Artigo de método

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

DOI:

10.3791/58542

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18 de janeiro de 2019

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1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós apresentamos um protocolo para murino na vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular com biotina. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar endógena imunoprecipitação da proteína de interesse.

Resumo

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Proteinúria resulta do rompimento do filtro glomerular que é composto o endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos com seus diafragmas de fenda. A estrutura delicada do filtro glomerular, especialmente o diafragma de fenda, baseia-se sobre a interacção das proteínas de superfície celular diversos. Estudar estas proteínas de superfície celular até agora tem sido limitada a estudos em vitro ou análise histológica. Aqui, apresentamos um biotinylation murino na vivo rotulagem método, que permite o estudo de proteínas de superfície celular glomerular sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar imunoprecipitação endógena de uma proteína de interesse. Semi quantificação da abundância de superfície celular glomerular é prontamente disponível com este novo método e todas as proteínas acessíveis à perfusão de biotina e imunoprecipitação pode ser estudada. Além disso, o isolamento de glomérulos com ou sem biotinylation mais permite análise da glomerular RNA e proteína, bem como a cultura de células glomerular primária (ou seja, cultura de células primárias podocyte).

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinúria é uma marca registrada de lesão glomerular e acompanha geralmente o rompimento do filtro glomerular1. O filtro glomerular é composto o endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos. A delicada estrutura molecular do filtro glomerular é altamente dinâmico e sujeito a proteína de superfície celular tráfico de ambos os rins saudáveis e doentes,2,3,4,5,6 . Endocitose de proteínas de superfície celular tem demonstrado ser essencial para a sobrevivência dos podócitos7. Nefrina e podocalyxin são proteínas transmembrana expressadas em podócitos. Nefrina é a espinha dorsal do diafragma fenda glomerular, enquanto podocalyxin é um sialoglycoprotein revestimento os processos secundários pé de podócitos8,9,10. Endocítica tráfico tem sido mostrado anteriormente para Nefrina podocalyxin3,11,12,13,e14.

O melhor de nosso conhecimento, endocitose das proteínas de superfície celular ainda não foi descrita em células endoteliais glomerulares na literatura. No entanto, as células endoteliais expressam em geral todas as proteínas necessárias para os diferentes tipos de endocitose (ou seja, dependente da jangada, dependente de Clatrina endocitose)15,16. Portanto, a célula endotelial tráfico de superfície pode ser estudado com esse método, usando, por exemplo, vascular endothelial (VE)-caderina e molécula de adesão intracelular (ICAM-2), como uma célula de superfície proteínas marcador para células endoteliais glomerulares17 .

Infelizmente, não há nenhum modelo exato em vitro para o delicado filtro glomerular em três camadas no qual célula tráfico de proteína pode ser estudado. O objetivo desse método é, portanto, para estudar proteína glomerular de tráfico na vivo. Além disso, este protocolo contém informações sobre como isolar os glomérulos, permitindo ainda mais a análise do RNA, proteínas ou células glomerular. Semelhante isolamento glomerular técnicas têm sido descritas por diferentes grupos de18,19.

Anteriormente, nós e os outros têm usado ex vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular por biotinylation2,3,4,20,21. No entanto, neste método ex vivo , glomérulos isolados foram expostos ao estresse mecânico, que pode influenciar o tráfico endocítica. Alternativamente, imunofluorescência rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular tem sido usado extensivamente na literatura2,20,22. Com este método, no entanto, apenas um pequeno número de proteínas pode ser analisado dentro de um slide, e quantificação das imagens de imunofluorescência é muitas vezes difícil.

Este método de romance na vivo oferece uma ferramenta confiável para estudar células glomerulares proteína abundância e tráfico com precisão em saudáveis e doentes os rins, e pode ser usada como um complemento para testes de imunofluorescência.

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Protocolo

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Os ratos foram obtidos como uma raça in-house da instalação de cuidados animais locais ou de Janvier Labs em França. As investigações foram conduzidas de acordo com as diretrizes descritas no guia de cuidados e uso de animais de laboratório (E.U. nacional institutos de saúde publicação n º 85-23, revista em 1996). Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as aprovações institucionais relevantes (governo do estado LANUV AZ:84 número de referência-02.04. 2016.A435).

1. preparação dos instrumentos, soluções e equipamentos

  1. Preparar 1 L de solução salina tamponada fosfato suplementada com 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 0,1 mM de cloreto de cálcio (CaCl2) (PBSCM) e filtrá-la através de um filtro estéril.
  2. Prepare-se 5 mL de PBSCM estéril por rato para perfusão e colocá-lo no gelo.
  3. Para cada rato, prepare-se 5 mL de estéril PBSCM suplementado com biotina 0,5 mg/mL.
  4. Para cada rato, prepare-se 5 mL de PBSCM estéril e adicionar 0,8 x 108 de grânulos magnético (ex., 200 µ l de uma solução de grânulos/mL de 4 x 108 , sem tratamento prévio) para embolização de glomérulos. Prepare esta solução debaixo do banco de cultura de células para manter os grânulos magnéticos no original tubo estéril. Coloque esta solução no gelo.
  5. Preparar uma solução de resfriamento pela adição de glicina 100 mM para PBSCM (5 mL por rato) e mantê-lo no gelo.
  6. Fazer uma solução de colagenase (colagenase U/mL 0.378 A em PBSCM estéril). Por rato, Pipetar 1 mL da solução de colagenase em um tubo de 2 mL e colocá-lo no gelo.
  7. Para lavar, preparar estéril PBSCM (consulte a etapa 1.1) em 50 mL de um tubo e colocá-lo no gelo.
  8. Para perfusão, use uma bomba de seringa com um fluxo de 2,0 mL/min.
  9. Prepare uma seringa de 10 mL com agulha 21G. Colocar a ponta da agulha em um cateter de longa 20-30 cm (diâmetro interno, ID = 0,58 mm). Conectar o cateter (ID 0,58 mm) com um cateter curto 10cm (ID 0,28 mm) e corte a ponta do cateter menor oblíquo para uma fácil inserção na aorta de rato.
  10. Para procedimentos de ligadura durante a cirurgia, corte três 5-7 cm fios de seda (4-0, 6-0) por rato.
  11. Para a cirurgia, prepare-se 3 grampos cirúrgicos, 2 tesouras cirúrgicas, 2 pinças, 2 pinça fina, 1 tesoura fina e cotonetes. Prepare a anestesia (por exemplo, anestesia intraperitoneal cetamina 100mg/kg de peso corporal e xilazina 5 mg/kg de peso corporal).
  12. Para o isolamento de glomérulos de dois rins, use um coador de célula de 100 µm, dois tubos de 50 ml e um apanhador de ímã.
  13. Preparar CHAPS lise: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CAPS); 20 mM Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris) pH 7,5; sodiumchorlide de 50mm (NaCl); sodiumfluoride de 50mm (NaF); 15 mM at4P2O7; pH de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 0,1 mM 8.0; sodiumorthovanadate 2 mM; e adenosinetriphosphat de 2mm (ATP).
  14. Centrifugadores legais a 4 ° C.

2. cirurgia sob o microscópio

  1. Anestesiar o mouse (por exemplo, com xilazina/cetamina intraperitonealmente, consulte a etapa 1.11). Realize o teste do dedo do pé-beliscão para confirmar a anestesia adequada.
  2. Desinfecte o lado ventral do mouse com isopropanol 70%.
  3. Executar um corte mediano através da pele da pelve ao esterno e retirar a pele a fáscia abdominal usando uma pinça. Corte a pele em ambos os lados no meio do abdômen com tesoura cirúrgica.
  4. Alterar os instrumentos cirúrgicos. Aplique um corte mediano da xifoide até a bexiga através da camada muscular abdominal e dividi-los em quatro quadrantes, usando uma pinça e tesoura cirúrgica. Anexe o lado dois superior com grampos na direção do pescoço do mouse com duas pinças cirúrgicas.
    Nota: O abdômen está agora aberto.
  5. Colocar os órgãos viscerais à parte com um cotonete estéril e corte do ligamento frênico-hepática com uma tesoura bem.
  6. Prepare uma ligadura (com um fio de seda 4-0 a 6-0) em torno da aorta proximal das artérias renais na altura da glândula supra-renal com duas pinças bem. Aperte a ligadura da aorta proximal para abolir o fluxo sanguíneo com uma pinça.
  7. Livre a aorta distal da fáscia, gordura e outros tecidos e preparar uma ligadura ao redor da artéria hepática/mesentérica cranial das artérias renais usando uma pinça cirúrgica bem.
  8. Preparar uma ligadura (com um fio de seda 4-0 a 6-0) em torno da aorta distal das artérias renais e fixar a veia cava e aorta na altura da bifurcação.
  9. Corte um furo pequeno na aorta distal às artérias renais para que o buraco é metade do diâmetro da aorta. Colocou o cateter na aorta e corrigi-lo com a ligadura preparada.
    Atenção: Evite bolhas no sistema de perfusão para evitar embolia gasosa.
  10. Inicie a perfusão com o PBSCM gelada em uma taxa de fluxo de 2 mL/min.
  11. Corte um buraco na veia renal a nível das artérias renais com tesoura cirúrgica fina e aperte a ligadura ao redor das artérias hepáticas e mesentéricas.
    Nota: A rins devem empalidecer após o início da perfusão.

3. in Vivo Biotinylation

  1. Mudança da seringa, livre de bolhas para PBSCM gelada suplementado com biotina 0,5 mg/mL para a rotulagem de superfície e perfundir rins com 5 mL em uma taxa de fluxo de 2 mL/min.
    Nota: Misture as soluções PBSCM (por exemplo, rodando os tubos de 50 mL) suavemente para evitar a formação de bolhas dentro da solução. Após a aspiração da solução dentro da seringa, evacue quaisquer bolhas ou o ar da seringa. Use uma cânula extra (21G) na seringa para preencher o espaço na cânula que está conectado ao sistema de cateter. Finalmente, enfiar a seringa dentro da cânula com o cateter sem bolhas.
  2. Altere a seringa sem bolhas para PBSCM gelada suplementado com glicina 100 mM para saciar os glomérulos e perfundir com 5 mL em um fluxo de 2 mL/min.
  3. Mudança da seringa, livre de bolhas para PBSCM gelada suplementado com 200 μL magnético grânulos/mL e perfundir os rins em 2 mL/min.
    Nota: Na superfície renal, embolização de glomérulos com grânulos magnéticos marrons será visível.

4. isolamento de glomérulos de dois rins

  1. Remova os rins no hilo e a cápsula. Coloque os rins no gelo em 15 mL de PBSCM em um prato de cultura de célula de 10 cm. Eutanásia o mouse com deslocamento cervical sob anestesia depois da colheita, os rins. Os procedimentos de cirurgia e perfusão duram aproximadamente 20-22 min.
  2. Corte os rins nas peças de menores possível com uma nova lâmina de dois gumes. Mover o tecido em um tubo de 2 mL com 1 mL de colagenase A (ver passo 1.6) e digerir a 37 ° C por 30 min. Antes e depois da digestão, misture delicadamente com uma 1000 μL cortar a pipeta.
  3. Lave o tecido digerido através de um filtro de célula 100 μm usando PBSCM gelada. Suavemente, use o célula-raspador para picar o restante através de tecido o filtro célula e enxaguá-lo com PBSCM gelada depois de um volume total de 50 mL.
  4. Centrifugar a suspensão a 4 ° C 500 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado com pouco menos de 1,5 mL de PBSCM gelada enquanto num Vortex a pelota. Depois, colocar a suspensão glomerular em um novo tubo de 2 mL.

5. lavar roupa

  1. Use o apanhador de ímã para puxar os glomérulos para um lado. Aguarde 1 minuto antes de glomérulos moveram-se em direção do ímã.
  2. Remova o sobrenadante com uma pipeta μL de 1000 enquanto o tubo 2 mL permanece no apanhador de ímã. Durante a lavagem de primeira e segunda etapas (consulte a etapa 5.3), 250 μL do sobrenadante permanece dentro do tubo para evitar a perda de glomérulos. Execute este procedimento rapidamente para evitar deixar estruturas tubulares afundar até o fundo do tubo.
    Nota: O procedimento de lavagem durará mais tempo caso contrário.
  3. Retire o tubo de 2 mL do apanhador de ímã e adicionar 1 mL de PBSCM, pipeta e descer (muito importante), então vórtice.
  4. Volte a colocar o tubo no apanhador de ímã e recomeçar com passo 5.2.
  5. Repita as etapas de lavagem até que a pureza dos glomérulos atingiu 90%. Por isso, examine uma representante alíquota do sobrenadante sob um microscópio (40-100 X).
    Nota: Glomérulos aparecerá como rodadas estruturas contendo grânulos magnéticos marrons. Estruturas alongadas são fragmentos tubulares e grânulos magnéticos livre aparecem como pontos de ronda marrons. Os restos da célula podem aparecer como estruturas volumosas.
  6. Se a pureza é alcançada, estime a contagem de glomérulos dissolvendo os glomérulos em 1 mL de PBSCM. Após a mistura, pegue uma alíquota de 10 μL e conte os glomérulos sob o microscópio. Calcular o número de glomérulos com a seguinte equação: número final de glomérulos = número de glomérulos em 10 μL x 100 alíquota.
  7. Bem sucedido isolamento dos glomérulos leva a uma variedade de 10.000 40.000 glomérulos.

6. a proteína extração e imunoprecipitação (IP)

  1. Glomérulos cobrar por centrifugação a 4 ° C a 6800 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante enquanto estiver usando um apanhador de ímã e resuspenda o pellet em gelada do lysis (EG., 30.000 glomérulos em 300 μL; CAMARADAS, ver passo 1.11). Homogeneizar as amostras com um homogeneizador na velocidade máxima por 30 s e lyse-los no gelo por 30 min.
  2. Remover o material insolúvel por centrifugação a 15.000 x g, durante 30 min para 4 ° C. Pipete o sobrenadante, que inclui a célula lisada para um novo tubo de 1,5 mL. Descarte a pelota.
  3. Medir a concentração de proteína do líquido sobrenadante usando um bicinchoninic (BCA)-com base em método seguindo as instruções do fabricante. Uma bem sucedida lise de 30.000 glomérulos cede a uma quantidade de proteína glomerular 700-1.000 µ g/ml. Ajuste a quantidade de proteína igual com Lise.
  4. Tomar uma alíquota de 10% do volume total para glomerular lisado e adicionar 2 x Laemmli + dithiothreithol (TDT) antes de incubação por 5 min a 95 ° C.
  5. Para IP, incube o resto do lisado com grânulos de agarose streptavidin durante a noite a 4 ° C, um agitador de sobrecarga.
  6. Centrifugue os grânulos de agarose a 1000 x g por 3 min a 4 ° C, remover o sobrenadante e adicionar 800 μL de tampão de Lise para lavar os grânulos para o emperramento da proteína inespecíficos.
  7. Repita a lavagem 3 vezes e remover o sobrenadante completamente.
  8. Adicionar 30 μL de 2 x Laemmli + TDT e incubar a 95 ° C por 5 min.
  9. Carregar o lisado e sondas IP em um SDS 10% gel e funcione o gel de SDS V de 70 por 30 min, em seguida, a 20 mA por gel para 1,5 h. depois, borre o gel por 2 h em 200 mA em uma membrana de nitrocelulose.
  10. Bloquear a membrana de nitrocelulose durante a noite a 4 ° C, com 5% albumina de soro bovino (BSA) no tampão de lavagem.
  11. Incubar a membrana com o anticorpo de interesse durante a noite a 4 ° C. Lavar com buffer de 3 vezes por 5 min num agitador de lavagem e incubar a membrana com o anticorpo secundário HRP-marcados por 1h à temperatura ambiente. Repita a etapa de lavagem.
  12. Visualize o lisado e imunoprecipitação sondas na membrana, usando um agente quimioluminescente Super-resolução com uma câmera CCD.

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Resultados

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Para isolar glomérulos com precisão, é necessário perfundir murino rins com PBSCM primeiro. Perfusão com PBSCM transforma os rins pálidos (Figura 1A). Embolização de glomérulos com grânulos magnéticos será visível como pontos marrons na superfície do rim (Figura 1B). Isolamento de glomérulos com o apanhador de ímã pode apresentar contaminação com túbulos renais (Figura 1

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método apresentado permite isolamento bem sucedido de glomérulos para investigar glomerular RNA ou proteína. Além disso, culturas de células glomerular primária podem ser realizadas de glomérulos isolados. Se biotina é aplicada antes de isolamento glomerular, rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular pode ser executada. Com este método, na vivo celular glomerular proteína tráfico pode ser estudado, e semi quantificação da abundância de proteína é possível. Os passos mais críticos para o teste co...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecer Blanka Duvnjak pela sua assistência técnica excepcional. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 para M.W. e QU280/3-1 para QI. O financiador não tiveram nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados, análise de dados, a decisão de publicar e preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Motic SMZ168 BLMoticmicroscópio SMZ168BLpara cirurgia de camundongos
KL1500LCDPulch e microscopia Lorenz150500luz para cirurgia de camundongos
Rompun (Xylazin) 2%BayerPZN:01320422anestesia
MicrofederschereBraun, tesoura fina AesculapFD100R, para corte na aorta
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rpara corte abdominal
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rpara cirurgia até que o abdômen seja aberto
Prä parierklemmeAesculapBJ008Rpara cirurgia 
SeraflexSerag WiessnerIC108000fio de seda
Cetamina 10%Medistaranestesia
Rompun (xilazina) 2%anestesia Bayer
Tubo de polietileno de furo fino ID 0,28 mm OD 0,61 mmPortex800/100/100Cateter
Tubo de polietileno de furo fino ID 0,58 mm OD 0,96 mmCateter Portex800/100/200
Aparelho Harvard 11 PlusHarvard Apparatus70-2209bomba de seringa
EZ-link Sulfo-NHC-LC-BiotinaThermo Scientific21335biotina
Dynabeads Células T de camundongo intocadasInvitrogen11413Dpara embolizar glomérulos
Colagenase ARoche10103578001para digerir o tecido renal
DynaMag-2InvitrogenColetor de ímã123.21D
100µ corante de células mGreiner-bio542000para isolamento glomerular
Axiovert 40 CFLZeissnão disponívelpara confirmar a pureza glomerular
TissueRuptorQuiagen9002755Homogeneizador de tecidos
CHAPSSigma-AldrichC3023para tampão de lise
Tris-HCLSigma-AldrichT5941para tampão
Produtos químicos NaClVWR27810295para tampão de lise
NaFSigma-Aldrich201154para tampão de lise
EDTASigma-AldrichE5134para tampão de lise
ATPSigma-Aldrich34369-07-8para tampão de lise
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Siga as instruções do fabricante
anticorpo de nefrinaProgenGP-N2para westernblot
Anticorpo policlonal de cabra anti-podocalixinaR & D SystemsAF15556-SPpara westernblot
Streptavidin Agarose ResinThermo Scientific20347para imunoprecipitação
Proteína A sepharose CL-4BGE Healthcare17096303para imunoprecipitação
anticorpo policlonal de coelho anti-p57SCBTsc-8298para imunohistoquímica
anticorpo monoclonal de actina anti-beta de camundongo, clone AC-74Sigma-AldrichA2228Western blot controle de carga
coelho anti-p44 / 42sinalização celular4695para westernblot
Pierce Streptavidina-HRP de alta sensibilidadeThermo Scientific21130
camundongo policlonal westernblot ICAM-2 anticorpo R& D SystemsAF774para
camundongo policlonal westernblot anti-VE-caderinaR& D SystemsAF1002para westernblot
de lise para

Referências

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Glomerular IsolationIn Vivo BiotinylationCell Surface Protein LabelingKidney PerfusionMagnetic Bead PurificationGlomerular Cell Surface ProteinsNephrin Podocalyxin AnalysisImmunoprecipitation MethodProtein Trafficking StudyPrimary Podocyte Culture

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