Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Irina E. Catrina; Livia V. Bayer; Omar S. Omar; Diana P. Bratu

doi:10.3791/58545

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Artigo de método

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

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DOI:

10.3791/58545

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4 de junho de 2019

Irina E. Catrina¹ , Livia V. Bayer¹^,² , Omar S. Omar¹^,² , Diana P. Bratu¹^,²

¹Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, ²Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Resumo

As técnicas de imagem com base em fluorescência, em combinação com a evolução da microscopia de luz, revolucionaram a forma como os biólogos celulares realizam estudos de imagem celular ao vivo. Os métodos para detectar RNAs expandiram-se extremamente desde que os estudos seminal lig a localização local-específica do mRNA ao Regulamento da expressão genética. Os processos dinâmicos do mRNA podem agora ser visualizados através das aproximações que detectam mRNAs, acoplados com os set-ups da microscopia que são rápidos bastante capturar a escala dinâmica do comportamento molecular. A tecnologia de baliza molecular é uma abordagem baseada em hibridação capaz de detecção direta de transcrições endógenas em células vivas. As balizas moleculares são sondas de ácido nucleico discriminante, em forma de hairpin, extinto internamente, mononucleotídeo, que fluorescência somente após a hibridação a uma sequência de alvos única. Quando acoplados com a microscopia de fluorescência avançada e a imagem latente de alta resolução, permitem que um realize o seguimento espacial e temporal do movimento intracelular de mRNAs. Embora essa tecnologia seja o único método capaz de detectar transcrições endógenas, os biólogos celulares ainda não adotaram totalmente essa tecnologia devido às dificuldades de projetar tais sondas para imagens de células ao vivo. Uma aplicação de software nova, pinmol, permite o projeto realçado e rápido das pontas de prova seridas melhor para hibridizam eficientemente às regiões do alvo do mRNA dentro de uma pilha viva. Além disso, a aquisição de imagem de alta resolução, em tempo real e o software de análise de imagens de código aberto, permitem uma saída de dados refinada, levando a uma avaliação mais fina da complexidade subjacente aos processos dinâmicos envolvidos no ciclo de vida do mRNA.

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para projetar e entregar balizas moleculars em câmaras do ovo do melanogaster de Drosophila . A deteção e o visualização diretos e altamente específicos de mRNAs maternos endógenos são executados através da microscopia confocal do disco giratório. Os dados da imagem latente são processados e analisados usando a deteção e o seguimento do objeto no software gelado para obter detalhes sobre o movimento dinâmico dos mRNAs, que são transportados e localizados às regiões especializadas dentro do oocyte.

Introdução

Estudos de biologia celular que visualizam eventos dinâmicos com resolução espacial e temporal foram possibiliados pelo desenvolvimento de técnicas de imagens de células ao vivo baseadas em fluorescência. Atualmente, in vivo mRNA visualização é alcançada através de tecnologias que são baseadas em interações RNA aptamer-proteína, RNA aptamer-induzida por fluorescência de corantes orgânicos e ácido nucleico sonda de recozimento^1,2^, ³. They todos oferecem a especificidade elevada, a sensibilidade e a relação do sinal-à-fundo. No entanto, as abordagens centradas no RNA r....