Novos métodos para a Administração Intranasal sob anestesia por inalação para avaliar a entrega da droga de nariz-de-Brain

Resumo

Aqui, descrevemos dois métodos novos da administração intranasal estável sob anestesia por inalação com o mínimo de estresse físico para animais experimentais. Podemos também descrever um método de avaliação quantitativa dos níveis de distribuição de drogas no cérebro através da via de nariz-de-cérebro usando radiolabeled [¹⁴C]-inulina como um substrato de modelo de macromoléculas solúveis em água.

Resumo

Administração intranasal foi relatada para ser um potencial caminho para entrega de nariz-de-cérebro de agentes terapêuticos que contorna a barreira sangue - cérebro. No entanto, tem havido alguns relatos a respeito não só a análise quantitativa, mas também as condições ideais de administração e dosagem de regimes para investigações de entrega de nariz-de-cérebro. O progresso limitado na investigação sobre os mecanismos de nariz-de-cérebro via usando roedores representa um entrave significativo em termos de concepção de sistemas de entrega nariz-de-cérebro para drogas de candidato.

Para ganhar alguns progressos nesse sentido, desenvolvemos e avaliados dois métodos novos da administração intranasal estável sob anestesia por inalação para animais experimentais. Podemos também descrever um método de avaliação dos níveis de distribuição de drogas no cérebro através da via de nariz-de-cérebro usando rádio-rotulado [¹⁴C]-inulina (peso molecular: 5.000) como um substrato de modelo de macromoléculas solúveis em água.

Inicialmente, desenvolvemos um protocolo de administração intranasal baseada em pipeta usando máscaras temporariamente openable, que nos permitiram realizar administração fiável para animais sob anestesia estável. Usando este sistema, [¹⁴C]-inulina pôde ser entregue ao cérebro com pequeno erro experimental.

Posteriormente foi desenvolvido um protocolo de administração intranasal que impliquem reversa canulação do lado das vias aéreas através do esôfago, que foi desenvolvido para minimizar os efeitos de infralateral (MC). Esta técnica levou a níveis significativamente mais elevados de [¹⁴C]-inulina, que foi detectado quantitativamente no bulbo olfatório, cérebro e medula espinhal, que o método de pipeta. Isto parece ser porque a retenção da solução na cavidade nasal de drogas foi substancialmente aumentada pela Administração ativa usando uma bomba de seringa em uma direção oposta a MC na cavidade nasal.

Em conclusão, os dois métodos de administração intranasal, desenvolvido neste estudo podem ser esperados ser técnicas extremamente úteis para avaliar a farmacocinética em roedores. O método de canulação reverso, em particular, poderia ser útil para avaliar o potencial do cérebro-de-nariz entrega de candidatos da droga.

Introdução

Biomedicines como peptídeos e oligonucleotídeos anticorpos são considerados ter potencial aplicação como novos agentes terapêuticos para distúrbios do SNC refratário que atualmente não têm nenhuma terapia curativa. No entanto, porque a maioria dos biomedicines são macromoléculas solúveis em água, a entrega do sangue para o cérebro através de administração intravenosa ou oral é extremamente difícil devido à impedância da barreira hemato - encefálica (BBB).

Nos últimos anos, a administração intranasal tem sido relatada para ser um potencial caminho para entrega de nariz-de-cérebro de agentes terapêuticos que evita o BBB^1,2,3,4,5. No entanto, há relativamente poucos relatos em relação à análise quantitativa de nariz-de-cérebro via entrega⁶. Além disso, não tem havido relatos virtualmente na administração ideal estabelecido condições e regimes de dosagens, tais como volume, vezes, períodos de tempo e velocidade, para investigações de entrega de nariz-de-cérebro. As irregularidades acima mencionadas podem ser atribuídas às seguintes razões: (i) um método ideal de administração intranasal para ratos ainda tem que ser estabelecido, e (ii) intranasal administração pipetando, que geralmente é usada, é tipicamente caracterizada pela variação interindividual entre animais devido à infralateral (MC), desse modo, muitas vezes levando a underestimations do potencial real entrega de nariz-de-cérebro de um determinado medicamento.

Anestesia por inalação utilizando isoflurano (iniciação: 4%, manutenção: 2%) com uma inalação máscara para roedores ganhou uso difundido, com o objectivo de reduzir ou eliminar a dor associada com a cirurgia realizada em animais experimentais. O uso de máscaras torna relativamente simples para executar a administração de drogas típico em animais experimentais sob anestesia por inalação através das rotas subcutâneas, intraperitoneal e intravenosa. No entanto, no caso de administração intranasal, a máscara precisa ser temporariamente retirados os animais para a administração de drogas. Com manutenção abaixo dos 2% isoflurano, animais geralmente acordem rapidamente da anestesia por inalação. Quando o volume de administração por dose é grande, isso pode causar a solução de drogas a fluir da cavidade nasal para o esôfago, e, portanto, a única grande dose pode precisar ser dividido em várias doses menores para a administração intranasal de pequeno animais. Como administração intranasal exige a remoção da máscara para administração repetida e tempo suficiente para a entrega da cavidade nasal sustentado, há uma alta probabilidade de que os ratos iria acordar da anestesia durante o procedimento de administração. Isto torna muito difícil realizar a administração intranasal sob um estado anestésico estável e provavelmente contribui para a variação interindividual observada de nariz-de-cérebro entrega entre roedores.

Neste estudo, portanto, desenvolvemos dois métodos novos da administração intranasal estável sob anestesia por inalação, que impõem o mínimo de estresse físico dos animais experimentais. Para o primeiro método, usamos uma máscara temporariamente openable que permite a administração intranasal durante a anestesia por inalação. A parte openable da máscara incorpora um plug de silicone que pode ser usado em conformidade com o calendário de administração para facilitar a administração intranasal estável, com uma pipeta. Para o segundo método, uma cânula foi inserida cirurgicamente para passar do esôfago na cavidade nasal, e uma bomba de seringa depois foi anexada a este para que a solução da droga pode ser entregue diretamente e confiavelmente na cavidade nasal sob inalação estável anestesia. Esse método pode melhorar a entrega de drogas para o cérebro através da rota de nariz-de-cérebro, porque minimizando substancialmente os efeitos da MC, seria maior droga retentively na cavidade nasal. Além disso, descrevemos um método para avaliar quantitativamente os níveis de distribuição de drogas (% para o cérebro da dose injetada/g) no cérebro usando rádio-rotulado [¹⁴C]-inulina [peso molecular (MW): 5.000] como um substrato de modelo de solúvel em água macromoléculas.

Protocolo

Realizou-se este estudo animal (#AP17P004) em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Comité de uso (Tóquio, Japão) e Universidade de Nihon Animal conta. Este estudo (#17-0001) foi aprovado pelo centro de radioisótopos da escola de farmácia da Universidade de Nihon.

1. os animais utilizados para a Administração Intranasal sob anestesia por inalação

1. Abrigar os ratos experimentais em gaiolas de aço inoxidável sob um ciclo de luz/escuro de 12 h (luz em 08:00 – 20:00), com uma temperatura controlada, mantida a 23 ± 1 ° C, umidade de 50% ± 10% e ad libitum acesso à comida e água.
2. Antes da experimentação, anestesia os ratos através de inalação de 2% de isoflurano, seguir a iniciação em uma concentração de 4%. Confirme o nível exigido de anesthetization verificando o desaparecimento de superfície corrigindo.

2. preparação da solução de administração

1. Preparar uma solução de administração de [¹⁴C]-inulina (50 μM, μCi/mL 0,5 por rato) diluindo em tampão fosfato salino e armazenar a 4 ° C até o uso.

3. intranasais administrações para ratos

1. Método de micropipeta usando uma máscara de inalação temporariamente openable (Figura 1)
   Nota: Esta técnica é uma modificação do protocolo de administração intranasal utilizando uma micropipeta estabelecida por Frey et al ³
   1. Corrigi os ratos na posição supina, em um quadro de cortiça gravando seus membros sob anestesia por inalação, com 2% de isoflurano (figura 1A).
   2. Administre um volume total de solução de administração de 25 μL de cada rato em intervalos de 30 s, através de doses de 1 a 2 μL alternativamente administrados nas narinas esquerdas e direita, enquanto os ratos são fixados sob anestesia por inalação (figura 1B e C).
   3. Nota: Resíduos gás anestésico é ser eliminado por meio activo (fumos capô, gabinete de biossegurança duro-dutos, vácuo, etc.), quando a máscara é aberta e por meios passivos (botijão de gás anestésico waste) quando fechado
2. Reverter a canulação m ethod do lado das vias aéreas através do esôfago (Figura 2)
   Nota: Esta técnica é uma modificação do protocolo de absorção intranasal para ratos estabelecido pela Hirai et al ⁷
   1. Corrigi os ratos na posição supina, em um quadro de cortiça gravando seus membros sob anestesia por inalação, com 2% de isoflurano.
   2. Cabelo no pescoço é raspado e preparado através de aplicativo betadine ou clorexidina, seguido de um enxaguamento de álcool.
   3. Expor a traqueia e o esôfago, expandindo a pele abaixo da garganta com fórceps, depois de fazer uma pequena incisão (1,5 cm) com uma tesoura.
   4. Fazer uma incisão (1 mm) na traqueia com uma tesoura.
   5. Introduza uma cânula (diâmetro interno: 0,58 mm, diâmetro exterior: 0,965 milímetros) para um comprimento de 1,2 cm e conectar a extremidade oposta da cânula no interior da máscara inalação.
   6. Fazer uma incisão (1 mm) do esôfago usando a tesoura, introduza uma cânula (diâmetro interno: 0,28 mm, diâmetro exterior: 0,61 mm) a um comprimento de 1,4 cm em direção a parte posterior da cavidade nasal e ligá-lo (Figura 2A e B).
      Nota: Procedimentos 3.2.2 a 3.2.4 foram realizados sob um microscópio estereoscópico na ampliação × 10.
   7. Coloque uma agulha (27 × 1/2) uma seringa de 1 mL preenchida com uma solução de administração e se conectar a uma bomba de microseringa programável.
   8. Conectar-se acima da agulha para a cânula que tinha sido inserida para o esôfago em 3.2.5 (Figura 2).
   9. Administrar um volume total de 25 μL [¹⁴C]-solução de inulina a uma taxa constante (5 µ l/min) (Figura 2 e 2D).

4. quantitativo experimento usando rádio-rotulado de macromoléculas solúveis em água ([¹⁴C]-inulina)

1. Decapitar os ratos experimentais sob anestesia e abrir seus crânios, com uma tesoura e do lado da medulla oblongata, enquanto tendo o cuidado para não danificar o cérebro.
2. Extraia cuidadosamente o cérebro todo por escavar usando uma microespátula de crânio.
3. Lugar um papel de filtro umedecido com solução salina em um prato de Petri que é armazenado no gelo.
4. Coloque o cérebro extraído o papel de filtro umedecido.
5. Limpe o sangue, aderindo à superfície do cérebro com um cotonete humedecido com uma solução salina para eliminar, pelo menos, a influência de [¹⁴C]-inulina no sangue na superfície do cérebro.
6. Dissecar o cérebro rapidamente e dividi-los em três partes: o bulbo olfatório, cérebro e medula espinhal (incluindo o pons).
7. Coloca as amostras de cérebro em solubilizer tecido a 50 ° C, durante 1 h.
8. Adicione 10 μL da coquetel de cintilação líquida para as amostras de cérebro.
9. Transferi uma alíquota de 25 μL da solução de administração dissolvida na cintilação cocktail para um frasco de cintilação para determinar a radioatividade da solução aplicada.
10. Medir as desintegrações por minuto [¹⁴C] radioatividade da amostra do cérebro ([¹⁴C] X_cérebro) e a solução aplicada ([¹⁴C] X_{IN dose}) em um contador de cintilação líquido equipado com um apropriado correção de cruzamento de ³H e ¹⁴C.

5. análise de dados

1. Calcule os droga distribuição níveis (%) da dose injetada (ID %) usando a seguinte equação:
   Cérebro de ⁄g ID % = ([¹⁴C] X_cérebro/ [¹⁴C] X_{em dose}) × 100,
   onde X_cérebro (cérebro de dpm/g) é a quantidade de [¹⁴C] - inulina medido no tecido cerebral e X_{IN dose} (solução de dpm/25 μL) é a concentração do [¹⁴C] - inulina na solução utilizada para a administração intranasal.

Resultados

A Figura 3 mostra o [¹⁴C]-níveis de inulina (ID % ⁄g o cérebro) no bulbo olfatório (A), encéfalo (B) e medula oblongata (C) obtidos utilizando os dois tipos de administração intranasal avaliados no presente estudo. Administração intranasal de entrega método habilitado da pipeta de [¹⁴C]-inulina no cérebro usando máscaras de inalação openable (Figura 1). Sob anestesia por inalação, os resultados quantitativos...

Discussão

A nariz-de-cérebro entrega de drogas deverá ter um efeito pronunciado sobre distúrbios do sistema nervoso central, porque esta via representa uma rota de transporte directo que ignora o BBB. Três diferentes vias de nariz-de-cérebro têm sido relatadas para data⁸. O primeiro é o percurso do nervo olfativo, que passa da mucosa olfativa na mucosa nasal para o cérebro através do nervo olfativo. O segundo é o caminho do nervo trigêmeo, que passa de mucosa respiratória na mucosa nasal até o tronco cerebr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ddY mouse	Japão SLC, Inc.		Masculino, 4-6 semanas, 20-30 g
Isoflurano	Pfizer	v002139
Configuração de isoflurano	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-OTAir, SN-489-4
Máscara de isoflurano	SHINANO manufacturing CO. LTD.		Para pequenos roedores
Máscara de isoflurano (tipo que pode ser aberto)	SHINANO manufacturing CO. LTD.		Pedidos especiais
Caixa de anestesia	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-85-02
Tesouras para experimentos com animais-1	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-27H
Tesouras para experimentos com animais-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	Pinça B-13H-1
	FINE SCIENCE TOOLS Inc.	11272-30	Dumont #7 Dumoxel
Pinças-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	A-12-1
Tubo de cânula (PE-50)	Becton, Dickinson e Companhia.	5069773	I.D.: 0,58 mm, O.D.: 0,965 mm
Tubo de cânula (SP-10)	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	KN-392	I.D.: 0,28 mm, O.D.: 0,61 mm
Máquina de barbear	MARUKAN, LTD.	DC-381
Microscópio estereoscópico	Olympus Corporation	SZ61
Agulha 27G 1/2 in 13 mm	TERUMO CORPORATION	NN-2738R
Seringa de 1 mL	TERUMO CORPORATION	SS-01T
Bomba de seringa	Neuro science	NE-1000
Membrana de celulose	Toyo Roshi Kaisya, Ltd.
Micro espátula	Shimizu Akira Inc.	91-0088
Micropipeta (0,5-10 uL)	Eppendorf AG	Z368083
Chip de pipeta	Eppendorf AG	0030 000.811
Fita	TimeMed Labeling System, Inc.	T-534-R	Para fixação de mouse
[14C]-Inulina	American Radiolabeled Chemicals Inc.	ARC0124A	0,1 mCi/mL
EtOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-00461
Contador de cintilação líquida	Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc	Tri-Carb 4810TR