Artigo de método

Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos

DOI:

10.3791/58476

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7 de janeiro de 2019

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1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um in-house projetado em vitro fluxo modelo de câmara, que permite a investigação de adesão bacteriana ao enxerto de tecidos.

Resumo

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Várias condutos valvulados e válvulas de stent montado são utilizadas para substituição de válvula de trato (RVOT) de saída do ventrículo direito em pacientes com doença cardíaca congênita. Quando usando materiais protéticos, no entanto, esses enxertos são suscetíveis a infecções bacterianas e várias respostas do hospedeiro.

Identificação de fatores bacterianos e anfitrião que desempenham um papel vital na endovascular aderência dos microorganismos é de importância para compreender melhor a fisiopatologia da superveniência de infecções como a endocardite infecciosa (IE) e desenvolver preventiva estratégias. Portanto, o desenvolvimento de modelos competentes para investigar a adesão bacteriana em condições fisiológicas de cisalhamento é necessário. Aqui, descrevemos o uso de um recém-projetado em vitro perfusão câmara baseado em placas paralelas que permite o estudo da adesão bacteriana aos diferentes componentes dos tecidos de enxerto como expostos a matriz extracelular, células endoteliais e áreas inertes . Esse método combinado com formadoras de Colônia (CFU) unidade de contagem é adequada para avaliar a propensão dos materiais de enxerto para adesão bacteriana sob fluxo. Além disso, o sistema de câmara de fluxo pode ser usado para investigar o papel dos componentes do sangue na adesão bacteriana sob condições de cisalhamento. Temos demonstrado que a fonte de tecido, sua morfologia superficial e especificidade de espécies bacterianas não são os principais fatores determinantes na adesão bacteriana enxertar tecidos usando nosso modelo de perfusão in-house projetado em vitro .

Introdução

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Staphylococcus aureus (S. aureus) emprega uma variedade de estratégias de virulência para burlar o sistema de defesa imunológica host colonizando superfícies biológicas ou não biológicos, implantadas na circulação humana, que leva a graves infecções intravasculares como sepse e IE,1,2,3,4,5. Restos de IE um tratamento importante associado a complicação em pacientes após o implante de válvulas protéticas do coração enquanto factores individuais, contribuindo para o aparecimento de IEare não ainda plenamente compreendido6,7. Sob condições de fluência, as bactérias encontram forças de cisalhamento, que eles precisam superar para aderir ao vaso parede8. Modelos, que permitem estudar a interação entre bactérias e tecido da prótese valvular ou endotélio sob fluxo, são de interesse como eles refletem na vivo situação mais.

Vários mecanismos específicos facilitam a aderência bacteriana às células endoteliais (ECs) e a matriz de subendothelial expostos (ECM) levando a colonização do tecido e maturação de vegetações, sendo essenciais primeiros passos no IE9. Várias proteínas de superfície estafilocócicas ou MSCRAMMs (componentes superfície microbianas reconhecer moléculas da matriz adesiva) têm sido descritos como mediadores de adesão às células do hospedeiro e a proteínas de ECM interagindo com moléculas como a fibronectina, fator de fibrinogênio, colágeno e von Willebrand (VWF)8,10,11. No entanto, tendo em conta a dobrar intra molecular de alguns fatores de virulência, estudadas na maior parte em condições estáticas, muitas dessas interações podem ter diferente relevância nas infecções endovascular na circulação de sangue.

Portanto, apresentamos um in-house projetado em vitro fluxo paralelo-placa modelo de câmara, que permite a avaliação da aderência bacteriana aos diferentes componentes do ECM e ECs no contexto de enxertos de tecido implantado na posição RVOT. O objetivo geral do método descrito neste trabalho é estudar os mecanismos de interação entre as bactérias e os tecidos subjacentes endovascular em condições de fluxo, que estão intimamente relacionados com o ambiente na vivo de patógenos de circulação sanguínea, tais como S. aureus. Esta nova abordagem enfoca a susceptibilidade de superfícies de tecido de enxerto para aderência bacteriana para identificar potenciais fatores de risco para o desenvolvimento do IE.

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Protocolo

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1. preparar o enxerto de tecidos para estudos In Vitro

Nota: Três tipos de tecidos foram utilizados: patch de pericárdio bovino (BP), enxertos criopreservado Homograft (CH) e bovinos de Veia Jugular (BJV). Em caso de conduta BJV e CH (tecido processadas pelo Banco Europeu de Homograft (EHB) e armazenados em nitrogênio líquido antes de usar), foram utilizados tanto a parede e folhetos valvulares. Patch de BP e conduíte BJV foram comprados de fabricantes. Antes da utilização, descongele o CH seguindo as instruções de EHB12.

  1. Lave todos os tecidos com 0,9% NaCl antes de usar.
  2. Prepare-se biópsias de tecido usando uma biópsia de pele descartável punch para cortar pedaços de tecido circular (10 mm de diâmetro).
  3. Corte todos os patches de tecido para a mesma altura usando bisturis estéril descartáveis.
  4. Em tecidos fixados com glutaraldeído (por exemplo conduit BJV), incube pedaços de enxerto durante a noite a 4 ° C com 200 g/L de albumina humana para neutralizar o fixador.
  5. Lavar resíduos de glutaraldeído com 0,9% NaCl em uma placa de microtitulação.  Repeti 3 vezes durante 1 minuto.

2. preparar as bactérias para experimentos de perfusão

Nota: Três isolados bacterianos foram utilizados: Cowan (ATCC 12598) S. aureus , s. epidermidis ATCC 149900 e S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus e S. epidermidis foram cultivadas a 37 ° C em caldo tryptic soja (TSB) e S. sanguinis foi cultivado a 37 ° C com 5% CO2 em caldo de infusão cérebro coração (BHI).

  1. Prepare uma noite cultura de bactérias em uma placa de ágar de sangue sólido.
    1. Usar um loop estéril para raspar as bactérias congeladas e inocular em uma placa de ágar sangue de Mueller-Hinton para cultura durante a noite a 37 ° C.
  2. Usar um loop de inoculação estéril para pegar uma única colônia da cultura ágar sangue durante a noite e inocular em 10 mL de TSB ou BHI em um tubo de 14 mL e cultura durante a noite a 37 ° C.
  3. Centrifugar as culturas durante a noite (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e ressuspender as pelotas em 10 mL de salina tamponada fosfato (PBS). Coloque os tubos de 14 mL no gelo.
  4. Prepare-se uma alíquota da solução de 3,7 mg/mL de 5 (6) - carboxi - fluoresceína N-hidróxi-succinimidil éster (CF) em etanol e armazenar a-20 ° C. Dilua ainda mais o estoque de CF para 150 µ g/mL, usando água 'ultrapura '.
    Nota: Proteger os tubos de luz usando a folha de alumínio e armazenar a-20 ° C.
  5. Centrifugar as bactérias (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e Resuspenda as pelotas em 800 µ l de PBS e adicione 200 µ l da solução CF 150 µ g/mL (concentração final de 30 µ g/mL, usado para experiências de perfusão). Proteger os tubos de luz com papel alumínio e incube por 30 minutos usando um agitador orbital.
  6. Depois da rotulagem, bloco com 2% de solução de albumina de soro bovino (BSA) em PBS e girar (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Siga com uma etapa de lavagem usando 10 mL de PBS e pelota bactérias por centrifugação (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
  7. Dilua as bactérias com PBS para obter 10 unidades formadoras de colônia de7 (CFU) /mL (verificado pela UFC contando com placas de sangue Ágar Mueller-Hinton), que corresponde a uma OD600 (densidade óptica) de 0,65. Manter os tubos no escuro no gelo antes experimentos de perfusão.
    Romance Tenha em mente que as medições de600 OD refletem o número aproximado de bactérias. Para contar a dose de vacina eficaz, o método de diluição serial é uma etapa adicional necessária para verificar o OD com base em números, conforme descrito na seção 3.8.

3. in vitro perfusão experimentos utilizando uma câmara de fluxo paralelo-placa

  1. Monte de biópsias de tecido de 10 mm de diâmetro e a mesma espessura (preparado nas etapas 1.1-1.5) em um sistema de câmara de fluxo com a superfície interior voltada para cima para entrar em contato com a suspensão bacteriana.
    Nota: A mesma espessura de tecido através de vários enxertos garante que a mesma altura de tecido é alcançada no canal permitindo o fluxo laminar em todas as condições. Todos os elementos da câmara de fluxo são apresentados e descritos na Figura 1.
    1. Para começar o protocolo, coloque o pedaço de tecido redondo entre uma lâmina de microscópio com uma perfuração circular de 8 mm e uma junta de borracha.
      Nota: O microscópio possui o filme ultra-fino inferior para permitir a geração do furo de 8 mm. Juntamente com a folha de borracha, ele corrige o tecido para permitir o contato direto entre a amostra e o fluxo médio e também previne a luxação da biópsia durante o experimento. A superfície do tecido investigada, que é exposta ao fluxo (diâmetro menor) não pode ser manipulada pelo fórceps.
    2. Encaixe o suporte com o tecido a folha da gaxeta que está incorporada no quadro de metal inferior da câmara.
    3. Fixe a estrutura de metal superior com a folha da gaxeta correspondente à parte inferior da câmara com o suporte do tecido inserido anteriormente. Posteriormente montar a câmara inteira com oito parafusos e porcas de parafuso. Certifique-se que a altura da câmara é sempre o mesmo através de enxertos.
      Nota: A altura da câmara deve ser determinada sempre sobre os parafusos de aperto. Use um paquímetro ou régua.
  2. Ligue a câmara de fluxo com uma bomba peristáltica e o reservatório do líquido com os tubos.
  3. Perfundir os tecidos com suspensões de 107 UFC/mL (verificado pela UFC contando e relacionadas com medições de600 OD) bactérias fluorescente-etiquetadas em PBS com uma tensão de cisalhamento de 3 Dina/cm2 (Dina por centímetro quadrado unidade de pressão) por meios da bomba peristáltica (4 mL/min de taxa de fluxo) para 1 h, usando um reservatório 400ml bacteriana (projeto In-house, Figura 1) condicionado a 37 ° C, usando um termostato de placa (Tabela de materiais).
  4. Recircular continuamente a suspensão bacteriana de 100 mL, usando o mesmo reservatório.
  5. Após a perfusão, desmonte a câmara para liberar o enxerto e lavar a peça de tecido duas vezes com 4 mL de PBS em uma placa de 12 usando o agitador orbital de laboratório por 3 min cada. Posteriormente, corte a parte interna da prótese usando uma biópsia de pele soco de um diâmetro menor.
  6. Coloque cada biópsia do tecido num tubo separado 14 mL contendo 1 mL de estéril 0,9% NaCl. Rotule o tubo como #1.
  7. Separar as bactérias do tecido usando um banho sonication por 10 min (amplitude = 100% e frequência = 45 kHz).
    Nota: Completo desapego das bactérias do tecido enxertos devem ser avaliados após incubação de patches durante a noite a 37 ° C, em meio líquido TSB, seguido por medições de600 OD comparado para controlar os patches tratadas com uma solução livre de bactérias.
  8. Use um método de diluição serial em placas de ágar sangue de Mueller-Hinton para contar CFUs.
    1. Prepare um tubo único 14 mL com 10 mL de solução salina estéril para fazer diluições em série da suspensão bacteriana obtidos após sonication. Rotule este tubo como #2.
      Nota: Para cada tecido experimento um tubo com 10 mL de 0,9% NaCl é necessário.
    2. Prepare-se três tubos de 14 mL com 10ml de estéril 0,9% NaCl para diluições em série de suspensão bacteriana inicial do passo 2.7. Rotule os tubos como segue 3 #, 4 #, 5 #.
      Nota: Este passo é necessário saber o número real de UFC em suspensão bacteriana, usado para o experimento de perfusão.
    3. Vórtice misturar cada tubo de vórtice s. 15 os tubos com a biópsia de tecido, bem como a suspensão bacteriana inicial para fazer diluições em série.
    4. Prepare três placas de ágar, dois para o experimento de tecido (perfusão de bactérias e controle da perfusão de PBS) e um terceiro para a suspensão bacteriana inicial usado para perfusions.
    5. Rotule a três setores por prato para o experimento de tecido da seguinte forma 10-1, 10-3 e 10-4. Para contar o número de CFUs na perfusates bacteriana, rotular o prato da seguinte forma: 10-1, 10-3, 10-5 e 10-7.
      Nota: Todas as indicações em ágar placas como 10-1, 10-3 e assim por diante referem o número final de UFC/mL, calculado no dia seguinte. Placa de controle não exige qualquer setores. Antes da utilização, placas de ágar sangue devem ser colocadas sob o capô laminar e abriu para remover o excesso de umidade.
    6. Para continuar a preparar as diluições em série, transferir 100 µ l do tubo #1 para o tubo #2 e misture vigorosamente com vortex.
    7. Espalhou-se 100 µ l do conteúdo do tubo #1 e #2 para o correspondente de setores 10-1 e 10-3 da placa de ágar. Da mesma forma, espalhar 10 µ l de tubo #2 sobre o setor 10-4, repita esta etapa 4 vezes para obter 4 crescimentos separados de cada volume de 10 µ l.
      Nota: Devido ao pequeno volume usado para chapeamento para o setor 10-4, é aconselhável ter vários número de gotas para fazer um número médio de CFUs crescidos.
    8. Para preparar as diluições de série da cultura inicial, transferir 100 µ l de suspensão bacteriana do passo 2.7 para tubo #3 e misture vigorosamente com vortex. Adicionar 100 µ l do tubo #3 #4 de tubo e misture bem, repita o procedimento para tubo subsequente #5.
    9. Espalhou-se 100 µ l do conteúdo dos tubos 3 #, 4 #, 5 # e a suspensão bacteriana ajustada (passo 2.7), respectivamente, para os setores de 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 da placa de ágar sangue.
    10. Deixe as placas de ágar sangue de capuz laminar de ar seco os spreads bacterianos, normalmente por 10 minutos. Depois, coloque as placas a 37 ° C para incubação durante a noite.
    11. Após a incubação durante a noite, conte as colônias bacterianas para obter o número de CFUs resultantes da adesão a biópsias de tecidos, bem como CFUs/mL na suspensão bacteriana de partida usada para a perfusão. Expressa os resultados como UFC/cm2.

4. fluorescência microscopia de bactérias aderidas enxertar tecidos mediante perfusão

  1. Após a perfusão, lavar peças de tecido com PBS (consulte a etapa 3.5) e cortar a parte interna de um enxerto usando um soco de um diâmetro menor.
  2. Preparar uma placa de 6 e coloque as gotas de meio de montagem (Tabela de materiais).
  3. Coloque cada pedaço de tecido com sua superfície perfundido para baixo em uma única gota de meio de montagem.
  4. Ler uma placa usando um scanner de fluorescência (Tabela de materiais). Definir parâmetros de excitação e emissão de comprimentos de onda de acordo com um fluoróforo usado para rotular bacteriana.

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Resultados

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Para melhor compreender os mecanismos por trás IE desenvolvimento, este modelo permite a avaliação de bacteriano e fatores de tecido associado apresentam a situação na vivo do início da infecção.

No detalhe, a abordagem do romance em vitro permite quantificar adesão bacteriana em condições de fluxo de tecidos diferentes do enxerto por perfusing fluorescente etiquetadas bactérias sobre os tecidos exerce...

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Discussão

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Observações clínicas recentes dar atenção especial a IE como uma complicação em pacientes submetidos a substituição da válvula da RVOT6,13. Disfunção da válvula implantada no IE é o resultado da interação bacteriana com o enxerto endovascular, levando a extensa inflamatória procoagulante reações1,e14. O modelo apresentado romance em vitro permitiu-nos investigar se as diferenças em estruturas de ...

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Agradecimentos

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Este estudo foi patrocinado por uma concessão do fundo de pesquisa KU Leuven (OT/14/097) dada ao RH. TRV foi Postdoctoral Fellow da Fundação de pesquisa FWO - Flandres (Bélgica; Grant Number - 12K0916N) e RH é suportado pela pesquisa clínica fundo de UZ Leuven.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Remendo de pericárdio bovino (BP), Pericárdio Peri-Guard FlexívelSynovis Surgical Innovations, EUAPC-0404SN
Conduítes de veia jugular bovina (BJV)Conduíte de contegra; Medtronic Inc, EUAM333105D001
homoenxerto criopreservado CHEuropean Homograft Bank (EHB)-
Acu-PunchAcuderm Inc, EUAP850 (8 mm); P1050 (10 mm)
albumina humanaFlexbumin; Baxter, BélgicaBE171464
LOTE:16G12C
Caldo de soja tríptico (TSB)Fluka, Steinheim, Alemanha22092-500G
Caldo de infusão cardíaca (BHI)Fluka53286-500G
Solução salina tamponada com fosfato (PBS).Gibco14190-094
5(6)-Carboxifluoresceína N-hidroxisuccinimida éster (CF)Sigma-Aldrich, Alemanha21878-100MG-F
Bomba peristáltica (MODELO ISM444B)Padrão Ismatec BVP-Z; Cole Parmer, Wertheim, Alemanha631942-2
Banho de sonicaçãoLimpador ultrassónico VWR; VWR, Radnor, Pa142-6044230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen by ThermoFisherP36930
InCell Analyzer 2000 (scanner de fluorescência)GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa29027886
Arium Pro VF - água ultrapura - H2OMilliQ Millipore87206462
Lâminas microscópicas - Câmaras de cultura de tecidos (1 poço)Sarstedt94.6140.102
1-well em Lumox destacávelSarstedt94.6150.101
Aço Inoxidável - lâminas cirúrgicas Tubo deSwann-Morton311
Tygon, 1/8"ID x 1/4"ODCole-ParmerEW-95702-06 Faixa detemperatura: – 80 a 200 graus; C
Esterilizar: Com óxido de etileno, irradiação gama, ou autoclave por 30 min, 15 psi de pressão
PharMed BPT TubingSaint-GobainAY242012Autoclavável 30 min a 121° Tubulação C
Tygon LMT-55Saint Gobain Performance Plastics™
termostatoBMG BIOMEDIZINTECHNIK300-0042230V, 90VA, 50Hz
Silicone 15312022

Referências

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  1. Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
  2. Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
  3. Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
  4. Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
  5. Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
  6. Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
  7. Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
  8. Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
  9. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
  10. Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
  11. Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
  12. Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
  13. Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
  14. Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
  15. Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
  16. Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
  17. Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
  18. Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
  19. Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).

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