Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.
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Artigo de método
Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudos recentes de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios da substância gelatinosa (SG) forneceram uma grande quantidade de informações sobre os mecanismos da coluna vertebral subjacente a transmissão sensorial nociceptivo regulamento e desenvolvimento de dor ou coceira crônico. Implementações de gravações eletrofisiológicas juntamente com estudos morfológicos, baseados sobre a utilidade das fatias aguda da medula espinhal têm melhorado ainda mais nossa compreensão das propriedades neuronais e a composição dos circuitos locais em SG. Aqui, apresentamos um guia detalhado e prático para a preparação de fatias da medula espinhal e show de gravação de células inteiras representativa e resultados morfológicos. Este protocolo permite preservação neuronal ideal e pode imitar condições na vivo até certo ponto. Em resumo, a capacidade de obter uma preparação em vitro de medula espinhal fatias permite gravações de braçadeira da tensão e corrente estável e assim poderia facilitar investigações detalhadas sobre as propriedades intrínsecas da membrana, circuitos locais e estrutura neuronal usando diversas abordagens experimentais.
Introdução
A substância gelatinosa (SG, lâmina II do Corno dorsal da coluna vertebral) é um centro de retransmissão indiscutivelmente importante para transmitir e regulamenta a informação sensorial. É composto por interneurônios excitatórios e inibitórios, que recebem entradas das fibras aferentes primárias, interneurônios locais e a endógena de sistema inibitório descendente1. Nas últimas décadas, o desenvolvimento da preparação de fatia aguda da medula espinhal e o advento da gravação de células inteiras remendo-braçadeira permitiram que vários estudos sobre as propriedades intrínsecas eletrofisiológicos e morfológicos da SG neurônios2....
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Protocolo
Todos os protocolos experimentais descritos foram aprovados pela Animal ética Comissão de Nanchang University (Nanchang, China PR, ética No.2017-010). Foram envidados todos os esforços para minimizar o estresse e a dor dos animais experimentais. As gravações eletrofisiológicas realizadas aqui foram realizadas à temperatura ambiente (RT, 22-25 ° C).
1. os animais
- Use ratos Sprague-Dawley (3-5 semanas de idade) de ambos os sexos. Os animais sob um ciclo claro-escuro de 12 h de casa e dar-lhes acesso ad libitum à água e alimentação adequada.
2. preparação de soluções e materiais
- So....
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Resultados
Aguda da medula espinhal fatias foram preparadas de acordo com o diagrama mostrado na Figura 1. Após corte e recuperação, uma fatia de medula espinhal foi transferida para a câmara de gravação. Os neurônios saudáveis foram identificados com base na soma de aparência usando microscopia IR-DIC. Em seguida, os potenciais de ação dos neurônios SG foram eliciados por uma série de despolarizar pulsos de corrente (1 s duração) quando os neurônios foram realizados na.......
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Discussão
Este protocolo detalha as etapas para a preparação de fatias da medula espinhal, que usamos com sucesso ao realizar experimentos de células inteiras remendo-braçadeira na SG neurônios18,19,20,21. Ao implementar esse método, nós informou recentemente que a minociclina, uma segunda geração de tetraciclina, marcadamente poderia reforçar a transmissão sináptica inibitória através de um mecanismo pr.......
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Divulgações
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81560198, 31660289).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | Usado para a preparação de ACSF e PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Usado para a preparação de ACSF, sacarose-ACSF e solução intracelular à base de K+ |
| NaH2PO4· 2H2O | Sigma | 71500 | Usado para a preparação de ACSF, sacarose-ACSF e PBS |
| CaCl2· 2H2O | Sigma | C5080 | Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF |
| MgCl2· 6H2O | Sigma | M2670 | Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Usado para a preparação de ACSF |
| Ácido ascórbico | Sigma | P5280 | Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF |
| Piruvato de sódio | Sigma | A7631 | Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF |
| Sacarose | Sigma | S7903 | Usado para a preparação de sacarose-ACSF |
| K-gluconato | Wako | 169-11835 | Usado para a preparação de solução intracelular à base de K+ |
| Na2-fosfocreatina | Sigma | P1937 | Usado para a preparação de solução intracelular |
| EGTA | Sigma | E3889 | Usado para a preparação de solução intracelular |
| HEPES | Sigma | H4034 | Usado para a preparação de solução intracelular |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Usado para a preparação de solução intracelular |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Usado para a preparação de solução intracelular |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Usado para a preparação de solução intracelular à base de Cs+ |
| CsCl | Sigma | C3011 | Usado para a preparação de solução intracelular à base de Cs+ |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Usado para a preparação de soluções intracelulares à base de Cs+ solução |
| Neurobiotina 488 | Vector | SP-1145 | 0,05% neurobiotina 488 pode ser usado para estudos morfológicos |
| Ágar | Sigma | A7002 | 3% bloco de ágar foi usado em nosso protocolo |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | 4% paraformaldeído foi usado para processamento imuno-histoquímico |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagentes | usados para a preparação do | |
| meio de lamínula de montagem | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1,5 g/kg, i.p. |
| Capilares de vidro borossilicato | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1,5 mm OD, 1,12 mm ID |
| Extrator de micropipetas | Sutter Instrument | P-97 | Usado para a preparação de micropipetas |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Mesa de isolamento de vibração | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Câmera | CCD infravermelhaDage-MIT | IR-1000 | |
| Amplificador de braçadeira de remendo | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulador | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y estágio | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Microscópio vertical | Olympus | BX51WI | |
| Osmômetro | Avançado | FISKE 210 | |
| medidor de PH | Mettler Microscópio Confocol Toledo | FE20 | |
| Zeiss | LSM 700 |
Referências
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gela....
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Reimpressões e permissões
