Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo testado e comprovado para a purificação do cloroplasto complexos de importação de proteínas (complexo de TIC-TOC) usando a torneira-tag. O protocolo de afinidade-isolamento de uma etapa potencialmente pode ser aplicado a qualquer proteína e ser usado para identificar novos parceiros de interação por espectrometria de massa.

Resumo

Biogênese cloroplasto requer a importação de milhares de proteínas codificadas núcleo para o plastídeo. A importação destas proteínas depende do translocon no exterior (TOC) e membranas de cloroplastos internas (TIC). Os complexos TOC e TIC são multiméricas e provavelmente contêm componentes ainda desconhecidos. Um dos principais objetivos no campo é estabelecer o inventário completo de componentes TOC e TIC. Para o isolamento de complexos de TIC-TOC e a identificação de novos componentes, o receptor preprotein que toc159 tem sido modificado N-terminal pela adição da marca de purificação (torneira) de afinidade em tandem resultando em TAP-TOC159. A TAP-tag destina-se a dois passos de purificação da afinidade sequencial (daí "afinidade em tandem"). A TAP-tag usada nestes estudos consiste de um domínio N-terminal IgG-ligação derivado de proteína de Staphylococcus aureus , um (ProtA) seguido por um calmodulina-ligação do peptide (CBP). Entre essas marcas de dois afinidade, um tabaco etch clivagem de protease do vírus (TEV) site foi incluído. Portanto, protease do PEV pode ser usado para a eluição suave de complexos contendo TOC159 após a ligação de IgG grânulos. O protocolo apresentado aqui, a segunda etapa de purificação de calmodulina-afinidade foi omitida. O protocolo de purificação começa com a preparação e solubilização das membranas celulares totais. Após o tratamento de detergente, as proteínas de membrana solubilizado são incubadas com grânulos de IgG para o immunoisolation de torneira-TOC159-contendo complexos. Mediante vinculação e lavagem extensa, TAP-TOC159 contendo complexos são clivados e liberados os grânulos de IgG usando a protease TEV, pelo qual o domínio de S. aureus IgG-ligação é removido. Mancha de isolados ocidental TOC159 contendo complexos podem ser usados para confirmar a presença de proteínas TOC e TIC conhecidas ou suspeitas. Mais importante, os complexos contendo TOC159 têm sido utilizados com sucesso para identificar novos componentes dos complexos TOC e TIC por espectrometria de massa. O protocolo que apresentamos potencialmente permite o isolamento eficiente de qualquer proteína de membrana-limite complexo para ser usado para a identificação dos componentes ainda desconhecidos por espectrometria de massa.

Introdução

As plantas dependem de cloroplastos para fotossíntese e crescimento photoautotrophic¹. A grande maioria das proteínas do cloroplasto é codificada no núcleo, sintetizada no citosol e importada para o cloroplasto através dos complexos TIC e TOC no envelope membranas². O núcleo do complexo do TOC consiste no canal de proteína-realização de Toc75 e dos dois receptores GTPases Toc33 e Toc159^3,4,5. TOC159 é essencial para a biogênese de cloroplastos e Medeia a acumulação maciça de proteínas associadas a fotossíntese⁶. O complexo TIC consiste no canal de proteína-realização de TIC20, bem como TIC110 e TIC40^7,8. Recentemente, uma translocação de proteínas 1MD complexa na membrana interna do envelope foi isolada e continha componentes inéditas⁹, um dos quais era TIC56. Estamos isolados recentemente co TIC56 a 1 MDA complexo usando o protocolo de purificação de afinidade de torneira-TOC159. Os dados indicaram uma sobreposição estrutural entre os complexos TOC/TIC "canônicos" e o 1 complexo MDa¹⁰. Anteriormente desconhecidos componentes como KOC1 também foram identificados como novos parceiros de interação dos TOC e TIC complexos usando o TAP-método descrito aqui^10,11.

Assim, a purificação de torneira-marca é um método eficiente para o isolamento de complexos de proteínas e a identificação de parceiros interagindo por subsequente análise de espectrometria de massa¹². A TAP tag consiste em duas repetições de ligação de IgG separadas um calmodulina-ligação do peptide (CBP) por um tabaco etch local de clivagem de protease de vírus (TEV). O método original, que consiste de uma etapa de purificação de IgG-afinidade seguido por clivagem do PEV e cromatografia de afinidade-calmodulina subsequentes permitido nativa purificação da proteína altamente puro e grandes complexos^13,14 . Nós temos o procedimento simplificado e demonstrou que os complexos de proteína que contêm TOC159 também podem ser purificados com eficiência usando somente a etapa de purificação de IgG-afinidade seguida de TEV-clivagem por eluição¹⁵. Em nossa experiência, a omissão da etapa de calmodulina-afinidade resultou em rendimentos mais elevados e, portanto, pode ser apropriada para proteínas de baixa abundância.

Em suma, temos engenharia transgênica estável a. thaliana linhas expressando TAP-TOC159 no ppi2 (toc159 KO mutante) fundo e estabeleceu como uma fonte confiável para a purificação de complexos de TIC-TOC. O protocolo para o isolamento do complexo TIC-TOC começa com a homogeneização do material vegetal em um buffer livre de detergente. Após a centrifugação, o sobrenadante é Descartado. A pelota que contém a fração do total da membrana é solubilizada usando um buffer contendo detergente. Após uma etapa de ultracentrifugação, o sobrenadante contendo complexos de TIC-TOC solubilizados é aplicado à IgG-resina para purificação da afinidade. Depois de várias etapas de lavagem, eluição é efectuada utilizando um buffer contendo protease TEV para seletivamente cleave a jusante dos domínios de IgG-vinculação e suavemente nativo TOC159 contendo complexos de lançamento. O eluato de PEV pode ser analisado diretamente pela mancha ocidental ou espectrometria de massa para identificar os parceiros de interação de TOC159^10,11,15. O método também tem sido usado para identificar modificações borne-translational de TOC159¹⁵. No futuro, nativo TOC159 contendo complexos podem ser utilizados para estudos estruturais usando microscopia de cryoelectron.

Protocolo

1. preparação das plantas de Arabidopsis

1. Preparar 1 L de metade da força de Murashige e Skoog (MS) médio incluindo vitaminas com 1% de sacarose e ajustar o pH a 5.7 com hidróxido de potássio (KOH). Adicionar 0,8% de phytoagar e autoclave por 20 min a 120 ° C.
2. Despeje 75 mL de meio MS por placa de Petri (diâmetro de 14,5 cm, altura 3 cm) e permitir que a solidificação por 1h.
3. Adicionar 30 mg de Arabidopsis thaliana sementes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e superfície esterilizar com etanol a 70% (v/v) contendo 0,05% (v/v) Triton X-100 por 5 min, seguido por 100% de etanol (v/v) por 10 min. Retire o etanol.
4. Transferi as sementes para o papel de filtro estéril para secar. Polvilhe as sementes esterilizadas uniformemente em uma placa de MS (cada genótipo requer placas de pelo menos 8-10) e cada placa com fita cirúrgica do selo.
5. Incube as placas a 4 ° C durante dois dias no escuro para sincronizar a germinação das sementes. Transferência para uma câmara de crescimento com o seguinte ciclo de luz: 8 h de 120 µmol m^{− 2} s^{− 1} luz e 16 h de dark 22-20 ° c.

2. preparação dos grânulos de HsIgG Agarose

1. Suspender contas de agarose ativada por CNBr (4 g) em 100 mL de HCl de 1 mM e incube por 30 min à temperatura ambiente.
2. Transferir os grânulos de agarose em um filtro de vidro sinterizado, lavar sob vácuo com 100 mL de HCl a 100 mM e repita 2 - 3 vezes.
   Nota: Precool a solução de lavagem de 4 ° C.
3. Ressuspender o grânulos de agarose em 1 mL de HCl frio de 100 milímetros e transferir para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Lavar o filtro de vidro sinterizado com 3 mL de HCl a 100 mM e transferir o líquido para o tubo mesmo.
4. Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta.
   Nota: Não decante o tubo.
5. Resuspenda as gotas em 50 mL de tampão de ligação (tabela 1); Misture rapidamente e então giram em 400 × g por 5 min a 4 ° C.
6. Dissolver 50 mg de liofilizado Homo sapiens IgG (Hs-IgG) em 10 mL de tampão de ligação, misture-os delicadamente os grânulos de agarose e incubar em agitador rotativo durante a noite a 4 ° C.
7. Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta.
8. Lave os grânulos de IgG-agarose com 50 mL de acoplamento buffer e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C.
9. Resuspenda os grânulos de IgG-agarose com 50 mL de tampão de bloqueio (tabela 1) e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Repeti uma vez.
10. Resuspenda IgG-agarose grânulos em 50 mL de tampão de bloqueio, gire a mistura por 2 h no RT e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C.
11. Remover o sobrenadante e ressuspender os grânulos de IgG-agarose em 200 mL de tampão de ligação de NaCl (tabela 1).
12. Para bloquear qualquer restantes grupos de CNBr do cross-linking, lave os grânulos de IgG-agarose com 100 mL de HCl glicina 0,1 M, pH 2.8. Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lavar com 0,2 M glicina-HCl, pH 2.8, girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Finalmente, lave os grânulos de IgG-agarose com 200 mL de água ultrapura.
13. Lave os grânulos de IgG-agarose com 200 mL de água ultrapura e, em seguida, 200 mL de tampão PBS (tabela 1).
14. Resuspenda os grânulos de IgG-agarose em 20 mL de tampão PBS com 0.01% NaN₃ (azida sódica) e armazenar a 4 ° C.

3. isolamento e solubilização da fração de membrana

1. Moa 10 g de plântulas da . thaliana três semanas de idade em nitrogênio líquido, usando um pilão frio com areia.
2. Adicionar 20 mL de frio retificadora Reserva (tabela 1) 10 g de tecido do chão, misture bem e descongele no gelo.
3. Filtre o homogenate através de duas camadas de material de filtração rápida em um tubo de centrifuga conico de 50mL. Mergulhe o material de filtração rápida com moagem buffer antes da filtragem.
4. Centrifugador do filtrado durante 10 minutos a 1.500 × g a 4 ° C e transferência o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico 50ml refrigerados, repita o mesmo passo mais uma vez e recolher o sobrenadante. Uma amostra de 200 µ l da fração"total" de reter e armazenar a-80 ° C para posterior análise
5. Transferir o sobrenadante para tubos de se frio 38,50 mL e superior a 35 mL com buffer moagem a frio. Centrífuga para 1h a 100.000 × g a 4 ° C em uma se.
6. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Manter uma amostra de 200 µ l da "fração solúvel" e loja a-80 ° C para posterior análise.
7. Ressuspender o pellet verde usando um homogeneizador de teflon de vidro, no buffer de moagem. Centrifugue durante 1 h a 100.000 × g a 4 ° C em um se e descartar o sobrenadante.
8. Ressuspender o verde em 18,75 mL de 1x Buffer usando um homogeneizador de teflon vidro de moedura e adicionar 9,375 mL de 1x tampão de moagem.
9. Adicionar 9,375 mL de solução de x solubilisation 4 (tabela 1) (contendo o detergente TX-100) para dar a 37,5 mL e incubar durante 30 min num "agitador rotativo" a 4 ° C.
10. Centrífuga para 1h a 100.000 × g a 4 ° C em uma se. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Manter uma amostra de 200 µ l do sobrenadante (futuro "fração de carga") e loja a-80 ° C para posterior análise.
11. Resuspenda o pellet em 37,5 mL de tampão de moagem. Manter a amostra da parte insolúvel e loja a-80 ° C

4. imunoprecipitação

1. Equilibrar a 100 µ l de resina embalada IgG-agarose no tampão A (tabela 1) e girar a 100 × g por 5 min a 4 ° C.
2. Remover o sobrenadante e ressuspender a resina de IgG-agarose em 100 µ l de tampão A 4 ° c.
3. Transferir a resina de IgG-agarose lavada para a 37,5 mL de membranas solubilizadas e incubar durante uma noite num agitador rotativo em um tubo de centrifuga conico de 50 mL a 4 ° C.
4. Sedimentos o IgG-agarose da resina em 100 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta. Manter uma amostra de 200 µ l da "fluir" e armazenar a-80 ° C para posterior análise.
5. Lave a resina de IgG-agarose em 37,5 mL de tampão A e incubar durante 10 minutos num agitador rotativo.
6. Sedimentos a resina de IgG-agarose em 100 × g por 5 min a 4 ° C, remover o sobrenadante com uma pipeta, adicionar 5 mL de moagem tampão A um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar 100 × g, 4 ° C, 5 min. reter um 200 µ l da amostra da "Lavagem de 1" e armazenar a-80 ° C para uma análise posterior.
7. Repetir os 5 mL passo três vezes com Buffer A. de lavagem
8. Realizar as duas últimas etapas de lavagem sem os inibidores (NaF, inibidor de Protease e PMSF)
   Nota: Inibidores já não são necessários nesta fase e omitidos para reduzir o custo. Manter uma amostra de 200 µ l da última lavagem etapa "final lavagem (W6)" e loja a-80 ° C para posterior análise.
9. Transferir a resina de IgG-agarose para uma coluna de rotação 500 µ l com um 35 µm filtro e lave os grânulos duas vezes com 300 µ l de tampão de eluição do PEV (tabela 1) (não contendo AcTEV) para o equilíbrio. Feche a coluna de rotação.
10. Adicione 300 µ l de tampão de eluição de TEV contendo 50 unidades (10 µ l) de AcTEV. Prepare a mistura em um tubo antes de adicionar à resina.
11. Incubar a coluna de rotação com grânulos em um thermomixer a 16 ° C, 350 rpm por 2 h. inverter a coluna suavemente várias vezes cada 30 min.
12. Abra a coluna giro, colocá-lo em um novo tubo limpo 1,5 mL e a rotação em 100 × g por 5 min a 4 ° C, para recolher o eluato.
13. Seca (por exemplo) 10% (v/v) da amostra eluted (~ 25 µ l) em um evaporador centrífugo e usar para espectrometria de massa ou outra uma análise mais aprofundada.
14. Alíquota o eluato restante (~ 275 µ l) dividido em onze centrífuga 1,5 mL tubos (25 µ l cada), secar em um evaporador centrífugo e armazenar a-80 ° C.
15. Analise as amostras mantidas durante todo o procedimento, bem como os eluídos pelo padrão de SDS-PAGE seguido immunoblotting. Para a preparação da amostra, precipitado de 50 µ g do Total (T), carga (L), fluxo (FT), lavar 1 (W1) e 200 µ l de lavagem 6 (W6) pela extração de clorofórmio/metanol¹⁶.
16. Adicione 10 µ l de 2x do amortecedor do carregamento de SDS-PAGE (tabela 1) para as amostras precipitadas e 25 µ l de amostra seca eluted. Vórtice e ferver durante 10 minutos a 95 ° C, em um bloco de calor.
17. Analisar Total (T), carga (L), fluxo (FT) através de lavagem 1 (W1), lavar 6 (W6) e eluição (E) pelo immunoblotting utilizando anticorpos anti-TOC159 para determinar a eficiência do processo de isolamento.

Resultados

Descrevemos aqui um protocolo para a purificação de uma proteína de envelope de cloroplasto TAP-tag complexa de transgénicos a. thaliana plantas. Como mostrado na Figura 1A, plantas expressando a 35S:NTAP-TOC159 construção foram usadas para isolar este complexo enquanto plantas expressando a construção de 35S:NTAP foram usadas como um controle. Figura 1 B mostra as etapas detalhadas da purificação de complexos de proteínas TAP-TOC159 seguido por espectrometria de massa para permitir a identificação das proteínas de interação. A análise de immunoblot (Figura 2, lado direito) confirma que isolado TAP-TOC159 interage com TOC75 e TOC33 do complexo TOC. A quinase de membrana externa de cloroplasto KOC1 conhecido para fosforilar TOC159 co também isolado com o complexo de torneira-TOC159 (Figura 2B, lado direito). A presença de TIC110 revela que o complexo isolado de torneira-TOC159 também contém os componentes do complexo TIC. O anticorpo contra uma proteína de plastoglobule não relacionada com a importação de proteínas FBN1A não reconheceu o complexo TAP-TOC159, indicando a ausência de contaminações. No controle negativo, proteína NTAP immunoprecipitated não co isolar com qualquer das proteínas TIC-TOC (Figura 2, lado esquerdo) e confirma a especificidade da purificação TAP-TOC159.

Figura 1 . Esquema do processo de purificação da afinidade e construções. (A). O 35S:NTAP-TOC159 construção, codificação NTAP-TOC159 estàvel foi expressa em Arabidopsis thaliana. Plantas de controlo negativo expressaram a construção de 35S:NTAP, a TAP-tag sozinha de codificação. B. O protocolo de purificação de afinidade sábio passo consiste de membrana isolamento e solubilização, IgG agarose imuno-purificação, lavagens, clivagem de protease TEV e eluição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Purificação de afinidade em tandem da proteína TOC159. N-terminal com a TAP-tag TOC159 foi purificado de NTAP-TOC15: plantasppi2 Arabidopsis e torneira proteína purificada a partir de plantas de torneira: WT foi usada como um controle negativo. Total de proteínas de membrana de extratos (T), solubilizados proteína = fração de carga (L), fluxo (FT), primeiro e último lavar fracções (W1 e W6) e 10% do eluato TEV foram analisados pela mancha ocidental. A membrana foi sondada com os anticorpos contra o TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) e FBN1A (AT4G04020). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela de buffers
Tampão de ligação	NaHCO3 Ajustar para pH 8,5 ajustar o pH com 0,1 M Na2CO3	100 mM
Bloqueio de Buffer	Tris-HCl Ajuste o pH 8 com HCl.	100 mM
Tampão PBS	Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Ajuste o pH 7.3 com HCl.	4,3 mM 1.4 mM 137 2.7
NaCl, tampão de ligação	Tampão de ligação NaCl	1 M
2 x Buffer de moagem	Tris-HCl, pH 7,5 com HCl. NaCl NaF PMSF Coquetel de inibidor de protease de planta	100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20%
4 x solução de solubilização	Glicerol Triton-X100	40% 3%
Tampão A	2 x Buffer de moagem 1 x Buffer de moagem 4 x solução de solubilização	100 ml 50 ml 25 ml 25%
Eluição de TEV Buffer	Tris-HCl, pH 8 com HCl EDTA, pH 8 com HCl NaCl Glicerol Triton-X100 DTT	50 mM 0.5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM
Buffer de 2 x carregamento SDS-PAGE	Tris-HCl pH 6,8 com HCl SDS Glicerol Azul de bromofenol DTT	0,1 M 4% 20% 0,20% 0,2 M

Tabela 1. Receitas do amortecedor.

Discussão

Temos demonstrado que uma única etapa de purificação de marca de torneira é um método eficiente e específico para a purificação do complexo Arabidopsis TIC-TOC. Embora a TAP-tag permitiria duas etapas sucessivas de purificação (IgG-seguido de purificação da afinidade de calmodulina depois TEV protease-clivagem), acreditamos que, em muitos casos, o primeiro passo de afinidade, seguido por clivagem de protease TEV serão suficiente. Nosso alvo, TOC159, é baixo o abundante e a inclusão da segunda etapa calmodulina-afinidade diminuída excessivamente o rendimento de proteína, que foi a principal razão para excluí-lo do nosso presente protocolo. O PEV-eluição em si é uma etapa de purificação altamente específico e suave que só vai liberar o alvo com a TAP-tag juntamente com os parceiros de interação associado enquanto contaminar as proteínas degola não especìfica para a resina de IgG permanecerá lá. Assim, em combinação com a etapa de IgG-afinidade, a eluição de TEV resulta em uma purificação suficientemente eficiente para nosso e provavelmente muitos outros fins.

Cuidado deve ser tomado que a construção com a TAP-tag é totalmente funcional em vivo. TOQUE de marcação poderia ter efeitos potencialmente deletérios na atividade da proteína, a estabilidade ou a localização. TOC159 consiste em três domínios, o domínio de ácido N-terminal, o domínio de GTP-ligando central e domínio C-terminal da membrana, que ancora TOC159 no exterior cloroplasto membrana². Para evitar potenciais interferências com inserção de membrana, nós fundidos a TAP-tag para o N-terminal da TOC159. Fusão de N-terminal é bastante a exceção que a regra. Muitas proteínas contêm informações de direcionamento de N-terminal e, portanto, devem por a tag no C-terminal. Estamos garantido que TOC159 é funcional na vivo pela complementação do mutante ppi2 (um mutante de albino falta TOC159) com torneira-TOC159. O resgate do verde, o fenótipo tipo selvagem indicou que a TAP-TOC159 era funcional¹⁵.

O protocolo de purificação foi usado para identificar novos parceiros de interação de TOC159, que incluiu KOC1 e TIC56^10,11. No total, cerca de 30 proteínas foram associadas com o complexo, sugerindo que a interação nova parceiros serão isolados e caracterizados em um futuro próximo. Enquanto é altamente recomendável a TAP-tag para purificação complexa, gostaríamos ainda de salientar que versões adicionais para aquele apresentado aqui existem e podem ser muito útil para algumas aplicações.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaHCO3	PanReac  AppliChem	A0384
Tris	Biosolve	0020092391BS
Na2HPO4	Sigma	S7909
KH2PO4	PanReac  AppliChem	A2946
NaCl	PanReac  AppliChem	A2942
NaF	Sigma	S1509	Tóxico
PMSF	PanReac  AppliChem	A0999	Inibidor
de protease de planta tóxica coquetel	Sigma	P9599
Glicerol	PanReac  AppliChem	A0970
Triton X100	Roche	10789704001
Glicina	PanReac  AppliChem	A1067
EDTA	Carl Roth	8043
Dithiothreitol (DTT)	PanReac  AppliChem	A1101
SDS	PanReac  AppliChem	A0675
Azul de bromofenol	Sigma	B0126
HCl	VWR	20252-290	Corrosive
Sucrose	PanReac  AppliChem	A3935
Murashige e Skoog médio com vitaminas	Duchefa Biochemie	M0222
Phytoagar	Duchefa Biochemie	P1003
Placa de Petri	Greiner Bio-one	639102
1,5 mL tubos de microfífugas	Sarstedt	72.706
Etanol	Fisher químico	E/0600DF/15
Papel de filtro	Whatman	10311804
Fita cirúrgica	3M	1530-1
CNBr Contas de agarose ativadas (sepharose 4B)	GE Healthcare	17-0430-01
Filtro de vidro sinterizado	DURAN	2515703
Tubo de centrífuga 50 mL	TPP	91050
Imunoglobulina G purificada (HsIgG)	MP Biomedicals	855908
Agitador rotativo	IKA	4016000
NaN3 (azida de sódio)	Sigma	71290	Material
filtragem rápida tóxica (Miracloth)	Merk-Millipore	475855
Ultracentrifube XNP-80	Beckman Coulter	A99839
Rotor SW 32 Ti	Beckman Coulter	369650
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	326823
Homogeneizador de vidro teflon (Potter)	Wheaton	357426
Coluna de rotação (Mobicol)	Filtro Mo Bi Tec	M1003
35µ m para coluna giratória (Mobicol)	Mo Bi Tec	M513515
AcTEV	Invitrogen	12575-015
Evaporador centrífugo (Speed Vac)	Eppendorf	5305000100
FBN1A(PGL35) anticorpo	AgriSera	AS06 116	RRID:AB_2247012
Sand, Fontainebleau	VWR	27460.295