro fetal bovino (FBS) até estar pronto para usar.
    Nota: Para os melhores resultados, caudas devem ser tomadas de ratos em torno de 6 a 8 semanas de idade. Caudas podem ser tomadas de ratos mais de 8 semanas de idade, no entanto, como a idade de camundongos, a capacidade de proliferação dos fibroblastos e a eficiência de reprogramação diminuição11.
  3. Execute todas as etapas subsequentes do presente protocolo em uma capa de tecido cultura sob condições estéreis. Preparar uma solução diluída de tripsina de 0,02% do trypsin-EDTA em DPBS e adicionar 5 mL em um prato sem revestimento 10 cm.
  4. Lave o rabo, primeiro em etanol a 70% e, em seguida, em DPBS. Em um prato, coloque a cauda plana e usar fórceps para prendê-lo no lugar. Fazer uma incisão na cauda ao longo do eixo longitudinal da base até a ponta.
  5. Segure a cauda com um par de pinças e segurá-lo na vertical. Usando um segundo par de pinças, agarre a pele ao lado da incisão na base da cauda e descascá-lo de volta. Fazer isso em ambos os lados da incisão até que a pele pode ser removida, puxando para baixo em direção a ponta da cauda.
  6. Segure o rabo pelado com pinça sobre o prato que contém a solução de tripsina e cortar a cauda pedaços aproximadamente 1 cm longo. Com as peças de cauda na solução de tripsina, use tesoura para fragmentar as peças em partes menores. Incube as peças de cauda na solução de tripsina a 37 ° C por 10 min.
    Nota: As peças menores são preferidas por forma a fornecer a cada peça uma área de superfície elevada à relação do volume.
  7. Saciar a tripsina usando 2 volumes de meio de expansão (FEX) de fibroblasto (alta-glicose Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 15% FBS, 2 mM L-glutamina, aminoácidos não essenciais (timina) e 100 U/mL penicilina/estreptomicina).
  8. Coletar todo o conteúdo do prato em um tubo de 50 mL e centrifugar 350 × g por 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os fragmentos de cauda em 10 mL de meio fresco FEX.
  9. Transferência de fragmentos de cauda em meio a um prato de gelatina-revestido e incubar a 37 ° C em 5% de CO2 e 4% O2, acrescentando meio fresco FEX a cada 2 dias.
    Nota: Depois de cinco a sete dias, fragmentos de cauda Anexei no fundo do prato e fibroblastos podem ser vistos afastando-os.
  10. Uma vez que os clusters de fibroblastos são identificados, agite suavemente o prato para desalojar as peças de cauda e aspire o meio e todos os fragmentos de osso, deixando os fibroblastos anexados à placa. Adicionar novo meio FEX e cultura de fibroblastos até confluente.
  11. Para garantir a não contaminação dos fibroblastos pelos progenitores hematopoiéticos, dissociar as células da placa usando 1 x do trypsin-EDTA por 5 minutos e coletar as células. Empobrecem para células expressando marcadores hematopoiéticas (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 e Ter-119) usando um sistema de separação magnética10.

2. retrovírus produção

  1. Células de empacotamento retroviral em aproximadamente 2,5 × 104 células/cm2 (2,0 × 106 células para um prato de 10 cm) em um prato de cultura de tecido-tratada (por vácuo-gás plasma) e a cultura durante a noite em alta-glicose DMEM com 10% de sementes FBS, 10mm de sódio Piruvato e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina em 37 ° C e 5% de CO2.
  2. Na manhã seguinte, altere o meio para DMEM sem aditivos usando metade do volume utilizado para a cultura durante a noite (5 mL para um prato de 10 cm). À tarde, verifique se as células são 70-80% de confluencia e começam o transfeccao.
  3. Para cada fator de reprogramação, Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc, prepare uma mistura de 2:1 do vetor de expressão (pMX) e vetor auxiliar (contendo genes gag e pol). Por um prato de 10cm de fibroblastos, use 6 µ g de vetor de expressão e de 3 µ g do vetor auxiliar em um volume final de 100 µ l em meio DMEM.
  4. Para cada fator de reprogramação, preparar 300 µ l de temperatura (RT) DMEM em um tubo estéril de poliestireno e cuidadosamente adicionar 27 µ l de reagente de transfeccao comercial.
    Nota: O reagente de transfeccao deveria ser trazido para RT antes do uso e deve ser adicionado diretamente no meio de como as propriedades eletrostáticas do composto podem torná-lo a furar a parede do tubo plástica.
  5. Adicione a mistura do plasmídeo no tubo de contendo reagente de transfeccao, vórtice brevemente e incubar a mistura de reagente-DNA de Transfeccao para 15 min no RT. brevemente vórtice a mistura e adicioná-lo para as células de empacotamento retroviral gota a gota para que o transfection mistura de reagente-DNA é espalhada uniformemente sobre a cultura e incubar a 37 ° C durante a noite.
  6. 24 h após a transfeccao, mudar o meio de DMEM com 20% FBS e 100 U/mL penicilina/estreptomicina. 48 h após a transfeccao, recolher o sobrenadante e filtrar através de um filtro de seringa de tamanho de poros de 0,22 µm.
    Nota: Sobrenadantes Viral podem ser congelados a-80 ° C e mantidos até necessária, embora transdução é mais eficiente se o sobrenadante viral fresco é usado.

3. transdução GTLM e colheita do iEP

  1. Semente a cauda dica fibroblastos de 1 × 104 células/cm2 em 0,1% gelatina pré-revestido pratos no meio de FEX e incuba a 37 ° C por 24 h.
  2. No dia seguinte, prepare uma mistura de transdução como segue.
    1. Adicione 1 volume de sobrenadante viral para cada fator reprogramação suplementado com 4 µ g/mL de reagente de infecção retroviral (40%) para 6 volumes de meio FEX (60%).
    2. Por um prato de 10cm de fibroblastos, adicionar 1 mL de cada sobrenadante viral (4 × vírus = 4 mL) suplementado com 4 µ g/mL de reagente de infecção retroviral para 6 mL de meio FEX, dando um total de 10 mL de mistura de transdução.
  3. Aspire médio FEX de cultura de fibroblasto e substituí-lo com a mistura de transdução. Incube a transdução por 4 h a 37 ° C em condições de hipóxicos (5% de CO2 e 4% O2).
  4. Aspirar a mistura de transdução e substituí-lo por meio de reprogramação fresco (média de expansão livre de soro (SFEM), 100 U/mLPenicillin/estreptomicina, 100 ng/mL murino Stem Cell Factor (mSCF), interleucina-3 de 10 ng/mL murino (IL3), 2 recombinante humana de U/mL Eritropoietina (hrEPO) e 100 nM dexametasona).
  5. Incube durante 8 dias 37 ° C em condições de hipóxicos, adicionando meio reprogramação fresco a cada 2 dias. Depois de cinco a oito dias, reprogramação bem sucedida irá produzir aglomerados de células que têm destacado da placa.
  6. Para coletar as células reprogramadas para análise, delicadamente Pipete acima e para baixo para colhê-las diretamente do prato. Colher os fibroblastos untransduced para comparação, dissociar as células da placa usando 1 x do trypsin-EDTA e recolher.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Aqui nós apresentamos um protocolo pode ser reproduzido para a produção de iEPs de fibroblastos adultos usando DLR orientado para a fator de transcrição. Avaliamos que a reprogramação de células usando citometria de fluxo, formadoras ensaios e gene análise da expressão. Para auxiliar a visualização da conversão ao destino de célula eritroide, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expressam a p...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente ao iEPs10. As células reprogramadas eritroide assemelhava-se muito bona fide eritroide progenitores em termos de morfologia, fenótipo, expressão gênica e formadoras de capacidade. Esta constatação corrobora o raciocínio de usando ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores têm sem conflitos de interesse para o relatório.

Agradecimentos

Agradecemos Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonagem e Harvey Lodish (Instituto Whitehead) fornecendo muitos o plasmídeo utilizado para gerar a biblioteca retroviral. Agradecemos leiliane Siva e Sofie Singbrant (departamento de Medicina Molecular e Gene Therapy, Universidade de Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (departamento de Hematologia Molecular, Universidade de Lund) para os seus papéis na descrição da produção do iEP. Também gostaríamos de reconhecer e agradecer o Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, parque de pesquisa biomédica de Barcelona), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, Nova Iorque), Carl Walkley (Instituto de pesquisa médica de St. Vincent e Departamento de medicina, Hospital de St. Vincent, Universidade de Melbourne), Ángel Raya (instituição catalã de investigação e estudos avançados, Barcelona) e G. de Vijay Sankaran (Broad Institute do Instituto de Massachusetts de tecnologia e Harvard, Cambridge ) por suas contribuições anteriores a este trabalho. Este trabalho foi financiado pela Fundação Ragnar Söderberg (a J.F.); o sueco de pesquisa Conselho (J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (para J.F.); a Fundação sueca para a investigação estratégica (para J.F.); Fundação de Åke Wiberg (para J.F.); um subsídio de integração de Marie Curie (para J.F.).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM sem piruvato de sódioGE Life SciencesSH30022.01Meio de cultura para células PhGP
DMEM com piruvato de sódioGE Life SciencesSH30243.01Meio de cultura para fibroblastos da ponta da cauda
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)Stem Cell Technologies9650Mídia de reprogramação 
Soro Fetal Bovino HyCloneGE Life SciencesSH30071.03HIFator de crescimento
Penicilina/Estreptomicina HyClone (100x)Ge Life SciencesSV30010Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)Thermo Fisher11140050SNL media é complementado com este
Trypsin HyClone (1x)GE Life SciencesSH30042.01Agente de dissociação celular
Fator de Células-Tronco Murinas (mSCF)Peprotech250-03Adicionado ao meio de reprogramação
Murine Il-3 RecombinantePeprotech213-13Adicionado ao meio de reprogramação
eritropoietina recombinante humana (hrEPO)Peprotech100-64Adicionado ao meio de reprogramação
DexametasonaSigma50-02-2   Adicionado à mídia de reprogramação
Gelatina de pele suínaSigma9000-70-8 Dissolvido em dH2O e usado para placas de revestimento. Garanta a esterilidade antes de usar.
Cloridrato de Blasticidina SSigma3/9/3513Antibiótico de seleção. Afeta tanto células pró- quanto eucarióticas
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Ge Life SciencesSH30850.03Usado para etapas de lavagem
PolybreneMerckTR-1003-GInfecção / Transfecção  Reagente
de transfecção de FuGENE HD Reagente de transfecçãoPromegaE2311Reagente de transfecção para linha celular PhGP
Unidade de filtro de seringa Millex-GP 0,22 µ mMerckSLGP033RSUsado para filtrar o sobrenadante de vírus
BD Emerald Hypodermic SyringeBecton DickinsonSKU: 307736Usado para filtrar o sobrenadante de vírus
100 mm Placade cultura Corning430167
Placa de 6 poçosFalcon10799541Pinça de joalheiro de cultura de células
#5Sklar66-7642Usado para manipulação de pequenos fragmentos de cauda
Tesoura de Íris SklarliteSklar23-1149Usado para cortar a cauda em pequenos pedaços
Kit de Depleção de Células de Linhagem, camundongoMiltenyi Biotec130-090-858Para depleção de células hematopoiéticas em culturas de fibroblastos
CD117 MicroBeads, camundongoMiltenyi Biotec130-091-224Para depleção de células hematopoiéticas em culturas
de fibroblastosCélulas PheonixGPATCCCRL-3215linha celular de embalagem retroviral
EcoPAC vector (pCL-Eco) Novus BiologicalsNBP2-29540vetor auxiliar retroviral contendo genes gag e pol
pMX-Gata1Clonado em laboratório
pMX-Tal1Clonado em laboratório
pMX-Lmo2Clonado em laboratório
pMX-cMycClonado em laboratório
Software CellSens Standard 1.6 Software de análise Cytospin

Referências

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  2. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
  3. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  4. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  5. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
  6. Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
  7. Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
  8. Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
  9. Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
  10. Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
  11. Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
  12. Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
  13. Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
  14. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  15. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83(2016).
  16. Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
  17. Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890(2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Conversão de FibroblastosSuperexpressão de Fatores de TranscriçãoReprogramação GTLMEnsaio de Formação de ColôniasAnálise por FACSExpressão Gênica por qPCRCélulas YFP PositivasMarcador TER-119
Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.