Artigo de método

Um modelo de cultura primária de células bolsas serosas Ex Vivo frango para estudar a patogênese de doenças infecciosas bolsas serosas vírus

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DOI:

10.3791/58489

⸱

4 de outubro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1The Pirbright Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos o isolamento de células bolsas serosas primário de frango da bursa de Fabricius, a cultura e a infecção das células com o vírus da doença infecciosa bolsas serosas e a quantificação de replicação viral.

Resumo

Vírus da doença infecciosa bolsas serosas (IBDV) é um birnavirus de importância econômica para a indústria de aves de capoeira. O vírus infecta as células B, causando imunossupressão, mortalidade e morbidade nas aves infectadas. Neste estudo, descrevemos o isolamento de células bolsas serosas primário de frango da bursa de Fabricius, a cultura e a infecção das células com IBDV e a quantificação de replicação viral. A adição de ligante CD40 de frango aumentou significativamente a proliferação celular quatro vezes mais de seis dias de cultura e viabilidade celular significativamente melhorada. Duas linhagens de IBDV, uma cultura de células adaptado de estirpe, D78 e uma muito virulenta, UK661, replicado nas culturas de células ex vivo . Este modelo será útil na determinação de como as células respondem à infecção IBDV e permitirão uma redução do número de aves infectadas, usado em estudos de patogenia IBDV. O modelo também pode ser expandido para incluir outros vírus e pode ser aplicado a diferentes espécies de aves.

Introdução

Indústria avícola global é essencial para garantir a comida suficiente para uma expansão da população humana. No entanto, a imunossupressão é a ameaça para a segurança alimentar e do bem-estar das aves afetadas e representa um desafio económico fundamental para a indústria. A maioria dos casos de imunossupressão em galinhas é causada pela infecção com vírus imunossupressores, com os mais responsáveis prejudicando a imunidade adquirida, tendo um tropismo para de linfócitos T e B1. Em aves, a maioria das células B está localizada dentro de um órgão conhecido como a bursa de Fabricius (BF). As células B são suscetíveis à infecção com diversos vírus imunossupressores, incluindo aqueles que causam Lise, tais como IBDV e do Marek vírus da doença (MDV) e aqueles que causam a transformação, tais como o vírus da leucose aviária (ALV) e endothéliose vírus ( REV.).

A fim de desenvolver melhores estratégias para o controle destas infecções, é essencial para caracterizar a interação dos vírus com as células B de frango. No entanto, quando as células B são removidas de um pássaro, não sobrevivem bem em ex vivo cultura2, tornando-se difícil de realizar uma análise aprofundada das interações de IBDV com células de galinha B, ou os primeiros eventos após infecção ALV ou REV. Consequentemente, muitas interações de vírus-célula do hospedeiro têm sido estudados na vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Embora estes estudos são informativos, envolvem o uso de aves infectadas, que sofrem de doenças que podem ser graves.

O ligante CD40 é uma molécula que induz a proliferação de células B11. Após identificação do frango codificação gene CD40L (chCD40L), uma proteína de fusão solúvel foi projetada que, quando adicionado à cultura mídia, induziu a proliferação de frango primária B células ex vivo12. Em 2015, células B cultivadas desta forma foram encontradas suportar a replicação de MDV2 e em 2017, nós e os outros que primário bolsas serosas células estimuladas com chCD40L podem ser usadas como um modelo para estudar IBDV replicação13,14. Aqui, descrevemos o isolamento e cultura de células de bolsas serosas primário de frango, a infecção das células com IBDV e a quantificação de replicação viral. Embora descrevemos o método no contexto do BF, isso poderia ser aplicado a isolar e cultura de células de diferentes órgãos linfoides.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais devem ser eticamente previamente aprovados. Em nossa instituição, todos os procedimentos são realizados de acordo com a lei UK animais (procedimentos científicos) 1986 sob licenças de estabelecimento de Home Office, pessoal e projeto, após a aprovação do bem-estar Animal interno e éticos Review Board (AWERB).

1. preparação da chCD40L

  1. Cultura HEK 293-msCD8-CD40L as células que expressam estàvel um solúvel chCD40L construir em 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% inactivadas pelo calor (Oi) soro fetal bezerro (FCS) e 1 puromicina µ g/mL a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% CO 2.
    Nota: Estas células estão disponíveis do Instituto Pirbright, após a assinatura do acordo de transferência de material apropriado.
  2. Dividi as células em uma densidade de 1:5 Quando confluentes. Recolher o sobrenadante (contendo a construção chCD40L solúvel) cada vez que as células se dividem, centrifugue-a 400 x g por 5 min remover restos celulares e armazená-lo em 4 ° C.
  3. Quando tiverem sido recolhida 500 mL do sobrenadante, o líquido do pool e filtro-esterilize-através de um filtro de 0,2 µm.
  4. Concentre-se o sobrenadante usando concentradores centrífugos de proteína com um peso molecular de corte de 10 K de acordo com as instruções do fabricante. Extrato concentrado líquido sobrenadante de cada coluna, juntar e filtro-sterilize por passagem através de um filtro de seringa 0,22 µm.
  5. Determinar a concentração final deve ser usado em experimentos serialmente, diluindo a solução de chCD40L em 1 x Iscove modificado de Dulbecco médio (IMDM) (descrito no passo 2.4) e cultivo primárias células bolsas serosas, na presença de diluições. Determine a viabilidade de número e porcentagem das células diariamente por até uma semana.
    Nota: A menor concentração onde a proliferação celular e viabilidade são adequados é a concentração para usar no ensaio. É provável que seja entre 01:20 e 01:50.

2. preparação das soluções para isolamento primário de células bolsas serosas de frango

  1. Preparar 1 x solução de salina balanceada de Hanks (HBBS) com cálcio (Ca), adicionando 10 mL de 10 x HBBS com Ca de 90 mL de estéril H2O e 0,47 µ l de 7,5% NaHCO3.
  2. Prepare solução estoque de colagenase D a 8 mg/mL em 1 x HBBS com Ca. filtro-esterilizar a solução através de um filtro de 0,2 µM.
    Nota: É aconselhável preparar alíquotas de 5 mL e congelá-los a-20 ° C.
  3. Preparar 1 x RPMI meio suplementado com 5% Oi FCS. Armazenar a mídia a 4 ° C.
  4. Preparar 1 x 500 mL de IMDM suplementado com 8% Oi FCS, 2% Oi galinha soro, 50mm β-Mercaptoetanol, 50 µ l de insulina-transferrina-Selenito de sódio e 1% penicilina/estreptomicina. Armazenar a mídia a 4 ° C.
    Nota: Prepare todas as soluções acima mencionadas com antecedência.
  5. Prepare 1 x HBBS com Ca. loja a solução no gelo.
  6. Prepare 1 x HBBS sem Ca, adicionando 10 mL de 10 x HBBS sem Ca a 90 mL de estéril H2O, 0,47 µ l de 7,5% NaHCO3e EDTA em uma concentração final de 10 mM. Armazene a solução no gelo.
  7. Prepare 1 x colagenase D solução adicionando 5 mL de solução-mãe de colagenase D a 13 mL de HBBS com Ca tornar-se um total de 18 mL. Armazene a solução no gelo.
    Nota: Prepare as soluções mencionadas nas etapas 2.5 – 2.7 no dia do experimento.

3. remoção da Bursa de Fabricius (BF)

  1. Traseira e hatch galinhas em instalações adequadas, aprovadas e humanamente abate-los em 2-3 semanas de idade.
    Nota: Use métodos aprovados pelo Instituto para abate.
  2. Colete o BF de cada galinha usando técnicas assépticas.
    Nota: Use os protocolos em vigor na instituição.
    1. Coloque a carcaça em prostração dorsal e esterilizar a pele e penas cobrindo o abdômen e o tórax com uma solução de etanol a 70%, diluído em água.
    2. Fazer uma incisão ventral no abdômen inferior usando um bisturi esterilizado ou tesouras.
    3. Localize a bursa de Fabricius, que está ligado à seção caudal do cólon, cranial para a cloaca.
    4. Usando Pinças esterilizadas e tesoura, corte a bursa de Fabricius livre de cólon. Tome cuidado para evitar perfuração do intestino.
  3. Coloque o órgão em PBS frio e transferi-lo para o laboratório no gelo.
    Nota: as células primárias deve ser isolado logo que possível após a colheita de órgãos.

4. isolamento de células bolsas serosas primário de frango

  1. Trabalhando em uma segurança microbiológica do armário, lavar o BF pelo menos 3 x em 30 mL de PBS frio.
  2. Transferir o tecido para um prato de Petri (92 mm de diâmetro, 21 mm de altura) e adicionar 5 mL de solução de colagenase D x 1.
  3. Usando uma tesoura esterilizada ou uma lâmina de bisturi, corte o BF em pedaços com menos de 5 mm de diâmetro.
  4. Incube o tecido a 37 ° C, com agitação suave periódica por 30 min.
    Nota: A solução de colagenase vai começar a digerir o tecido.
  5. Repetidamente, usando uma pipeta Pasteur estéril, Aspire a mistura para incentivar a desintegração do tecido. Se necessário, corte o tecido em pedaços menores.
  6. Adicionar outro 5 mL da solução de D 1 x colagenase no tecido e ele incubar a 37 ° C, com agitação suave periódica por mais 30 minutos.
  7. Repita as etapas de 4.6 e 4.7, até que o tecido é completamente digerido.
    Nota: Haverá pequenos grânulos que não dissolvem-se ainda mais.
  8. Passe a suspensão de células através de um filtro de célula 100 µm em 20 mL de 1 x HBBS sem Ca.
  9. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 400 x g por 5 min.
  10. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 10 mL de 1 x RPMI com FCS 5%.
  11. Ou 10 mL da suspensão celular em cima de 5 mL de mídia de gradiente de densidade que contém diatrizoate polysucrose e de sódio de sobreposição ou subjacência 5ml de mídia gradiente de densidade sob a suspensão de células de 10 mL. Verifique se que há uma interface clara entre os dois.
  12. Centrifugue a sobreposição a 900 x g por 20 min a 4 ° C. Reduzir ou remover a quebra de centrífuga.
    Nota: As células devem formar uma banda na interface entre os meios de comunicação celular e a mídia de gradiente de densidade.
  13. Com uma pipeta Pasteur estéril, remover as células e colocá-los no frio PBS. Lavar as células 3 x por centrifugação-los a 400 x g por 5 min e resuspending-los em PBS frio.

5. cultura de células de bolsas serosas primário de frango

  1. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 400 x g por 5 min e Resuspenda-los em 1 x IMDM completa.
  2. Tomar uma alíquota da suspensão celular, adicioná-lo para uma solução de azul de Trypan e contar o número de células viáveis que excluem o Trypan azul. Determine o número de células e a viabilidade de porcentagem.
  3. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 400 x g por 5 min e Resuspenda-lo em IMDM completo suplementado com um 01:20 diluição de frango CD40L em uma densidade de 1 x 107 células/mL. Titula-se o sobrenadante concentrado contendo o chCD40L para determinar a diluição ideal, que é susceptível de estar no intervalo de 01:10 de 01:50.
  4. Cultura de células em qualquer placas de 96 - ou 24-bem a 37 ° C para placas de 96 poços de fundo U 48-72 h. são preferíveis às placas de fundo chato.
    Nota: As células também podem ser cultivadas em 40 ° C

6. infecção das células bolsas serosas primário de frango com IBDV

  1. 48-72 h pós-isolamento, descongelar uma alíquota do vírus, vórtice a amostra e armazená-lo no gelo.
  2. Ressuspender as células primárias de bolsas serosas, tirar um 10 µ l alíquota da suspensão celular, adicioná-lo a 10 µ l de uma solução de azul de Trypan e determinar o número de células e a viabilidade de porcentagem.
  3. Dilua o vírus em 1 x IMDM completa para a multiplicidade apropriada de infecção (MOI) tornar o vírus inóculo e vortex.
  4. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 400 x g por 5 min.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender as células no inóculo de vírus.
  6. Incube a 37 ° C, durante 1 h com agitação periódica a suspensão de eritrócitos.
  7. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 400 x g por 5 min, retire o inóculo de vírus e lavar as células em 1 x mídia IMDM completa.
  8. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 400 x g por 5 min, retire o sobrenadante e ressuspender as células em meios IMDM completos suplementados com frango CD40L em uma densidade de 1 x 107 células por mL.
  9. Cultura de células em qualquer placas de 96 - ou 24-bem a 37 ° C.
    Nota: As células também podem ser cultivadas em 40 ° C

7. quantificação de IBDV replicação nas células de bolsas serosas primário de frango

  1. No postinfection de tempo-ponto desejado, Ressuspender as células, transferi-los para um tubo apropriado, centrifugá-los a 400 x g durante 5 min e recolher o sobrenadante para titulação do vírus por ensaio de50 TCID conforme o Reed-Muench ou ensaio de placa método15.
  2. Lavar as células em 1 mL de PBS e prepará-los para imunocoloração com um anticorpo específico para IBDV, ou extrair o RNA usando um kit apropriado (seguindo as instruções do fabricante) e executar cadeia de polimerase quantitativa de transcrição reversa reação (RT-qPCR) utilizando primers específicos para um gene IBDV (Forward, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Reversa, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Culturas de células infectadas por simulação devem ser usadas como um controle.

Resultados

Frango primários Bursa células podem ser cultivadas na presença de frango CD40L

Quando células bolsas serosas primário de frango foram cultivadas na presença de chCD40L solúvel, o número de células aumentou quatro vezes de 9,02 x 105 -3.63 x 106 / mL durante um período de 6 dias, ao contrário de quando ele estava ausente (p < 0,05) ( Figura 1A). Viabilidade celular foi também significativamente melhorada, por exemplo de 25% na cultura de pós dia 3 na ausência de chCD40L de 48% na presença de chCD40L (p < 0,05) (figura 1B)13.

Células bolsas serosas primário de frango podem suportar a replicação de ambas as células-cultura adaptado e cepas muito virulentas de IBDV

Culturas de células infectadas por simulação e infectados eram fixas 18 h postinfection, etiquetado com um anticorpo monoclonal contra IBDV VP2 e um anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 e counterstained com DAPI. Células infectadas tinham evidência de fluorescência verde ao redor do núcleo (Figura 2A), consistente com a presença de IBDV no citoplasma. Isso ficou evidente para duas estirpes de IBDV, uma cultura de pilha adaptado estirpe, D78 e muito virulenta, UK661 (Figura 2A). Às 5, 18, 24 e postinfection de 48 h, o RNA foi extraído de culturas infectadas e submetido a RT-qPCR com primers específicos para uma região conservada do gene IBDV VP4. A expressão de VP4 foi primeiro normalizada para o gene domésticas TBP e então expressa como mudança de dobra em relação à simulação amostras em uma análise ΔΔCt. IBDV VP4 expressão aumentada para 16.603 no postinfection de 48 h com D78 e 38.632 cópias no postinfection de 48 h com UK661. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que as células de bolsas serosas primário de frango poderiam suportar a replicação de células-cultura-adaptado e muito virulenta de cepas IBDV13.

figure-results-1
Figura 1: células de bolsas serosas primárias de frango podem ser cultivadas na presença de frango CD40L. Células de bolsas serosas primárias de frango foram cultivadas na presença ou ausência de chCD40L (black barras e barras brancas, respectivamente). (A) o número de células vivas e (B) a percentagem de células viáveis foram determinados em postinfection os pontos de tempo indicado. Os dados mostrados são representativos pelo menos três experimentos replicar, as barras de erro representam o desvio padrão da média e a significância estatística foi determinada utilizando t de uma estudante emparelhados-teste em cada ponto de tempo, * p < 0,05. esta figura foi modificada com a permissão de Dulwich et al 13.

figure-results-2
Figura 2: células de bolsas serosas primárias de frango podem oferecer suporte a replicação de ambos-cultura celular adaptado e cepas muito virulentas de IBDV. (A) células bolsas serosas primárias de frango foram infectados por simulação ou infectadas com D78 ou UK661 e uma amostra de cada cultura foi corrigida, rotulada e criação da imagem: IBDV VP2, verde; núcleos, azuis. Barra de escala = 7 µm. (B) RNA foi extraído em postinfection os pontos de tempo indicado, reverso-transcrito, e uma região conservada do gene IBDV VP4 foi amplificada por PCR quantitativo. A dobra de10 registro alterar em VP4 número de cópia foi normalizado para o gene de limpeza TBP e expressas em relação a amostras infectadas simulação conforme o métodoΔΔCT de–2. Os dados mostrados são representativos pelo menos três experimentos replicar, e as barras de erro representam o desvio padrão da média. Esta figura foi modificada com a permissão de Dulwich et al 13.

Discussão

Neste estudo, descrevemos a cultura bem sucedida de frango primários Bursa células ex vivo na presença de chCD40L solúvel e demonstrar que estas células podem oferecer suporte a replicação de uma estirpe atenuada e uma muito virulenta de IBDV. Este modelo ex vivo pode ser usado para determinar como as células respondem a um IBDV infecção13, que tem vantagens distintas sobre estudos in vivo e in vitro .

Ao colher o BF, é fundamental para não perfurar o intestino a fim de evitar a contaminação bacteriana das bolsas serosas células isoladas. Além disso, é importante isolar as células primárias logo que possível após a colheita de órgãos para limitar a morte celular. A necessidade de usar chCD40L é uma limitação da técnica; no entanto, o trabalho conduzido por Soubies et al mostra que o uso de phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) para prolongar a viabilidade celular bolsas serosas em vez de chCD40L14 pode permitir que o modelo a ser adotado por um maior número de laboratórios. O protocolo descrito acima determina a concentração óptima de chCD40L empiricamente, por cultivo primárias células B em concentrações serialmente diluídas a molécula e observando a proliferação celular e viabilidade. Uma modificação potencial do protocolo pode ser para purificar a molécula de chCD40L e adicionar uma concentração específica para os meios de cultura de células para evitar a variabilidade de lotes.

Estudos in vivo mostraram essa infecção IBDV seguinte, que há um aumento na expressão de genes envolvidos em respostas de citocinas pró-inflamatórias, respostas do tipo I IFN e apoptose na BF5,9,10 . No entanto, após a infecção, há um afluxo de células inflamatórias e as células efetoras T para o BF, que diferem entre si nos genes que expressam em comparação com a população de infectados célula B9. É, portanto, difíceis de interpretar como infectados células respondem ao IBDV. Para resolver isso, alguns grupos de pesquisa têm caracterizado a resposta transcricional de células infectadas com IBDV na cultura16,17,18,19,20. Estes estudos em vitro têm a vantagem de MOIs bem definidas e pontos de tempo postinfection. No entanto, estudos em vitro normalmente foram caracterizados em células de fibroblastos a16,17,20 ou células dendríticas18. Enquanto fornecendo alguns insights sobre interacções célula-IBDV de acolhimento, a crença atual é que a infecção de células B é crucial para a patogênese da IBDV e, portanto, a relevância dos dados não pode ser overinterpreted. Antes da nosso ex vivo celular bolsas serosas cultura modelo, apenas um estudo caracterizara a resposta celular das células B para IBDV infecção19; no entanto, este estudo utilizou uma linhagem de células de B imortalizado que transformava-se devido à infecção com ALV, limitando as conclusões que poderiam ser feitas. Em contraste, o modelo ex vivo de infecção IBDV descrito aqui permite que os pesquisadores manter as vantagens em vitro estudos, tais como definidos MOIs e pontos de tempo, enquanto estudava as interações do vírus com sua pilha de anfitrião relevantes. Como as células primárias de bolsas serosas são obtidas a partir de tecido não infectado de BF, existem não inflamatória ou células T presentes e têm demonstrado pelo fluxo cytometry (usando condições padrão) que, a seguir chCD40L estimulação, 97% da população celular é positivo para o marcador de células B Bu-1 (dados não mostrados). Dado que 3% das células são Bu-1 negativo, será interessante determinar se estas células se tornam infectadas com IBDV e explorar sua expressão gênica e contribuição para a patogênese.

Antecipamos que o modelo de cultura de bolsas serosas primário de células ex vivo frango também pode ser expandido para estudar as interações do vírus-célula de anfitrião de outros vírus de células B tropicais infectar galinhas, como ALV ou REV e também pode ser expandido a outras espécies avícolas ( por exemplo, patos ou perus). A possibilidade de cultura primária de células bolsas serosas ex vivo também abre a possibilidade de estudar aspectos da patogênese e imunossupressão causada por estes vírus sem a necessidade de infectar aves. Como na vivo estudos causam morbidade significativa, isto terá um impacto substancial sobre a substituição, refinamento e redução do uso de animais em pesquisa.

Em resumo, o ex vivo frango primário de células bolsas serosas cultura modelo descrito aqui tem o potencial para expandir a compreensão da B-pilha como aviária tropicais vírus interagirem com as células hospedeiras enquanto reduz o número de aves usados na vivo em estudos de infecção. As técnicas podem ser aplicadas a vários órgãos linfoides, vários vírus e, potencialmente, várias espécies de aves, tornando-se um modelo atraente que pode contribuir para os campos de virologia e Imunologia aviária.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer a equipe de serviços de Animal no Instituto de Pirbright, pela sua competência na incubação, criação e abate de aves e a expertise de Caroline Holt em remover assepticamente a bursa de Fabricius. A.B. é financiado através da biotecnologia e biológicos Sciences Research Council (BBSRC) através de conceder BBS/E/eu/00001845, K.D. é financiado através da BBSRC através de bolsa de estudo BBS/E/eu/00002115, e A.A. é financiado pelo centro nacional para a Substituição, refinamento e redução de animais na pesquisa (NC3Rs) através de concedem NC/R001138/1.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RPMI-1640 MédioMerckR8758-500ML
FBSgibco da Life Technologies10099-141inativar por calor a 56 &graus; C para 1 h
Dicloridrato de PuromicinaThermo Fisher ScientificA1113802
Nalgene Filtro Descartável Estéril de Fluxo Rápido com uma membrana PESThermo Fisher Scientific168-0045
Concentrador de Proteínas Pierce PES (10K MWCO, 20 mL)Thermo Fisher Scientific88528
0.22 µ m Filtro de Seringa Millex-GPMerckF7648
Hanks' Solução Salina Balanceada (HBBS) + CaCl2 + MgCl2gibco por Life Technologies14060-040
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2gibco por Life Technologies14180-046
Etilenodiaminatetracético solução ácida (EDTA)Merck03690-100ML
Meio Dulbecco's Modificado de Iscove (IMDM) (1 X) + GlutaMAXgibco da Life Technologies31980-030
Soro de FrangoMerckC5405-100ML
2-Mercaptoetanol 50 mMgibco da Life Technologies31350-010
Insulina-transferrina-sódio-selenitogibco da Life Tecnologias41400-045
Colagenase DRoche Diagnostics GmbH11088882001
100 µ m Filtro de CélulasCorning431752
Histopaque-1083Merck10831-100ML
Solução Azul de TripanoMerckT8154-20ML
Nunc96 Placas de Micropoços de Fundo Redondo de PoliestirenoThermo Fisher Scientific163320
Falcon Placa de Cultura de Células Multipoços Tratadas com TC de Fundo Plano Transparente de 24 poços, com Tampa,CorningEstéril
Kit Mini RneasyQiagen74104
353047

Referências

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