Presenteres her er to metoder som kan brukes individuelt eller sammen for å analysere effekten av beta-amyloid fibrin blodpropp struktur. Inkludert er en protokoll for å opprette en i vitro fibrin blodpropp, etterfulgt av blodpropp turbiditet og skanning elektronmikroskop metoder.
Denne artikkelen presenterer metoder for å generere i vitro fibrin clots og analysere effekten av beta-amyloid (Aβ) protein på blodpropp dannelse og struktur av massespektrometri og skanning elektronmikroskop (SEM). Aβ, som danner nevrotoksiske amyloid aggregater i Alzheimers sykdom (AD), har vist å samhandle med fibrinogen. Dette Aβ-fibrinogen interaksjon gjør fibrin blodpropp strukturelt unormale og motstandsdyktig mot fibrinolyse. Aβ-indusert unormalt i fibrin clotting kan også bidra til cerebrovascular aspekter av AD patologi som microinfarcts, betennelse, i tillegg til, cerebral amyloid angiopathy (CAA). Gitt den potensielt kritiske rollen nevrovaskulære underskudd i AD patologi, har utvikle forbindelser som kan hemme eller redusere Aβ-fibrinogen interaksjon lovende terapeutisk verdi. In vitro metoder av hvilke fibrin blodpropp formasjon kan lett og systematisk vurderes er potensielt nyttig verktøy for utvikling av terapeutiske forbindelser. Presenteres her er en optimalisert protokoll for i vitro generasjon fibrin blodpropp, samt analyse av effekten av Aβ og Aβ-fibrinogen interaksjon hemmere. Blodpropp turbiditet analysen er raske, svært reproduserbare og kan brukes til å teste flere vilkår samtidig, tillater for screening av store mengder Aβ-fibrinogen-hemmere. Hit forbindelser fra dette programmet kan evalueres videre for sin evne til å forbedre Aβ-indusert strukturelle unormale fibrin blodpropp arkitekturen ved hjelp av SEM. Effektiviteten av disse optimalisert protokollene er vist her med TDI-2760, en nylig identifisert Aβ-fibrinogen interaksjon inhibitor.
Alzheimers sykdom (AD), en nevrodegenerativ sykdommen fører til kognitiv svikt hos eldre pasienter, hovedsakelig oppstår fra unormal beta-amyloid (Aβ) uttrykk, aggregering og svekket klarering resulterer i nevrotoksisitet1, 2. til tross for godt karakterisert foreningen Aβ aggregater og AD3, presis mekanismene bak sykdom patologi er ikke godt forstått4. Økende bevis antyder at nevrovaskulære underskudd spille en rolle i progresjonen og alvorlighetsgraden av AD5, som Aβ direkte samspill med komponentene av sirkulasjonssystemet6. Aβ har en høy affinitet interaksjon med fibrinogen7,8, som også regionaliserer Aβ innskudd i både AD pasienter og musen modeller9,10,11. Videre, Aβ-fibrinogen interaksjon induserer unormal fibrin-blodpropp dannelse og struktur, samt motstand mot fibrinolyse9,12. En terapeutisk mulighet i behandling av Annonsen, er lindre sirkulasjons underskudd begrenser samspillet mellom Aβ og fibrinogen13,14. Vi har derfor identifisert flere små forbindelser hemme Aβ-fibrinogen interaksjon med høy gjennomstrømning screening og medisinsk kjemi tilnærminger13,14. For å teste effekten av Aβ-fibrinogen interaksjon hemmere, optimalisert vi to metoder for analyse av i vitro fibrin blodpropp formasjon: levre turbiditet analysen og skanning elektronmikroskop (SEM)14.
Blodpropp turbiditet analysen er en rett fram og rask metode for å overvåke fibrin blodpropp formasjon bruker UV-synlig spektroskopi. Som fibrin blodpropp former, lys er stadig spredt og turbiditet løsningen øker. Motsatt, når Aβ, strukturen til fibrin blodpropp endres, og turbiditet av blandingen reduseres (figur 1). Effekten av hemmende forbindelser kan vurderes for potensial til å gjenopprette blodpropp turbiditet fra Aβ-indusert unormalt. Mens turbiditet analysen gir rask analyse av flere vilkår, gir det begrenset informasjon på blodpropp form og struktur. SEM, der topografien massive objekter er avslørt av elektron sonde, tillater analyse av blodpropp15,16,17,18 3D arkitektur og vurdering av hvordan tilstedeværelsen av Aβ og / eller hemmende forbindelser endrer at strukturen9,14. Både massespektrometri og SEM er klassisk laboratorium teknikker som er brukt for ulike formål, for eksempel spectrophotometry brukes for overvåking amyloid aggregering19,20. Tilsvarende er SEM også brukt til å analysere fibrin blodpropp dannet fra plasma av Alzheimers, Parkinson og thromboembolic slag pasienter21,22,23. Protokollene som presenteres her er optimalisert for å vurdere fibrin-blodpropp formasjon i en reproduserbar og rask måte.
Følgende protokollen gir instruksjoner for utarbeidelse av en i vitro fibrin-blodpropp både med og uten Aβ. Det har også detaljer metodene for å analysere effekten av Aβ fibrin blodpropp dannelse og struktur. Effektiviteten av disse to metodene for å måle hemming av Aβ-fibrinogen interaksjon er demonstrert med TDI-2760, en liten hemmende sammensatte14. Disse metodene, tillater både individuelt og sammen, rask og enkel analyse av i vitro fibrin blodpropp formasjon.
Metodene som er beskrevet her gir en reproduserbar og rask måte å vurdere fibrin blodpropp formasjon i vitro. I tillegg gjør enkelheten til systemet tolkning av hvordan Aβ påvirker fibrin blodpropp dannelse og struktur relativt rett frem. I dette laboratoriet forrige publikasjonen ble det vist at disse analyser kan brukes til å teste forbindelser for sin evne til å hemme den Aβ-fibrinogen interaksjon13,14. Bruker disse to analyser, en rekke synte…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso og Michael Foley fra Tri-institusjonelle Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York for syntese av Aβ-fibrinogen interaksjon hemmere og deres verdifulle forslag. Forfatterne takker også medlemmer av laboratoriet Strickland nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av NIH grant NS104386, Alzheimers Drug Discovery Foundation og Robertson terapeutiske Development Fund for ha, NIH gi NS50537, the Tri-institusjonelle Therapeutics Discovery Institute, Alzheimers Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation, og John A. Herrmann for SS
Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
24 well plate | Falcon | 3047 | |
Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
Smart SEM Software | Carl Zeiss |