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Artigo de método

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

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DOI:

10.3791/58479

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18 de janeiro de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 2Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 3Center for Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Nanchang University

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.

Resumo

Estudos recentes de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios da substância gelatinosa (SG) forneceram uma grande quantidade de informações sobre os mecanismos da coluna vertebral subjacente a transmissão sensorial nociceptivo regulamento e desenvolvimento de dor ou coceira crônico. Implementações de gravações eletrofisiológicas juntamente com estudos morfológicos, baseados sobre a utilidade das fatias aguda da medula espinhal têm melhorado ainda mais nossa compreensão das propriedades neuronais e a composição dos circuitos locais em SG. Aqui, apresentamos um guia detalhado e prático para a preparação de fatias da medula espinhal e show de gravação de células inteiras representativa e resultados morfológicos. Este protocolo permite preservação neuronal ideal e pode imitar condições na vivo até certo ponto. Em resumo, a capacidade de obter uma preparação em vitro de medula espinhal fatias permite gravações de braçadeira da tensão e corrente estável e assim poderia facilitar investigações detalhadas sobre as propriedades intrínsecas da membrana, circuitos locais e estrutura neuronal usando diversas abordagens experimentais.

Introdução

A substância gelatinosa (SG, lâmina II do Corno dorsal da coluna vertebral) é um centro de retransmissão indiscutivelmente importante para transmitir e regulamenta a informação sensorial. É composto por interneurônios excitatórios e inibitórios, que recebem entradas das fibras aferentes primárias, interneurônios locais e a endógena de sistema inibitório descendente1. Nas últimas décadas, o desenvolvimento da preparação de fatia aguda da medula espinhal e o advento da gravação de células inteiras remendo-braçadeira permitiram que vários estudos sobre as propriedades intrínsecas eletrofisiológicos e morfológicos da SG neurônios2, 3 , 4 , bem como estudos os circuitos locais em SG5,6. Além disso, usando a preparação de fatia de medula espinhal em vitro , pesquisadores podem interpretar as mudanças no neuronal excitabilities7,8, a função do íon canais9,10, e atividades sinápticas11,12 , sob várias condições patológicas. Estes estudos têm aprofundado nossa compreensão do papel que os neurônios SG desempenham no desenvolvimento e manutenção da dor crônica e coceira neuropática.

Essencialmente, o pré-requisito fundamental para alcançar uma clara visualização da soma neuronal e ideal de células inteiras remendo usando fatias aguda da medula espinhal é para garantir a qualidade excelente de fatias então neurônios saudáveis e patchable podem ser obtidos. No entanto, preparar fatias de medula espinhal envolve várias etapas, como realizando uma laminectomia ventral e remoção da membrana pia-aracnoide, que pode ser obstáculos na obtenção de fatias saudáveis. Embora não seja fácil preparar fatias da medula espinhal, realizar gravações em vitro na medula espinhal fatias tem várias vantagens. Em comparação com preparações da cultura de pilha, fatias da medula espinhal podem preservar parcialmente inerentes conexões sinápticas que estão em uma condição fisiologicamente relevante. Além disso, a célula inteira remendo-braçadeira gravação usando fatias de medula espinhal poderia ser combinado com outras técnicas, tais como remendo duplo grampo13,14, estudos morfológicos15,16 e célula única RT-PCR 17. portanto, esta técnica fornece mais informações sobre caracterizando as diversidades genéticas e anatômicas em uma região específica e permite a investigação da composição do circuito local.

Aqui, nós fornecemos uma descrição básica e detalhada do nosso método para preparar fatias aguda da medula espinhal e adquirir as gravações de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios SG.

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Protocolo

Todos os protocolos experimentais descritos foram aprovados pela Animal ética Comissão de Nanchang University (Nanchang, China PR, ética No.2017-010). Foram envidados todos os esforços para minimizar o estresse e a dor dos animais experimentais. As gravações eletrofisiológicas realizadas aqui foram realizadas à temperatura ambiente (RT, 22-25 ° C).

1. os animais

  1. Use ratos Sprague-Dawley (3-5 semanas de idade) de ambos os sexos. Os animais sob um ciclo claro-escuro de 12 h de casa e dar-lhes acesso ad libitum à água e alimentação adequada.

2. preparação de soluções e materiais

  1. Soluções
    1. Preparar artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) (em mM): NaCl 117, 3.6 KCl, 1.2 NaH2PO4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glicose, ácido ascórbico 0,4 e 2 piruvato de sódio. Consulte a tabela 1.
    2. Prepare-se sacarose-ACSF (em mM): 240 sacarose, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3.5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, o ácido ascórbico 0,4 e piruvato de sódio 2. Consulte a tabela 2.
    3. Preparar o K+-baseado solução intracelular (em mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 at2-fosfocreatina, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP e 0,3 Li-GTP. Consulte a tabela 3.
    4. Preparar o Cs+-baseado solução intracelular (em mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 at2-fosfocreatina, 5 tetraethylammonium (TEA) - Cl 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP e 0,3 Li-GTP. Consulte a tabela 4.
      Nota: Todas as soluções devem ser preparadas usando água destilada. ACSF e sacarose-ACSF devem ser carbogenated (95% O2 e 5% CO2 mistura) antes da sua utilização para manter um pH ideal de aproximadamente 7.4, e a osmolalidade destas duas soluções deve ser ajustada para 300-310 mOsm. Porque o ácido ascórbico pode afetar canais de cálcio, este agente deve ser omitido se uma gostaria de gravar as correntes de cálcio. A osmolalidade e o pH intracelular soluções devem ser medidos e ajustados para 290 – 300 mOsm e 7.2 – 7,3, respectivamente. Recomenda-se filtrar as soluções intracelulares com 0,2 µm filtros e armazenar as soluções como alíquotas de 1ml a-20 ° C. Cs+ e chá são aplicadas no Cs+-baseado intracelular solução para bloquear canal de potássio, que é propício para utilizar o amplificador que têm o potencial de membrana constante em 0 mV durante a gravação de correntes pós-sináptico inibitórias (IPSCs).
    5. Prepare a solução de neurobiotin 488 de 0,05%. Dissolver 2 mg de neurobiotin 488 em 4 mL de K+-baseado solução intracelular e ajustar a pressão osmótica de 290 – 300 mOsm usando água destilada ou sacarose se necessário.
      Nota: 1 mM de sacarose aumenta a osmolaridade por 1 mOsm.
    6. Prepare-se 3% de ágar como um bloco para a medula espinhal. Dissolver a 7,5 g de ágar-ágar em 250 mL de água filtrada num copo de vidro e então use um microondas para esquentar até ferver e limpar. Agitar a solução e despeje a mistura em um 17,5 x 10,5 cm x 1.8 cm plástico caixa solidificação depois. Manter o ágar a 4 ° C antes de usar.
    7. Prepare-se para o processamento de imuno-histoquímica paraformaldeído 4% (PFA). Mix 40 g de pó PFA para ~ 800 mL de aquecido (aproximadamente 60 ° C) 1 x solução de PBS (130 mM de NaCl, 7mm Na2HPO4, 3mm NaH2PO4). Lentamente, ajuste o pH adicionando gotas de NaOH N 1 até pó PFA é completamente dissolvido. Uma vez que a solução tornou-se claro, ajuste o volume total de 1 L com PBS 1x. Reajuste o pH para 7,2-7,4 usando 1 N HCl, quando necessário, em seguida, filtrar a solução PFA 4% e armazená-lo a-20 ° C até o uso.
      Nota: PFA é tóxico, portanto é necessário usar máscaras, luvas, bem como óculos de segurança. Conduzir o processo de preparação 4% PFA dentro de uma campânula ventilada. Pó PFA pode ser completamente dissolvido em um pH de aproximadamente 9-10.
  2. Instrumentos
    1. Para um sistema típico eletrofisiológico, usar um microscópio vertical equipado com contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) e um objectivo de imersão de água de alta resolução, uma câmera CCD/CMOS, um amplificador de remendo-braçadeira, titular de uma micropipeta e um micromanipulador permitindo o ajuste fino da posição da pipeta. Numa fase XY é igualmente necessária para mover o microscópio.
    2. Monte todo o equipamento sobre uma mesa de isolamento de vibração rodeado por uma gaiola de Faraday. Conecte um monitor de vídeo da câmera de vídeo para observar os neurônios e visualizar as micropipetas.
  3. Micropipetas
    1. Fazer gravação eletrodos de capilares de vidro de borosilicato usando um extrator da micropipeta. A pipeta típica resistência varia MΩ 3-6 quando preenchido com solução intracelular.
  4. Bloco de ágar
    1. Prepare um 1,2 x 1,5 cm x bloco de ágar 2,0 cm. Apare o bloco nas formas mostradas na Figura 1 conforme necessário.

3. aguda da medula espinhal fatia preparação

Nota: Fatias de medula espinhal transversal ou parassagital são preparadas como anteriormente descrito18,19,20.

  1. Antes da perfusão transcardial e extração de medula espinhal, preparar ~ 500 mL sacarose-ACSF incubado com 95% O2 e 5% de CO2 e esfriar a solução gelada (0 – 4 ° C).
  2. Refrigerar para baixo todas as ferramentas de dissecação (por exemplo, dissecando a tesoura, tesoura de íris, fórceps dentado, pinça fina, pinça curvada) no gelo. O diagrama da preparação de fatia aguda da medula espinhal é mostrado na Figura 1.
  3. Transcardial perfusão
    1. Após uma única injeção (intraperitoneal, i.p.) de uretano (1,5 g/kg), aguardar 2-3 min e avaliar a profundidade de anestesia de ratos através do teste do dedo do pé ou cauda pitada de respostas. Uma vez que um avião cirúrgico da anestesia é mantido, coloque o rato sobre gelo picado na posição supina.
      Nota: Para produzir o suficiente para a não-percepção da dor profunda anestesia durante a toracotomia, siga seu local IACUC.
    2. Fazer uma incisão (3 – 4 cm), através da pele do processo xifoide à clavícula e em seguida, faça uma incisão transversal abaixo do nível do processo xifoide.
    3. Segure e levante o apêndice xifoide com um par de pinças curvas para expor o diafragma completamente. Faça uma incisão transversal através do diafragma e então atravessar a caixa torácica, entre o esterno e as costelas bilateralmente para abrir a cavidade torácica. Use a pinça curvada para compreender o processo xifoide, então a caixa torácica é fixo, e o coração é suficientemente exposto.
    4. Mantenha o coração com outra pinça curva suavemente e em seguida, inserir uma agulha 22g através do ventrículo esquerdo para a base do arco aórtico.
    5. Corte o átrio direito com uma tesoura bem imediatamente e em seguida, iniciar a perfusão de sacarose-ACSF gelada, oxigenado através de um sistema de gravidade.
      Nota: Transcardial rápida e suficiente perfusão com sacarose-ACSF gelada pode facilitar a refrigeração rápida da medula espinhal, enquanto baixa concentração de sódio e cálcio pode ajudar a aliviar a toxicidade excitatória e proteger a função neuronal. Além disso, limpar as células vermelhas do sangue seria benéfica para reduzir a coloração de fundo de biocytin ao realizar um estudo morfológico. A perfusão é considerado suficiente e satisfeito enquanto o fluido sair do átrio direito é claro e a cor de fígado de rato e patas é pálida. A ponta da agulha 22g deve ser brusco para evitar a ruptura do coração e do arco aórtico.
  4. Medula espinhal dissecação e corte
    1. Faça uma incisão longitudinal (5 cm) na pele volta de caudal para rostral, em seguida, corte em ambos os lados do estado de perfusão através da caixa torácica entre a coluna vertebral e costelas.
    2. Fazer um corte na extremidade caudal da coluna vertebral, use tesouras para cortar tecidos circunvizinhos e isolar o segmento lombossacral da coluna vertebral rapidamente.
    3. Transferi o segmento lombossacral para um prato de vidro contendo gelada ACSF baseados em sacarose. Com o lado ventral para cima, use tesoura fina para cortar pedículo vertebral bilateralmente e expor a medula espinhal cuidadosamente. Isolar um 2-cm longo medular com alargamento lombossacral (L1 – S3) e transferir a secção da coluna vertebral para um outro prato de vidro cheio de sacarose-ACSF frio.
    4. Remova as meninges e a membrana aracnoide pia sob um microscópio de dissecação. Corte todos os ventrais e dorsais raízes tão rapidamente quanto possível.
    5. Coloque a medula espinhal em um bloco de ágar previamente aparadas. Para preparar fatias transversais, anexar o lado ventral da medula espinhal para o ágar e deixe o lado dorsal em direcção à lâmina. Para preparar fatias parasagital, anexe o lado ventral com supercola para o ágar-ágar em uma direção vertical conforme mostrado na Figura 1. Em seguida, monte o bloco de ágar para uma plataforma de um vibratome com super cola. Prepare-se 300 – 500 µm transversal ou parassagital fatias com uma velocidade de avanço de 0.025 mm/s e uma frequência de vibração de 80 Hz.
    6. Use uma pipeta plástica-aparado para transferir as fatias no engranzamento de nylon em uma câmara de armazenamento contendo ACSF continuamente oxigenado a 32 ° C, durante pelo menos 30 minutos antes da gravação.
      Nota: tenha cuidado para evitar a lesão da medula espinhal, especialmente o corno dorsal, quando removendo as meninges e as raízes da coluna vertebral. A medula espinhal deve ser fatiada dorso-ventralmente. Para os melhores resultados, as fatias devem estar preparadas rapidamente (dentro de 15-20 min). A espessura de uma fatia da coluna vertebral deve ser não mais de 600 µm para satisfazer a visibilidade da célula. Além disso, a técnica descrita acima pode ser usada para obter fatias na coluna horizontais.

4. células inteiras Patch-clamp gravações

  1. Para realizar as gravações de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios SG, use K+-baseado intracelular solução para a maioria dos casos de gravação, enquanto aplica o Cs+-baseado solução apenas para a gravação das correntes pós-sináptico inibitórias.
  2. Movimente suavemente uma fatia da medula espinhal para a câmara de gravação e então manter ele com um fio de platina em U anexado com fios de nylon firmemente para fatia óptima estabilidade. Firmemente perfundir a fatia com ACSF borbulhado em RT, através de um sistema de gravidade e definir a taxa de perfusão em 2 – 4 mL/min para alcançar a oxigenação suficiente.
  3. Identificar a região de SG (uma banda translúcida), usando uma lente do microscópio de baixa resolução, escolher um neurônio saudável usando o objectivo de alta resolução como a célula-alvo e ajustá-lo para o centro da tela do monitor de vídeo.
  4. Encha uma micropipeta com um volume adequado de K+-baseado ou Cs+-solução intracelular de base, conforme necessário, insira a micropipeta o eléctrodo e certifique-se de que a solução intracelular está em contacto com o fio de prata dentro o titular.
  5. Focar a micropipeta e mergulhá-lo na ACSF usando um micromanipulador e em seguida, aplique uma leve pressão positiva (~ 1 psi quando medido com um manômetro) para forçar a micropipeta longe de toda a sujeira e detritos.
  6. Mova a micropipeta para o neurônio alvo gradualmente. Libera a pressão positiva, uma vez que a pipeta aproxima-se o neurônio e formar uma pequena covinha na membrana neuronal para formar um gigaseal.
  7. Alterar a exploração potencial de -70 mV, que está perto o fisiológico descansando o potencial de membrana (RMP) de uma célula. Em seguida, aplica uma sucção suave e transitória para a micropipeta para romper a membrana e criar uma boa configuração de células inteiras.
    Nota: Após a transferência a fatia na câmara de gravação, certifique-se de perfusão constante pelo menos 5 min limpar os escombros na superfície de fatia. É interessante notar que a capacidade de distinguir entre os neurônios saudáveis e insalubres/mortos é de suma importância para boa selagem e gravação estável. Um neurônio insalubres/mortos tem uma aparência inchada ou encolhida, juntamente com um grande núcleo visível, enquanto um neurônio saudável é caracterizado por uma forma de (3D) 3-dimensional com uma membrana Lisa e brilhante, e seu núcleo é invisível. Para obter uma configuração de células inteiras, é essencial para compensar a capacitância rápida ou lenta passo a passo quando necessário. No RT, a potencial de junção líquida é calculada para ser 15.1 – 15,2 mV e 4.3 – 4,4 mV em K+-baseado e Cs+-solução baseada em intracelular, respectivamente. Em nossos estudos, os dados gravados não foram corrigidos para o potencial de junção líquida.
  8. Gravações de propriedades intrínsecas da membrana
    1. Gravar propriedades passivas da membrana intrínseca: RMP registro imediatamente (dentro de 20 s) após a pausa em. Determine a resistência de entrada neuronal, medindo a resposta de tensão de uma corrente despolarizantes (10 pA, 500 ms) em RMP em modo de corrente-braçadeira.
    2. Registro de propriedades de queima: teste padrão de cada neurônio disparar em corrente-braçadeira com uma série de 1 s despolarizantes pulsos de corrente (25-150 pA com incremento de 25 pA) no RMP. Medir o limite, amplitude e meia largura de uma única ação potencial off-line.
    3. Gravar a corrente abaixo do limite: para avaliar as correntes somáticas abaixo do limite, segurar a membrana potencial em -50 mV no modo de tensão-braçadeira. Em seguida, aplicar uma série de hiperpolarização pulsos de tensão de 1 duração de s de -60 mV a -120 mV, com um decréscimo de 10 mV.
    4. Gravar as correntes pós-sináptico excitatórias (EPSCs): EPSCs de registro com o K+-baseado solução intracelular no modo de tensão-braçadeira com um potencial de exploração de -70 mV.
    5. IPSCs registros: Aplicar Cs+-intracelular solução para gravação de IPSCs base. Uma vez que a configuração de célula inteira é estabelecida, têm a membrana potencial de em -70 mV para ~ 5 min e em seguida, altere a exploração potencial para 0 mV gradualmente. Aguarde alguns minutos para estabilização e então começar a registrar os eventos IPSC.
      Nota: Apenas os neurônios com uma RMP inferior a-50 mV e mostrando superação devem ser selecionados para um estudo mais aprofundado. As resistências de série em nosso estudo são tipicamente 10-30 MΩ, e uma gravação deve ser excluída, uma vez que a resistência série muda por mais de 20%. EPSCs podem ser confirmadas com uma aplicação de banho da APV de 50 µM e 20 µM CNQX, enquanto IPSCs podem ser confirmadas com 10 prosencefálico µM e 1 µM estricnina.

5. morfológico estudo

  1. Para experiências morfológicas, usar um K+-baseado intracelular solução contendo 0.05% neurobiotin 488.
  2. Depois de manter um estábulo eletrofisiológicos de gravação pelo menos 20 min, retire lentamente a micropipeta na direção ascendente para permitir que a membrana celular selar e transferir a fatia da medula espinhal para um recipiente com 4% PFA. Corrigir as fatias em 4% PFA RT por 1h e depois a 4° C durante a noite.
  3. Lave as fatias em PBS e em seguida mergulhe-os em etanol a 50% por 30 min. Após mais três lavagens em PBS, monte as fatias em sua espessura original para slides com um meio de montagem.
  4. Usar um microscópio confocal (ver Tabela de materiais) para a aquisição de imagem e reconstrução 3D neuronal. Digitalize os neurônios através de uma lente X 20 com uma pilha de 1,5 µm z.

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Resultados

Aguda da medula espinhal fatias foram preparadas de acordo com o diagrama mostrado na Figura 1. Após corte e recuperação, uma fatia de medula espinhal foi transferida para a câmara de gravação. Os neurônios saudáveis foram identificados com base na soma de aparência usando microscopia IR-DIC. Em seguida, os potenciais de ação dos neurônios SG foram eliciados por uma série de despolarizar pulsos de corrente (1 s duração) quando os neurônios foram realizados na...

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Discussão

Este protocolo detalha as etapas para a preparação de fatias da medula espinhal, que usamos com sucesso ao realizar experimentos de células inteiras remendo-braçadeira na SG neurônios18,19,20,21. Ao implementar esse método, nós informou recentemente que a minociclina, uma segunda geração de tetraciclina, marcadamente poderia reforçar a transmissão sináptica inibitória através de um mecanismo pr...

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Divulgações

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81560198, 31660289).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NaClSigmaS7653Usado para a preparação de ACSF e PBS
KClSigma60130Usado para a preparação de ACSF, sacarose-ACSF e solução intracelular à base de K+
NaH2PO4· 2H2OSigma71500Usado para a preparação de ACSF, sacarose-ACSF e PBS
CaCl2· 2H2OSigmaC5080Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
MgCl2· 6H2OSigmaM2670Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
NaHCO3SigmaS5761Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
D-GlucoseSigmaG7021Usado para a preparação de ACSF
Ácido ascórbicoSigmaP5280Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
Piruvato de sódioSigmaA7631Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
SacaroseSigmaS7903Usado para a preparação de sacarose-ACSF
K-gluconatoWako169-11835Usado para a preparação de solução intracelular à base de K+
Na2-fosfocreatinaSigmaP1937Usado para a preparação de solução intracelular
EGTASigmaE3889Usado para a preparação de solução intracelular
HEPESSigmaH4034Usado para a preparação de solução intracelular
Mg-ATPSigmaA9187Usado para a preparação de solução intracelular
Li-GTPSigmaG5884Usado para a preparação de solução intracelular
CsMeSO4SigmaC1426Usado para a preparação de solução intracelular à base de Cs+
CsClSigmaC3011Usado para a preparação de solução intracelular à base de Cs+
TEA-ClSigmaT2265Usado para a preparação de soluções intracelulares à base de Cs+ solução
Neurobiotina 488VectorSP-11450,05% neurobiotina 488 pode ser usado para estudos morfológicos
ÁgarSigmaA70023% bloco de ágar foi usado em nosso protocolo
ParaformaldeídoSigmaP61484% paraformaldeído foi usado para processamento imuno-histoquímico
Na2HPO4Hengxing Chemical Reagentesusados para a preparação do
meio de lamínula de montagemPolyscience18606
UrethanNational Institute for Food and Drug Control301912281,5 g/kg, i.p.
Capilares de vidro borossilicatoWorld Precision InstrumentsTW150F-41,5 mm OD, 1,12 mm ID
Extrator de micropipetasSutter InstrumentP-97Usado para a preparação de micropipetas
VibratomeLeicaVT1000S
Mesa de isolamento de vibraçãoTechnical Manufacturing Corporation63544
CâmeraCCD infravermelhaDage-MITIR-1000
Amplificador de braçadeira de remendoHEKAEPC-10
MicromanipuladorSutter InstrumentMP-285
X-Y estágioBurleighGIBRALTAR X-Y
Microscópio verticalOlympusBX51WI
OsmômetroAvançadoFISKE 210
medidor de PHMettler Microscópio Confocol ToledoFE20
ZeissLSM 700
PBS

Referências

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