Baseado na morfologia distinção entre saudável e patológico células utilizando transformações de Fourier e auto-organização mapas

Oportuna, simples e precisa de determinação do estado patológico do tecido biológico é do maior interesse na investigação biomédica. Modelos de mouse fornecem os meios para estudar uma variedade de condições patológicas, tais como reações imunes ou desenvolvimento de câncer, em combinação com 3D complexas e técnicas de microscopia de 4D (3 dimensões espaciais e tempo). Estudos de microscopia podem ser realizada através de intravital ou tecido extirpado 2-fotão microscopia, microscopia de luz-folha e - a uma profundidade limitada de tecido de aproximadamente 100 µm-pela microscopia confocal. Para obter informações relacionadas ao tempo, sobre o comportamento das células sob condições fisiológicas ou patológicas, é necessário monitorar o tecido por um período prolongado de tempo, o que geralmente requer intravital imagem^1,2 . Naturalmente, a aplicabilidade desta técnica é limitada a modelos animais devido a sua capacidade de invasão. Técnicas não-invasivas também estão disponíveis para aplicações em seres humanos, incluindo uma variedade de métodos de tomografia computadorizada (CT, listas, etc.), mas todos esses métodos têm o necessário espacial - e frequentemente-resolução temporal para estudar o comportamento a nível celular.

Informação estática sobre a aparência das células pode ser mais facilmente acessível através de 3D várias técnicas de imagem executado na extirpado amostras de tecido. Aqui, o comportamento cinético das células não é medido, assim, é necessário adotar técnicas de análise de romance que são capazes de determinar o status de patogenicidade das células examinadas com base unicamente em sua morfologia³. Esta abordagem foi usada para vincular a célula formas e texturas de tecido para comportamento patológico^4,5,6.

Na nova técnica descrita aqui, as células são reconstruídas como superfícies 3D e suas formas são caracterizados através de projeções 3D-para-2D e periferia-forma baseada em Fourier sucessivas análises^7,8. Reduzindo as dimensões de 3 para 2, o problema é simplificado. Também é possível caracterizar as superfícies de células em 3D através da aplicação de análise de harmônicos esféricos, como tem sido feito para imagens médicas⁹. No entanto, harmônicos esféricos não manipular formas nítidas e robustos, exigindo uma grade de multi-escala para estabelecer-se na esfera da unidade. Além disso, o número de componentes necessários harmônicos esféricos pode ser grandes (50-70), com os cálculos subjacentes muito exigente e os resultados difíceis de interpretar^10,11,12.

Com nosso método recentemente proposto, a tarefa é reduzida a uma série de descrições de forma 2D, onde o número das projeções 2D é até o analista e pode ser ajustado de acordo com a complexidade da forma 3D. As projeções são geradas automaticamente através de um script Python que é executado dentro de uma ferramenta de animação 3D. As projecções 2D são descritas pelos discretos componentes Fourier transform (DFT) de sua periferia, calculado por um plugin de¹³ Fiji fornecida aqui como parte de nosso pacote de software. A DFT é aplicada aqui para decompor a complexa estrutura de tópicos da célula em uma série de funções sin e cos. Desta forma, podemos descrever o contorno com um número relativamente pequeno de componentes DFT, reduzindo assim a complexidade do problema (para mais detalhes consulte a secção de equações). Os componentes DFT são colocados no mapa auto-organizável treinados (SOM¹⁴), onde a existência de forma aglomerados podem ser objetivamente testado⁸. SOMs fornecem uma ferramenta de aprendizagem competitiva e sem supervisão da área de inteligência artificial. Eles consistem de uma matriz vinculado de neurônios artificiais, que comunicam entre si através de uma função de distância do bairro ponderada. O sistema neuronal responde para o primeiro elemento do conjunto de dados de entrada e os neurônios, cuja resposta é o mais forte são "agrupados" mais perto um do outro. Como o sistema neural recebe mais de entrada, neurônios de dados que repetidamente respondem fortemente começam a formar o cluster bem definido dentro do sistema. Após treinamento apropriado em um grande conjunto de dados que contém informações de forma 2D em forma de um conjunto de componentes DFT, componentes do qualquer célula individual DFT podem ser colocados no SOM treinado e revelam-se provável a célula pertence a saudável ou o grupo de células patogênicas. Esperamos que tal ferramenta para se tornar uma grande adição para os métodos de diagnósticos clínicos e científicos.

1. requisitos do protocolo

1. Obter dados de alta resolução deconvolved tridimensional (3D) microscopia deconvolved em conformidade com o critério de Nyquist, com um intervalo de amostragem de pelo menos duas vezes a mais alta frequência espacial da amostra para obter uma imagem de alta resolução.
2. Use o software de renderização 3D para a reconstrução de superfície e exportação.
3. Use o software de animação 3D capaz de executar scripts Python (o script Python pode ser baixado do repositório github: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) para criar projeções 2D.
4. Use Fiji¹³ para analisar projeções 2D e extrair os componentes DFT.
   1. Use a distribuição atual de Fiji. Se já existe uma versão instalada do Fiji, certifique-se que a versão instalada é a mais recente. Isto pode ser facilmente conseguido executando a ajudar | Opção de atualização .
   2. Use o contorno ativo plugin¹⁵, que pode ser baixado de http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start e deve ser copiado para a pasta plugins.
   3. Baixe o plugin de Fiji sombra do repositório github e copiar para a pasta plugins.
5. Use um software de matemática computacional capaz de calcular mapas auto-organizável.

2. Reconstrua a imagem 3D.

Nota: Para fins de teste, um conjunto de dados de exemplo é fornecido no github repositório (veja acima).

1. Inicie o software de reconstrução 3D e abrir os dados de imagem 3D.
2. Crie uma superfície 3D do objeto (s) (todos).
   1. Selecione a opção de visualização 3D e clique em superfícies. Clique no próximo botão (círculo azul com um triângulo branco) para prosseguir com o assistente de criação de superfícies.
   2. Selecione o canal de imagem para a reconstrução da superfície.
   3. Aplica uma função de suavização para evitar superfícies porosas.
      1. Escolha um valor de alisamento que não esconde os detalhes da superfície mas evita superfícies porosas.
   4. Selecione um método de limiarização para encontrar nas superfícies.
      1. Quando os objetos são bem separados do plano de fundo e tem um nível de brilho aproximadamente uniforme, use um limiar de intensidade absoluta.
      2. Aplica um limiar de contraste local quando os objetos variam em sua intensidade, mas ainda podem ser separados do contexto local e de outros objetos em torno deles. Defina a área de busca de limiar local de acordo com o valor do diâmetro do esperado dos objetos reconstruídos.
   5. Filtrar as superfícies reconstruídas de acordo com parâmetros morfológicos de interesse, por exemplo, volume, esfericidade, relação de superfície e o volume, etc.e terminar a reconstrução de superfície.
3. Salvar e exportar as superfícies geradas em um formato que é compatível com o software de animação 3D que será usado na próxima etapa.

3. transformar o 3D reconstruída superfícies em 2D projecções

1. Liquidificador e vá para a guia de saída na janela do lado direito. Selecione o formato TIFF no menu suspenso e definir a profundidade de cor de 8 bits RGBA.
2. Alternar para o modo de criação de scripts e abra o arquivo de script fornecido "GUI_AutoRotate.py" do repositório fornecido com este trabalho (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
3. Clique em executar Script. Escolha a pasta dos arquivos wrl quando solicitado para a entrada.
4. Se necessário, criar mais rotações quando se trabalha com superfícies mais complexas: Vá para o GUI e definir a caixa de rotações para um valor acima de 6.
   Nota: Uma rotação de 6 diferentes ângulos pode ser suficiente para distinguir as populações de células diferentes. Não é aconselhável criar menos de seis rotações por superfície, devido à potencial perda de informações.
5. Execute o script clicando no botão Rotate no GUI. Salve as projeções das superfícies individuais na mesma pasta que foi usada como a pasta de entrada (etapa 2.3). Por padrão, as imagens são salvas em um 8 bit Tiff formato (ver passo 2.1), que é o formato exigido pelo plugin Fiji sombra.

4. encontre a periferia e calcular os componentes de Fourier usando Fiji.

1. Abra a Fiji e selecione sombra no menu Plugins. Comece com os valores padrão e ajustar os parâmetros mais tarde. Clique em Okey quando estiver pronto para executar o programa.
   1. Escolha um valor de Limite de gradiente para o limiar da entrada imagem.
   2. Escolha o número de iterações. Quanto maior o valor do Número de iterações , o mais preciso a reconstrução da periferia. Para formas mais simples, um número inferior é geralmente suficiente.
   3. Use o parâmetro de Número de dilatações para determinar quanto maior a máscara inicial é comparada com o real da célula. Geralmente formas mais complexas precisam de mais etapas de dilatação para encontrar periferia apropriada.
   4. Marque a caixa de Fundo escuro , se as formas projetadas são mais brilhantes do que o plano de fundo.
   5. Ative a caixa de seleção Mostrar resultados intermediários somente quando estiver usando um dataset de pequeno teste para determinar o desempenho da máscara. Ativar esta opção para grandes conjuntos de dados reduz a eficiência computacional e possivelmente poderia interromper um sistema com pouca memória de vídeo.
   6. Verifique a caixa de seleção Salvar tabelas de resultado para usar os resultados de sombra como uma entrada para o passo 5. Se a caixa estiver marcada, todos os resultados são salvos em arquivos csv individuais. Um resumo dos dados de saída é sempre gerado em um arquivo chamado "Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv".
2. Selecione a pasta de dados de entrada que contém os arquivos TIFF que foram criados na etapa 3.
3. Fornece a pasta de dados de saída.
4. Clique em Okey para iniciar o plugin.

5. auto-organização mapas

Nota: As redes SOM só são capazes de classificar os dados quando eles são treinados em um grande conjunto de dados que contém a entrada de todos os tipos de células esperado e condições. Para fins de demonstração, um conjunto de dados é fornecido e pode ser encontrado em nosso repositório ("AllCells_summary_normalised.csv" de https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis

1. Siga estas diretrizes, se não houver nenhum SOM treinado disponíveis ainda para os dados de entrada; caso contrário, prossiga para a etapa 5.2.
   1. Inicie um software de matemático computacional capaz de realizar classificações de rede neural.
   2. Selecione um arquivo de dados a ser utilizado para a formação da rede SOM. Este conjunto de dados deve conter todas as condições experimentais, a fim de treinar o SOM sobre os tipos de célula específica e condições experimentais.
      Nota: Também é possível utilizar o fornecido AllCells_summary_normalised.csv para testar o sistema.
   3. Iniciar o treinamento e espere até que a formação é concluída antes de prosseguir. Por padrão, o script é definido para executar iterações de 2000 ("épocas").
      Nota: O número de iterações depende da taxa de aprendizado de SOM. Dependendo dos dados de entrada é aconselhável testar maior e menor número de épocas e observar a estabilidade do padrão de SOM. Ao usar o script fornecido, o número de iterações pode ser mudado sob linha 32. O tamanho da rede pode ser alterado na linha 34 (por padrão que ele é definido como 12 por 12).
   4. Concluída a formação, examine a topologia da rede (distâncias vizinho, entrada de aviões, sucessos de amostra, etc.). A rede agora é treinada e pode ser salvos para uso futuro.
2. Carregar o SOM, quando usando um mapa já treinado (isto pode vir a passo 5.1 ou de outras fontes) para um conjunto de dados de cluster.
   1. Importar o arquivo csv que está a ser testado com som pré-carregado treinados. Selecione a saída csv do Plugin sombra da etapa 4 quando usando dados preparados pelo plugin sombra.
      Nota: Também é possível usar os arquivos de dados de exemplo "InteractingCells_summary_normalised.csv", "MobileCells_summary_normalised.csv" ou "PhagocytosingCells_summary_normalised.csv" que são fornecidos através do github.
   2. Concluída a classificação, avalie os resultados de SOM como na etapa 5.1.5.
      1. Examine o hitmap gerado a partir do arquivo csv. Cada célula do mapa mostra quantas vezes o dataset "bate" essa célula específica de som treinados. Quando um grupo de células são agrupadas em uma pequena área deste mapa, isso indica que o dataset é razoavelmente homogênea. Vários clusters indicará que subgrupos provavelmente existem no dataset.
      2. Examine as distâncias de peso do bairro. Áreas do mapa que são bem separadas correspondem a grupos de objetos que têm um comportamento muito diferente de SOM ponto de vista. Com componentes DFT como dados de entrada, isso significa que esses grupos de células têm formas muito diferentes das superfícies 3D correspondentes.
      3. Examine os aviões de peso para obter informações sobre a contribuição por cada elemento do vetor de característica. No caso de utilizar os 20 componentes DFT conforme descrito anteriormente, 19 mapas aparecerá aqui. Ao usar o conjunto de dados de exemplo fornecido, os primeiros 5 ou 6 aviões de peso será diferentes, mas o resto deles aparecerá bastante semelhante. Neste caso pode concluir-se que seria suficiente para usar aproximadamente 7 DFT componentes.

Aplicamos uma DFT para calcular os componentes principais da forma correspondente para as projeções de célula. Os descritores de Fourier foram obtidos aplicando o algoritmo DFT para os pares de coordenadas xy da periferia equipada de projeções da célula, obtido como a saída da parte AbSnake do nosso fluxo de trabalho. Esses pares de xycoordinate podem ser tratados como um vetor 2D valores complexos "g":

Do vetor "g", usamos DFT para calcular o valores complexos espectro de Fourier:

Com base em fórmulas conhecidas do espectro de Fourier discreto e usando o número complexo rotulagem de "g" como:

Nós temos:
(1)
Podemos calcular a real ("A") e o imaginários componentes ("B") de :
(2)
(3)
Aqui, o primeiro DFT componente G0 corresponde a m = 0, o que dá:
(4)
(5)
Consequentemente, este componente descreve o centro geométrico do objeto original.
O segundo elemento do espectro DFT para a frente, G1, corresponde a m = 1:

(6)

De Eq.6, podemos concluir que estes pontos formam um círculo com um raio de e ângulo inicial , onde o círculo descreve uma volta completa, enquanto a forma é traçada uma vez. O centro do círculo está localizado na origem (0, 0), o raio é | G1| e o ponto de partida é:

(7)

Em geral, para um único coeficiente de Fourier , as coordenadas são descritas como:

(8)

Da mesma forma para Eq.6, Eq.8 também descreve um círculo, mas com um raio de Rm= | Gm|, um ângulo inicial e um ponto de partida no , onde o contorno é traçado uma vez enquanto o círculo é executado através de "m" órbitas completo16,17.

Parâmetros de forma como entrada SOM
O fluxo de trabalho, conforme descrito na Figura 1, foi aplicado a um deconvolved (usando uma função de espalhar do ponto medido) microscopia intravital fóton multi dataset de pilhas microglial para caracterizar suas alterações morfológicas em saudável ou cancerosas corticais tecido de18. Vinte componentes DFT foram calculados para cada projeção 2D das superfícies 3D reconstruídas e os resultados foram usados como entrada para a formação do SOM. Sob condições fisiológicas, a microglia apresentado de uma forma bastante complexa com múltiplas, altamente ramificada processos (Figura 2a). Quando colocado em um ambiente canceroso (modelo de tumor cortical), a microglia mudado para uma forma mais simples, mais parecido com eixo (Figura 2b).

O SOM treinado foi testado para avaliar sua capacidade de distinguir entre células cancerosas e saudáveis. A população de células saudáveis foi projetada em uma única área de SOM (Figura 2C). O SOM respondeu ao dataset microglia cancerosos com uma região ativa em forma de haltere (Figura 2d). Um conjunto de dados de entrada cegamente misto constituído por componentes de forma DFT tanto o saudável e o grupo canceroso foi projetado pelo SOM em dois grupos distintos, mantendo a forma dos seus contornos individuais semelhantes dos grupos separados ( Figura 2e; Compare com 2C e 2d). Pode-se concluir que o dataset misto com êxito foi agrupado por SOM.

Testamos o desempenho de SOM, comparando suas projeções com a análise manual dos mesmos dados por um médico especialista, que classificou o conjunto de dados com base no seu comportamento espaço-temporal. O perito identificou quatro grupos distintos de células (células de descanso, fagocitose de células, células interagindo e células móveis18), que foram reconstruídos e usados para treinar um 12x12 SOM. A rede treinada (Figura 3a) mostra os grupos de alto sucesso-valor de neurônios artificiais, especialmente no canto inferior esquerdo e as médios áreas de SOM. A resposta da rede treinada também foi testada com quatro subconjuntos aleatoriamente selecionados (que não eram parte do treinamento conjunto de dados) de imagens de quatro diferentes grupos identificados pelo especialista em18. Estes subconjuntos imagem resultaram em quatro respostas bem definidas pelo SOM, como mostrado na Figura 3b. As células de descanso exibem a forma mais complexa e mostrou o mais alto nível de separação dentro da rede neural (Figura 3b "descansar" do painel). Os outros três tipos de célula identificada compartilhado um espaço comum do SOM no canto inferior esquerdo, mas caso contrário foram separados por SOM. O canto inferior esquerdo área SOM, portanto, corresponde aos valores DFT de baixo-índice.

A robustez da abordagem SOM foi testada usando o SOM treinado com três subconjuntos aleatórios do mesmo - descansando - célula tipo (não faz parte do conjunto de dados de treinamento). A resposta de SOM para esta entrada exibe uma resposta muito semelhante (Figura 3C, subconjuntos 1-3), demonstrando a robustez de nossa abordagem.

Mudanças de forma de célula dependente do tempo caracterizam-se precisamente por DFT
A fim de examinar o efeito de mudanças de tempo-dependente da forma celular sobre os componentes DFT, uma a três células por subgrupo (ver Figura 3b) foram rastreadas para 13 a 28 pontos do tempo. A Figura 4 mostra a primeira DFT dez componentes de uma célula móvel (figura 4a) e uma interação célula (figura 4b), que foram plotados em função do tempo. A célula móvel apresenta uma forma permanentemente alterando (ver vídeo complementar 4 em 8), que é refletida por uma superfície mais áspera de DFT. As explosões da amplitude DFT no primeiro terço do curso para a interação célula tempo coincidam com as mudanças de forma rápida e vasta célula conforme mostrado no Video complementar 5 em 8.

O curso de tempo de todos os componentes DFT 19 caracterizou-se também para estas duas células em três pontos de tempo separados durante o acompanhamento de uma célula móvel (Figura 5a) e de uma interação célula (Figura 5b). Os eixos perpendiculares representam, por este meio, os ângulos de seis rotação e indicam que todas as projeções são igualmente importantes para a caracterização da forma para ambos os tipos de célula.

Figura 1. Passo a passo, fluxo de trabalho do processamento de dados para identificar a célula de clustering baseado na forma de células. Reconstruído em 3D de superfícies foram usadas como entrada para o liquidificador para automatizado projeções 3D-para-2D. Localizava-se na periferia de cada projeção e componentes a DFT foram calculados. Os componentes serviram como uma entrada para um SOM treinado em Matlab, ou para treinar um novo SOM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. A aparência típica de células da microglia cortical do mouse sob condições de controle (a) e no tecido canceroso (b) Screenshots de superfícies microglia reconstruído. Projeções de SOM foram criadas a partir dos três grupos de amostras microglia do córtex do mouse: controlar uma população mista de células (e), (d) de células tumorais e células (não-tumoral) (c). Esta figura foi modificada com a permissão de8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. (, à esquerda) Mapa de auto-organização de um dataset de micróglia rato consistindo de 768 vetores de entrada de recurso. O conjunto de dados foi usado para treinar uma rede de neural artificial 12x12, usando geometria hexagonal bairro, inicialização aleatória e épocas de 2000. (um, direito) O SOM correspondente entrada aviões dos primeiros 10 componentes DFT (b) as respostas de SOM descrito na alínea a, para um VRML arquivo subconjunto aleatório cada dos tipos de quatro célula "móvel", "interação", "descanso" e "fagocíticas" como descrito na primeira Figura 5 do Et al . Bayerl 18. resposta (c) a do mesmo SOM como (, à esquerda) para três subconjuntos aleatórios do dataset inteiro (o que, portanto, não faziam parte da formação dataset) das células de"descanso"-digite superfícies 3D. A semelhança entre as três respostas é notável. Esta figura foi modificada com a permissão de8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. (uma) dependência de hora dos primeiros 10 componentes DFT durante um experimento intravital imagem de rato microglia. Este painel mostra dados para uma célula do tipo "Mobile células". O eixo x corresponde a pontos de tempo do experimento em 60 s tempo de resolução, o eixo y mostra a amplitude dos componentes DFT em unidades arbitrárias (u.a.), Considerando que o eixo z corresponde ao componente de DFT de 1 a 10. (b) como em (um), mas para uma célula de "Células interagindo" digite. Esta figura foi modificada com a permissão de8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. (a) o comportamento de todos os componentes DFT 19 de uma célula do tipo "Mobile células" no início, no meio e no final do experimento. Os números no eixo x correspondem à identificação do componente de DFT de 1 a 19. O eixo y mostra a amplitude da componente DFT em unidades arbitrárias (u.a.), enquanto o z-eixo marca os seis ângulos de rotação aleatória. (b) mesmo que em (um), mas para uma célula de "Células interagindo" digite. Esta figura foi modificada com a permissão de8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.