Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 生产和纯化的蛋白质标记与稳定同位素, 以及随后的表征蛋白质相互作用使用核磁共振 (nmr) 光谱和微尺度热像仪 (mst) 实验。
Abstract
丝状蛋白, 如 vimentin, 通过提供结构支架, 将含有重复的蛋白质结合的部位, 在细胞内提供组织。本文描述了一种检测和测量这种相互作用的协议, 该协议使用了恩沃帕金的球状重复域和维门汀的螺旋线圈。这为确定蛋白质是否结合了维门汀 (或类似的丝状蛋白) 和测量相互作用的亲和力提供了依据。感兴趣的球状蛋白标记为15n, 并在溶液中用 vimentin 蛋白滴定。获得了二维核磁共振谱, 通过观察峰值形状或化学变化来检测相互作用, 并阐明包括盐水平在内的溶液条件对量子结构的影响。如果感兴趣的蛋白质结合丝状配体, 结合相互作用的 mst 使用纯化的蛋白质进行量化。这种方法是一种简单的方法, 用于确定感兴趣的蛋白质是否结合了灯丝, 并评估改变 (如突变或溶液条件) 如何影响相互作用。
Introduction
蛋白质之间的相互作用允许形成分子机器, 在细胞内创造秩序。个体的相互作用往往很弱, 但通常有助于多价的配合物, 可以是合作的和动态调节的。需要提供原子分辨率和关于这种复杂相互作用的定量信息的敏感检测, 以推断机制和设计干预措施, 如类似药物的分子。核磁共振光谱是获取蛋白质相互作用信息的有效方法, 也可用于对配体 (包括弱结合1的配体)进行快速筛选。所使用的核磁共振方法可分为蛋白质观察或配体观察。这份手稿采用了前一种方法, 即获得相对较小 (通常低于 20 kda) 的稳定同位素标记蛋白质谱, 并对未标记的配体进行滴定。这使得参与相互作用的标记残留物在有利的情况下被映射。一旦复杂的形式, 相互作用的残留物的化学环境发生了变化, 表现为其核磁共振信号的化学转移和形状的变化。这种变化的程度与这些群体参与互动的程度有关。化学转移扰动 (csp) 可以通过比较在没有和存在不同数量配体的情况下收集的蛋白质的一系列核磁共振光谱来测量。对于较大的配体或复杂的相互作用, 可以测量峰值形状或强度的变化, 以推断相互作用。
用于检测配体相互作用的最常见的二维实验是15个n n-异核单量子相关 (hsqc) 实验2。这就要求将一种蛋白质统一标记为15n, 这通常是通过将其表示为在 15个n 富集介质中生长的大肠杆菌细菌培养物中的亲和力标记版本来实现的。当滴定过程中收集的 hsqc 光谱叠加时, 结合是显而易见的, 从而揭示了复杂地层中所涉及的一子集残留物的峰值变化。这种相互作用可能发生在快速交换制度中, 在这种制度中, 自由和配体饱和状态信号崩溃为一个种群的平均峰值。或者, 在各状态之间交换缓慢的情况下, 这两个信号都是用表示其相对数量的积分观察的。虽然在某些情况下, nmr 线性 hape 分析可用于估计绑定相关性, 但 mst 等方法也被证明是方便的, 并提供了真正交互的交叉验证。
提供的例子是在脱粒中发现的两种蛋白质。它们介导细胞表面和细胞骨架之间的连接, 并介导细胞粘附机和中间丝之间的多价相互作用, 以保持皮肤和心脏组织的完整性, 并承受剪切力。当去核蛋白 (如去核蛋白或 vimentin) 被突变或自身抗体破坏, 导致细胞连接不稳定, 因此它们的相互作用至关重要时,就会导致疾病3。脱粒蛋白结合配体的结构基础可以用核磁共振光谱表征, 而相互作用可以用 mst 来表征。本文的方法被用来表征通常存在于提供基本凹槽的串联集和通过其螺旋提供的酸性表面相互作用的中间长丝 vimentin 之间的相互作用捆绑4。这些配合物形成在细胞膜, 在那里他们锚定细胞骨架的中间丝到去甲细胞连接到相邻的细胞, 从而形成一个网络的粘合键辐射整个组织。
Protocol
1. 重组蛋白的表达
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珠三角 (e-prd) 和 vimentin 99-249 (Vimentin) 的表达
- 用含有所需基因的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) 细胞。将细胞分散在含有100μgml 氨匹西林的琼脂板上。在37°c 条件下隔夜培育板材。
- 选择一个单一的菌落, 并接种20毫升的非常肉汤 (tb) 含有100μgml 氨匹西林选择质粒。在37°c 下生长培养, 摇一摇 (180 转/分) 过夜。
- 将整个20毫升培养物转移到含有50μgml 氨匹西林的结核病1升。在37°c 下培养培养, 在180转/分的情况下晃动, 直到 od600 = 0.6-0.8。
- 将温度降低到 18°c, 并通过将异丙基β-d-1-硫代丙醇 (iptg) 添加到 1 mm 的最终浓度, 诱导蛋白质表达。在18°c 下继续孵育, 夜间在160转/分的情况下晃动, 以允许蛋白质表达。
- 以 8, 000 x 克的速度将培养物离心 15分钟, 并丢弃上清液, 以收获细胞。
- 将细胞颗粒重新悬浮在约40毫升的磷酸盐缓冲盐水中 (pbs:20 mm 磷酸盐缓冲液, ph 值 7.4, 120 mm ncl), 将收获的细胞颗粒重新悬浮在一起。将重新悬浮液转移到50毫升管。再次以 8, 000 x g 离心15分钟。
- 欺骗和丢弃上清液。立即开始纯化协议, 或将细胞颗粒冻结在-20°c, 以备将来使用。
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异种标记蛋白的表达
- 转化大肠杆菌BL21(DE3) 细胞, 并准备一个20毫升的启动培养, 如在 1.1.1-1.1.2。
- 将整个20毫升培养物转移到富集结核病的1升, 其中含有额外的 4.0 g 色氨酸、5.0 g 氯化碳和100μgml 氨匹西林。在37°c 下培养培养, 在160转/分的晃动下, 直到 od600 = 1.6-1.9。
- 以 8000 x 克离心 15分钟, 收获1升培养物, 并丢弃上清液。
- 将细胞颗粒轻轻再悬浮在大约40毫升的 pbs 中, 并将重新悬浮液转移到50毫升管中。
- 再次离心以 8, 000 x 克15分钟的时间, 分解和丢弃上清液。
- 将细胞颗粒在 mL 最小介质的20毫升中重新应用 (表 1), 并转移到含有100μgml 氨匹西林的 mL 最小介质的 950 ml 的剩余介质中。
- 加入50毫升的过滤灭菌营养混合物 (表2和表 3)。
- 将培养物适应 18°c 30分钟, 然后将 iptg 添加到 1 mm 的最终浓度中。
- 在18°c 下过夜, 在160转/分的情况下晃动。
- 收获细胞, 就像在 1.1.4-1.1.6 的部分。
2. 固定化金属亲和色谱 (imac) 对维姆罗德和 e-prd 的纯化
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h6 标记的维姆罗德的纯化
- 在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的 pbs 中, 重新使用细胞颗粒, 而不是 edta。在 d盎司组织均质机中进行12笔同质化, 以改善细胞裂解的后续步骤。
- 在冰上, 以 1 ' s 关闭的脉冲将细胞悬浮声发出, 振幅为 80%, 共1.5 分钟. 再重复两次声纳, 在冰上的运行之间轻轻旋转, 以防止过热。
- 以 75, 000 x 克离心样品 45分钟, 用注射器过滤器 (0.45μm) 对上清液进行分解和过滤。
- 利用快速蛋白质液相色谱 (fplc) 系统, 以 1 mlmmin 的流速, 以 5 mL hepes 的结合缓冲液 (20 mm hepes, ph 7.5, 500 mm nacl, 10 mm 咪唑) 的流速平衡 5 ml imac 柱。
- 以 0.5 ml/min 的流速将过滤后的上清液加载到列上。
- 用5毫升的洗涤缓冲液 (20 mm hepes, ph 7.5, 500 mm nacl, 50 mm 咪唑) 在 1 mlmin 的流速下清洗色谱。
- 用 3 mm hepes (20 mm hepes, ph 7.5, 500 mm nacl, 350 mm 咪唑) 以 0.5 mlmin 收集的流速清除蛋白质。如果可用, 请选择上流洗脱模式, 以增加洗脱蛋白的浓度。
- 通过 sds-page 识别 fplc 色谱中含有感兴趣的蛋白质的组分, 并使用标准方法测量蛋白质浓度5。
- 使用离心超滤装置 (mwco 3 kda, 5 ml) 将含有最高蛋白质量的洗脱组分灌入2毫升。以 21, 000 x 克的离心机去除任何沉淀物, 并通过0.22 微米的过滤器。
- 用 fplc 在 1 mlmmin 的流速下, 用2毫升 s hepes (20 mm m hipes, 150 mm nacl, ph 7.5, 0.5 mm tcep) 平衡 120 ml 大小排除色谱 (s) 柱。
- 以 0.5 mL/min 的流速将2.1.9 浓缩的蛋白质注入色, 并以 1 cv s 缓冲液的速度流出, 收集 1 ml 组分。
- 像以前一样识别含有感兴趣的蛋白质的分数。
- 池含有最高数量蛋白质的分数。
- 存放在4°c 短期使用或添加甘油到20% 和储存在-80°c 在小的脂肪。
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去除希斯6标签的 e-prd 蛋白的纯化
- 按照 2.1.1-2.1.8 中的步骤来纯化带有六标记的 e-prd 蛋白。集中峰值分数并确定蛋白质浓度。
- 在2μlmg 的集合蛋白中加入烟草蚀刻病毒 (tev) 蛋白酶 (1 mg/ml)。在4°c 下, 在 s 缓冲液中隔夜转移到透析管 (6 kda) 和透析液中。此步骤允许分离 his6 标签和去除咪唑, 这将干扰结合与 ni-nta 树脂在下一步。
- 在 s 缓冲液 3 cv 的重力柱中平衡5毫升的镍-nta 树脂。从树脂中排出多余的缓冲液。
- 将切割的 e-prd 蛋白倒在树脂上, 在摇杆平台上孵育 1小时, 使未分离的 his6 标记的 e-prd 和被切割的 his6 标记结合。tev 蛋白酶也是 his6 标记, 并将其结合树脂。收集流经, 其中包含无标签的 e-prd。用 2 cv s 缓冲液清洗树脂, 确保所有 e-prd 全部回收。
- 使用离心超滤装置 (mwco 3 kda, 5 ml) 将 e-prd 浓缩到2毫升。以 21 000 x g 的离心机去除任何沉淀物, 并通过0.22 微米的过滤器。
- 平衡一个 120 ml s 柱与 2 cv s 缓冲液 (20 mm hepes, 150 mL 氯化碳, ph 7.5, 0.5 mm tcep 为 mL 或 20 mm Tris-HCl, 1 mm dtt, ph 为 nmr), 流量为 1 mlmin, 使用 fplc。
- 将2.2.5 浓缩的 e-prd 蛋白注入 1 cv s 缓冲液的柱状和流出物, 流量为 0.5 mL/min, 收集 1 ml 组分。
- 像以前一样识别含有感兴趣的蛋白质的分数。
- 池含有最高数量蛋白质的分数。
- 存放在4°c 短期使用或添加甘油到20% 和储存在-80°c 在小的脂肪。
3. 核磁共振方法
- 核磁共振样品制备
- 纯化15n 标记的野生型或 r1914e e-prd 蛋白, 如前面所述, 使用 20 mm tris-hcl, 1 mm dtt, ph 值7作为步骤2.2.6 的 s 缓冲液。蛋白质库存溶液通常从0.3 到 1 mm 不等, 体积约为1毫升。
注: 蛋白质可以浓缩到 & gt;100 μm 使用 mwco 3 kda, 5 ml 离心超滤装置, 使浓度进入适当的样品制备范围。 - 使用 20 mm Tris-HCl, 1 mm dtt, ph 7 作为步骤2.1.10 的 s 缓冲液, 纯化未标记的 vimrod 蛋白样本。
- 在500μl 的最终体积中, 将野生型或突变体 e-prd 蛋白添加到最终浓度为 100μm, d2o 为最终浓度为10% (v/v), dss (4, 4-二甲基-4-硅基戊酸-1-磺酸) 最终浓度为20μm。样品体积可达 500μl, 使用 20 mm tris-hcl, 1 mm dtt, ph 值7。表 4描述了具有代表性的样品制备。
注: dss 的 0 ppm 共振用于校准1h 化学变化以及间接引用蛋白质的 15个n 化学转移。d2o用于氦锁定信号, 以保持光谱仪在一个恒定的净磁场下工作。 - 与上一步一样, 制备电子珠三角、d2o和 dss 的第二个样品, 并将 vimrod 添加到50μm 的最终浓度, 然后使体积达到500μl。
- 将500μl 样品转移到5毫米宽的核磁共振管进行实验。
- 纯化15n 标记的野生型或 r1914e e-prd 蛋白, 如前面所述, 使用 20 mm tris-hcl, 1 mm dtt, ph 值7作为步骤2.2.6 的 s 缓冲液。蛋白质库存溶液通常从0.3 到 1 mm 不等, 体积约为1毫升。
- 核磁共振实验设置
- 使用弹出命令 "eject" 打开气流;这将使样品从磁铁。现在, 将样品放在磁铁顶部的旋转器中, 然后插入命令 "ij"。等待样品在磁铁内沉淀后再继续。
- 使用 "edc" 命令创建新数据集, 并通过选择实验 "zgpr" 加载标准1h nmr 参数 (图 1)。填写名称、expno (实验编号) 和 promno (处理过的数据文件夹号) 字段。在 "设置溶剂" 字段中选择溶剂, 然后单击 "执行" getprosol ", 阅读标准的人头和溶剂相关 (prosol) 参数。
- 将样品锁定到未化溶剂,即d2o, 使用命令 "锁定", 并等待, 直到它完成扫描, 并实现锁定。
- 通过使用自动调谐命令 "atma" 调谐样品来校正磁体的共振频率。监视摆动曲线, 直到自动调整完成。
- 使用 topshim (命令 "topshim") 来填充磁场。shimming 是调整磁场的过程, 以实现样品周围的均匀性。如果使用相同或相似的示例, 最好使用命令 "wsh" 存储填充物值, 并在 topshim 之前使用 "rsh" 读取它们。
- 使用 "rga" 命令调整接收机增益, 以实现最大信噪比。
- 将光谱的中心放在水共振偏移 (o1) 上, 并使用 "califbo1p1" 将90度质子脉冲 (p1) 设置在高功率。
- 使用零去 "zg" 命令收集质子谱, 并使用 "efp" 进行处理, 其中包括指数乘法 ("em")、自由感应衰变 (fid), 包括线宽、fid "英尺" 傅立叶变换和 "pk" 应用相位校正。
- 使用不集成选项的多项式应用自动相位校正 "apk" 和自动基线校正 "abs"。
- 通过在实验中选择 "sfhmqc3gpph", 为 sofast hmbc 实验创建一个新的数据集 (如 3.2.2)。
- 从质子频谱复制优化的 p1 和 o1, 并使用命令 "getprosol 1h p1 plw1" 填充 p1 依赖脉冲, 其中 p1 是优化的 p1 值, plw1 是 p1 的功率级别。
- 优化 cnst54 常数, 设置酰胺化学移位的偏移量, 并设置 cnst55 来定义带宽, 以包括感兴趣的光谱区域, 从而优化接收机增益 (图 2)。要选择这些参数, 请从二维光谱中提取第一个 fid (自由感应衰减), 并查找观察到的信号来定义它们。此外, 改变放松延迟 (d1)、扫描次数 (ns) 和虚拟扫描 (ds), 通过命令 "gs" 获得可接受的信号灵敏度, 从而使去和扫描能够实时监控数据质量。
- 使用 "零转" "记录光谱。
- 核磁共振数据处理
- 使用 "si f2ect2048, f1德·ecis 512", 并在间接维度中进行可选的线性预测, 将处理参数设置为光谱的直接 f2 (1h) 和间接 f1 (15 n) 维数的大小 (图 3).
- 选择 "qsine" 作为窗口函数, 输入2的形铃移位 (ssb) 来处理二维谱。
- 输入命令 "xfb", 使用窗口函数和傅立叶变换处理两个方向的数据。
- 使用命令 "apk2d" 在两个方向执行自动相位校正。如果自动过程不能达到令人满意的相位校正水平, 请使用 "rser" 命令提取 fid, 计算一维处理的相位值, 并将其应用于2d 数据。
- 使用2d 数据的自动基线校正功能 "abs 2" 更正基线。这将在处理参数中定义的 ppm 值之间应用多项式函数, 并将生成用于进一步分析的2d 频谱。
- 如果计划执行串行处理以比较与另一个分子的相互作用数据, 则将处理参数存储为命令 "wpar", 并使用 "rpar" 调用它们。通过这种方式, 将使用相同的参数处理所有数据集, 并且由于处理差异而不会引入变体。
- 核磁共振数据分析
- 输入命令 "pp" 以开始峰值领料的过程。
- 根据预期峰值定义 ppm 范围和最小强度/最大峰值数 (图 4)。单击 "确定" 并通过目视检查验证结果。如果需要, 重新运行该过程, 直到根据光谱质量使结果令人满意。
- 使用 "pp" 命令生成峰值列表。
注: 默认情况下, 此峰值列表包含数据高度峰值强度信息, 可以导出到后续频谱, 并可由其他程序读取。 - 观察蛋白质 hsqc 光谱中的峰值强度或化学变化的变化, 这些变化表明与另一个分子的相互作用。如果相互作用的分子很大, 则随着某些峰值的消失, 峰值强度会降低。
- 通过单击 "峰值" 选项卡并在峰值窗口中右键单击选择 "导入", 将峰值列表导入到下一个数据集。
- 可视化频谱上的峰值, 并在需要时将其转移到新的位置。单击 "完整表" 的 "重置强度", 生成具有强度的频谱的峰值列表 (图 5)。此峰值列表将从存储的峰值列表中传递位置信息。
- 通过选择 "导出" 函数, 将峰值列表从不同的数据集导出到电子表格或其他数学程序以进行分析。
- 计算每个峰值的峰值强度变化, 函数为 "复杂光谱中的峰值强度/蛋白质谱中的峰值强度"。值可以通过乘以100转换为百分比变化。请注意, 峰值体积也是有用的, 尽管峰值强度更容易测量彼此接近的峰值, 通常就像密度相对较宽的峰值的蛋白质一样。
4. 微尺度热像 (mst)
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配体蛋白 e-prd 的制备
- 将配体转化为与 mM 兼容的缓冲液, 在 3.5 kda 微型透析单元中透析高达800μl 的蛋白质, 悬浮在 20 mm hepes 的1升中, ph 值 7.5, 10m ncl, 在4°c 隔夜缓慢搅拌。
- 使用离心超滤装置 (3 kda mwco) 将配体浓缩, 在 14 000 x 克的离心下进行 10分钟, 将浓缩的蛋白质转移到干净的管中。
- 以 21, 000 x 克离心配体 10分钟, 并小心地将上清液转移到新管中, 以去除任何沉淀的蛋白质。使用280纳米的吸收率和配体消光系数来确定配体的浓度。加入10% 的 tween-20, 使最终浓度为0.015。将 tween-20 添加到检测缓冲液中, 以防止吸附到毛细血管中。mM 实验的最终检测缓冲液为 20 mm hepes, ph 值 7.5, 10 mm 氯化钠, 0.015 Tween-20.。
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染料标记靶蛋白维姆罗德的制备
- 通过加入与 red-tris-nta 一起提供的 1x pbs-t 50μl 来重新制备 red-tris-nta 染料, 使其浓度达到5μm。将2μl 等位分配到200μl 管中, 并存储在-20°c。
- 用检测缓冲液将目标蛋白稀释至0.34μm。将58μl 的目标加入降排-tris-nta 染料的 2μl aliquot 中, 在室温下孵育30分钟。染料标记靶点的最终浓度为0.33μm。以 21, 000 x 克的速度离心标记的目标 10分钟, 并小心地将上清液转移到新的管中, 以去除任何沉淀物。red-tris-nta 染料通过 his6 标记与蛋白质结合, 并在亚纳米摩尔范围内具有结合解离常数 (kd)。它实际上是100% 绑定到目标蛋白质, 所以不需要进一步的纯化。
- 打开 mst 仪器并打开控制软件。选择降排-tris-nta 染料的红色设置。将温度控制打开到25°c。
- 选择 "最漂亮" 以验证目标的标记, 并检查是否对试剂盒进行聚合或吸附。自动提供对这些参数的评估。
- 混合17μl 的检测缓冲液和3μl 的目标蛋白, 然后通过移液混合。通过将两个标准毛细血管浸入稀释后的目标中, 并将液体拉入毛细血管中心, 填充它们。将毛细血管放入托盘和仪器中。开始测量。
- 回顾结果, 寻找足够的荧光水平和没有吸附的迹象 (扭曲在毛细管线形状) 或聚集 (扭曲在 mst 痕迹), 将在软件分析中标记。如果结果是积极的移动到配体步骤, 如果不是一个不同的缓冲液必须尝试或 tween-20 的量可能增加到0.05% 或更高。
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e-prd 配体双倍稀释系列的研制
- 通过标记1-16 的 16, 200μl 管, 准备稀释系列。
- 在1.17x 的浓度下加入17μl 的配体, 比 tube1 所需的最大配体浓度大。这个体积是所需量 (8.5μl) 的两倍, 然后将转移到下一个管串联。该检测的最终体积为 10μl, 因此1.17x 配体浓度的8.5μl 将通过添加1.5μl 的目标蛋白 vimrod 稀释为1x。所选择的最大浓度应至少为估计kd 值的20倍。
- 使用新的移液器尖端为每个外度添加8.5μl 的检测缓冲液。重复使用移液器吸头可能会影响精度 (有关准确移液的建议, 请参阅制造商的说明)。将8.5μl 配体从 tube1 转移到 Tube1, 慢慢地将溶液释放到检测缓冲液中, 而不会产生气泡。通过向上和向下移液至少 6次, 将配体和缓冲液混合, 同时不产生气泡。最集中管中的 e-prd 为 1.5 mm, 标记的 vimrod 最终浓度为 50 nm。
- 将8.5μl 配体从 tube2 转移到 Tube2, 并与检测缓冲液混合。重复连续稀释, 直到所有的管都加入了配体。从管贝16中丢弃 8.5μl, 使所有管在一系列双倍稀释中含有8.5μl 的配体。
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结合反应和 mst 实验的制备
- 在每个试管中加入1.5 微米的标记目标蛋白, 然后通过上下移液轻轻混合, 小心避免气泡。孵化15分钟。
- 选择绑定分析的专家模式, 并输入串行稀释系列的参数。确保温度控制设置为 25°c, 励磁功率设置为 40%, mst 功率设置为介质。必须针对正在研究的其他绑定伙伴优化这些参数。
- 用结合反应填充毛细血管, 并将其放置在毛细管托盘中。将纸盒装入仪器, 等待温度恢复25°c 并开始测量。
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数据分析
- 在亲和力分析软件中打开绑定分析文件。回顾毛细血管扫描;荧光水平与平均值的差异不应超过 10%, 不应检测到第3.6 节所述的聚集或吸附。
- 选择右侧面板上的 mst 分析, 并将分析数据拖到分析集中。如果在相同条件下有多个相同的目标配体结合试验, 它们可以通过掉落在同一集合中进行合并。或者, 可以独立地将每个运行放入分析中。
- 移动到 "剂量响应拟合" 选项卡以绘制数据图。如果需要单个绑定站点, 请选择 kd模型。hill 模型也是具有协作行为的多个绑定站点的一个选项。在此阶段, 可以从配合中删除未通过质量控制的异常点。合并集与多个检测将被平均和错误计算为标准偏差。
- 打开最终选项卡, 并比较单个图形上所有图形之间的结果。从生成的表中检索每个曲线的拟合结果。如果需要, 将数据或已安装的曲线导出到其他演示或分析软件。
Representative Results
用 his6 标记表达了人的烯-普莱金基因的 e-prd 域 (克隆到 pproex-htc 中的残留物 1822-2014) 和人 vet21a 的 vimentin 域 (克隆到 pet21a 中的99-249 残留物) 并进行纯化。图 6和图 7显示了从这种蛋白质纯化方法中获得的 vimrod (18.8 kda) 和 e-prd (21.8 kda) 的纯度水平。从 e-prd 结构中去除 his6 标记对于 mst 实验至关重要, 因为 vimrod 蛋白使用 his6 标记结合染料进行标记, 并且任何保留 his6 标记的 e-prd 都可能会争夺该染料的结合。第二个 imac 柱后, 与 tev 蛋白酶的标签裂解删除的 tev 蛋白酶, 裂解标签和任何未裂解的 his6-e-prd 仍然存在。纯化的最后一个抛光步骤是尺寸排除色谱。尽管两种蛋白质的大小相似, 但 vimrod 从柱中从51毫升的柱中排出, 而 e-prd 洗脱峰的中心为72毫升, 预计会有如此大小的蛋白质单体。通过分析超离心实验, 表明 vimrod 的大小明显增大可能是由于其作为丝状长棒形状蛋白的特性.由于在最小培养基中产生的细胞数量较少, 从 m9 培养的培养物中获得的蛋白质产量低于丰富的肉汤。m9 制剂中较大的起始培养物的初始生长可提高细胞产量, 同时保持核磁共振实验所需的15n 标记的程度。
在 vimrod存在或不存在的情况下, 为 e-prd 的野生型和 r144e 突变体获取了15个n-1 h hsqc (图 8a-8d).图 8a中的 e-prd 谱显示了已很好解析的峰值的预期数量, 表明了一个适当折叠的蛋白质。在 vimrod 的存在 (图 8b) 中, 频谱显示出广泛的线展宽和峰值消失, 对应于 e-prd 和 vimrod 之间的结合。这种绑定因 r1914e 的突变而丢失,图 8c 和8C 的比较就证明了这一点。在 r1914e 突变体中添加 vimrod 表明该突变体 e-prd 与 vimrod 之间缺乏结合后, 在光谱上观察到的变化不大。图 8e将 vimrod 存在的 e-prd 峰值强度进行了比较, 并绘制为相对峰值强度, 表明了 e-prd 复合体中峰值展宽的范围。e-prd 的 r1914e 突变体 (未显示) 在 vimrod 存在的情况下, 在20% 或更高的峰值强度下保持了约97% 的峰值, 而野生类型的峰值约为 20% (图 8e)。这表示失去了功能点突变体, 还研究了具有中间效应的额外突变体.
以荧光 red-tris-nta 染料为靶点, 将配体 e-prd 浓度从 1.28 mm 到 39.1 nm 的浓度降低, 对 vimrod 和 e-prd mM 的结合进行了验证和定量。进行了三次绑定滴定, 结果是平均的, 如图 9所示。这些数据与单点配体结合的标准模型吻合较好,kd 为25.7±2.1 微米。表面等离子体共振对 vimrod 与 e-prd 结合的评价给出了类似的 kd值为 191±1.3μm4。
图 1: 核磁共振实验设置的屏幕捕获.所显示的窗口用于设置收集 hsqc 数据集的标准实验。实验参数在实验相邻的地方读取。所做的 zgpr 实验选择了作为加载标准质子和溶剂相关质子参数的初始实验。"标题" 窗口用于输入用于记录保存的实验详细信息。为了收集 hsqc 谱, 将 zgpr 实验替换为 sfhmqc3gpph。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 核磁共振实验参数的调整.所显示的窗口用于输入核磁共振脉冲序列的基本参数, 以优化信号。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 核磁共振数据处理.将显示用于处理 nmr 光谱的两个维度中的每一个维数的参数, 并显示通常调整的参数。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 核磁共振峰值拾取的参数.在处理后的核磁共振光谱中, 用于选取核磁共振峰的参数用典型值显示。调整 ppm 范围、强度和峰值数, 以优化光谱。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 具有强度的代表峰值列表.在核磁共振光谱中选取的每个峰都有一个数字, 并显示其1h 和15n 的化学变化和信号强度。然后, 这个峰值列表可以用来比较在相互作用的伙伴缺席的情况下获得的光谱。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: imac 和 s. a. 纯化带有 his6 标记的 vimrod.imac 柱洗脱的色谱显示了 vimrod 的一个主要峰值。s 柱洗脱的色谱图显示一个主要峰值。c. 在纯化过程中收集的 fractions: mw 标准, mw 标准以 kda 表示在凝胶 (m) 的左侧, 细胞裂解物 (1), imac 流经 (2), 洗涤 (3), 池洗脱 (e1), 汇集 s 洗脱 (e2)。在 e1 和 e2 车道中, 以较高的分子量可见的带是纯 vimrod 的低聚物, 这一点得到了西方印迹的证实 (数据未显示)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: imac 和 s. a. 净化 e-prd.imaac 纯化的 sds-page 显示分子量标准, mw 以 kda 表示在凝胶 (m) 的左侧, 洗脱液来自第一 imac 柱 (e1)、ev 裂解产品 (+ tev), 以及从第二个 imac 柱 (ft) 流出的。s 柱的色谱仪显示一个主要峰值。分子量标准 (m) 的 sds-page 和 s 峰的分数。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: vimrod 存在和缺失情况下的 e-prd 野生类型和 r1914e 突变体的 hsqc 光谱.hsqc 光谱显示野生型 e-prd (100μm) 在 20 mm tris-hcl、150 mm 氯化钠、1 mm dtt、ph 值 7, 在没有 (a) 或存在 50μm vom (b) 的情况下。c 和 d 板分别是在没有或不存在 50μm vimrod 的情况下 r1914e 突变体 (100μm) 的 hsqc 光谱。在面板 e 中, 具有或不具有 vimrod 结合的 e-prd 的相对 1 h-15 n 峰值强度显示为峰值的函数, 峰值是任意分配的, 而不是基于序列位置.这些值可用于定义添加配体时峰值强度降低的重要截止值。如果分配可用, 则通常可以看到重要值映射到绑定区域。请点击这里查看此图的较大版本.
图 9: e-prd 与 vimrod 的结合.e-prd 在进行 mM 分析之前, 在 1.28 mm 至 39.1 nm 的一系列双重稀释中被稀释, 并与标记的 vimrod 一起孵育。合并了三个独立检测的数据。这些数据适用于 kd 模型, 该模型的 kd 为25.7 微米, kd 置信度为±2.1 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂 | 数量 |
| 磷酸钠, 二基 (无水) | 6.0 克 |
| 磷酸钾, 单氮 (无水) | 3.0 克 |
| 氯化钠 | 0.5 克 |
| h2o | 高达950毫升 |
表1。用于同位素标记的 m9 介质。
| 试剂 | 数量 |
| 15nh4cl | 1.0 克 |
| 葡萄糖 (或13c 葡萄糖) | 2.0 克 |
| 1 m mgso4 | 2毫升 |
| 50 mm ccl2 | 4毫升 |
| 20 mg/ml 硫胺素 | 1.0 毫升 |
| 3 mm f3003 | 400μl |
| 金属混合物 (表 3) | 500μl |
| h2o | 高达50毫升 |
表2。用于补充 m9 培养基的营养混合物。
| 试剂 | 数量 |
| 4 mm znso4 | 323毫克 |
| 1 mm mnso4 | 75.5 毫克 |
| 4.7 mmh 3bo3 | 145毫克 |
| 0.7 mm cuso4 | 55.9 毫克 |
| h2o | 高达500毫升 |
表3。金属混合补充丰富 mt 营养混合。
| 样品 | 缓冲液 a1 ( μl) 中的 1 mm e-prd | 缓冲液 a 中的 1mm vimrod (μl) | 缓冲区 a (μl) | d2o (μl)中的 200μm dss | 缓冲区 b2 (μl) | 总体积 (μl) |
| 电子珠三角 | 50 | 0 | 50 | 50 | 350 | 500元 |
| e-prd + vimrod | 50 | 50 | 0 | 50 | 350 | 500元 |
| 1缓冲区 a:20 mm tris-hcl, 1 mm dtt, ph 值7 | ||||||
| 2缓冲区 b:23 mm rris-h科尔, 1.14 mm dtt, ph 值7 | ||||||
表4。核磁共振样品制备。
Discussion
2d 15n-解析核磁共振实验是最广泛使用的方法之一, 以显示两个分子如何相互作用。它是最丰富的信息方法, 允许在解决方案状态下的整个滴定实验中持续监控双方的信号。虽然在大型配合物的情况下通常是定性的, 但在有利的情况下, 该方法也可用于测量在高分辨率光谱中跟踪核磁共振信号的结合亲和力。在可以方便地进行分配的情况下, 例如在许多蛋白质的情况下, 20 kda 以下的大小, 结合位点也可以映射。补充检测 (如 mst) 提供了有关溶液中相互作用的定量信息, 并且在未标记的状态下需要较少的蛋白质。比较突变结合数据有助于提供控制, 以确保核磁共振线扩展所证明的相互作用是真实的, 而不是聚集或粘度变化等的伪影。
蛋白表达
简化表达过程可减少劳动密集型蛋白质生产量。这一优化过程的一部分涉及确定适当的大肠杆菌菌株, 用于蛋白质的重组表达。应变偏好取决于元素, 包括使用中的载体的性质, 更具体地说, 是表达重组蛋白的最终稳定性 7.通过使用缺乏蛋白酶的大肠杆菌 (如 bl21 菌株) , 可以降低内源性大肠杆菌蛋白酶降解异源蛋白的风险 。对于含有罕见密码子的基因, 像 bl21-codonplus (DE3)RIPL 这样的毒株可能是首选。这种菌株结合了 bl21 菌株的蛋白酶缺乏性质与额外的内源内源副本的原始密码子 rna 精氨酸, 异亮氨酸, 丙氨酸, 和亮氨酸。或者, 可以通过从商业来源订购代码优化构造来避免罕见的可破坏过度表达的密码子。许多大肠杆菌菌株可用于重组基因表达, 每个菌株都针对表达7期间的特定问题的规避进行了优化.在本研究中, 标准的蛋白酶缺乏菌株 BL21(DE3) 产生了足够数量的可溶性蛋白质, 用于后续的纯化和分析。
蛋白质纯化
特定蛋白质的纯化方案通常是独特的, 因为每种蛋白质在温度、盐浓度或 ph 值等不同条件下保持稳定和可溶性。通过亲和层析纯化的整体效果也对洗脱物种 (如咪唑) 在纯化过程中的不同步骤中的浓度敏感。在本工作中, imac 的临界缓冲条件为 e-prd 的 ph 值和维姆罗德的咪唑浓度。为了避免在 imac 柱的初始洗脱后, e-prd 需要7.5 的 ph 值。在 imac 纯化 vimrod 时, 在柱洗步骤中将咪唑的浓度从30到 50 mm 增加, 对最终洗脱效果的纯度有了显著提高。在洗脱步骤中, 还将咪唑的浓度从250米提高到 350 mm, 提高了最终洗脱的收率。最初尝试使用 250 mm 咪唑洗脱蛋白质导致了不完全洗脱的维姆罗德, 这是揭示了最后 1 m 咪唑条的列 (数据未显示)。将洗脱的咪唑浓度增加到 350 mm, 足以恢复与色谱柱结合的所有蛋白质。s 可以起到双重用途, 因为它可以作为蛋白质纯化的抛光步骤, 同时进行缓冲交换。缓冲交换是后续结合分析的关键步骤, 因为它去除了用于洗脱 his6 标记蛋白的咪唑。它还可以作为一个机会来改变条件, 如盐浓度或 ph 值, 这可能会影响某些下游技术或检测的效力。蛋白质热转移 (pts) 可用于确定下游检测的最佳缓冲液, 特别是对于那些在室温8,9下需要长时间稳定蛋白质的缓冲液。
绑定分析
新鲜制备的蛋白质对于准确的结合检测至关重要, 尽管冷冻蛋白也可以使用, 只要结果进行比较。丝状蛋白 (如 vimentin) 以盐和 ph 值依赖的方式多化, 因此溶液条件需要优化, 寡聚状态需要用 sec10、11、动态光散射等方法进行估计12或分析超离心 13, 14,15.核磁共振光谱非常适合测量原子分辨率下小蛋白质的配体相互作用。然而, 当蛋白质与较大的分子相互作用时, 就会产生较慢的翻滚, 这就会导致信号丢失, 这可以确认结合, 尽管它不一定允许映射结合位点, 这也需要至少分配脊椎共振。在这种情况下, nmr 实验不允许识别交互站点。因此, 现场定向诱变被应用于识别结合所需的关键残留物。因此, 这种突变体不会表现出信号丢失。在该协议中, 在1914年位置进行替换的突变形式保留了 vimrod 存在的峰值强度, 从而证实了 e-prd 和 vimrod 相互作用的中断。主干和侧向共振的分配将增加这一方法的价值, 特别是因为自由 e-prd 的结构已经通过 x 射线晶体学4解决.nmr 的未来应用包括对较大分子之间复杂相互作用的表征, 并将受益于超高场磁体和使用其他可观察到的基团, 如13个c 标记和三氟甲基基团作为记者。
mst 在研究绑定相互作用方面有许多优点16。具有约束力的伙伴在解决方案方面是自由的, 不会被固定。对样品质量的分析被纳入软件中, 对聚集、吸附毛细血管或目标分子荧光标记不足进行了质量控制报告。通常使用少量的目标, 标记的目标的浓度通常在 20-50 nm 之间, 在10-20μl 体积反应中。该协议使用非常小的反应体积 (10μl) 来最大限度地提高配体的浓度, 这可以在滴定中实现, 从而可以对弱结合相互作用进行表征。这就需要精确的移液和注意, 以避免引入气泡, 同时仍然彻底混合。充分的混合对于沿一系列连续稀释进行准确、一致的荧光测量至关重要。mst 实验中的 teween-20 量从标准的0.015 减少到 0.015, 以降低产生气泡的倾向并改善混合。
red-tris-nta 染料提供了一种快速、简单和方便的方法来荧光标记任何带有他的标签的蛋白质。标签在短短30分钟内就能有效完成, 而且非常紧密, 因此无需去除染料的程序。不会对蛋白质中的氨基酸残基进行任何修改, 这可能会改变配体的结合特性。需要注意的是, 只有要标记的蛋白质才应该有 his6 标签。这就需要从配体蛋白 e-prd 中对标签进行裂解, 并通过第二个 imac 柱步骤去除标签和未分离的 e-prd。如果可能的话, 配体蛋白应该在不使用他的标签的情况下制备。或者, 蛋白质可以通过胺与赖氨酸残基的偶联或硫醇与半胱氨酸残基的偶联, 共价标记为含氟物质。但是, 在使用这种系统时必须小心, 因为荧光体的共价附着可能会影响依赖赖氨酸或半胱氨酸残留物的静电或极性结合相互作用。mst 对 vimrod 与 e-prd 结合亲和力的定量对盐浓度异常敏感。最初将目标和配体透析成同一批检测缓冲液, 缓解了这一问题。然而, 由于 vimrod 的复杂行为, 在 150 mm 氯化钠存在的情况下进行 mM 结合曲线的饱和度无法达到。一旦氯化钠浓度降低到 10 mm, 就获得了可靠、完整的数据, 从而可以准确地计算 kd.因此, 建议仔细优化溶液条件, 并与补充检测进行比较, 以获得稳健的结果。此外, mst 可用于量化给定相互作用的盐依赖性, 量化蛋白质相互作用的化学计量特性, 监测蛋白质折叠, 并探测酶动力学17。
Disclosures
提交人没有透露利益冲突。
Acknowledgments
该项目得到了 nserc rgpin-2018-04994、校园艾伯塔省创新方案 (rcp12-002c) 和艾伯塔省普瑞翁研究所/艾伯塔省创新生物解决方案研究所 (2016188年) 的支持, 颁发给了加拿大和加拿大的 m. o. 和 genome 基金会。向代谢组学创新中心 (tmic) 和国家统计局发放创新金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
| His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
| Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
| HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
| HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
| TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
| BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
| TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
| Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
| Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
| D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
| DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
| Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
| NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
| TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
| MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
| MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |
References
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