Artigo de método

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

DOI:

10.3791/58545

⸱

4 de junho de 2019

 ,  ,  , 
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As técnicas de imagem com base em fluorescência, em combinação com a evolução da microscopia de luz, revolucionaram a forma como os biólogos celulares realizam estudos de imagem celular ao vivo. Os métodos para detectar RNAs expandiram-se extremamente desde que os estudos seminal lig a localização local-específica do mRNA ao Regulamento da expressão genética. Os processos dinâmicos do mRNA podem agora ser visualizados através das aproximações que detectam mRNAs, acoplados com os set-ups da microscopia que são rápidos bastante capturar a escala dinâmica do comportamento molecular. A tecnologia de baliza molecular é uma abordagem baseada em hibridação capaz de detecção direta de transcrições endógenas em células vivas. As balizas moleculares são sondas de ácido nucleico discriminante, em forma de hairpin, extinto internamente, mononucleotídeo, que fluorescência somente após a hibridação a uma sequência de alvos única. Quando acoplados com a microscopia de fluorescência avançada e a imagem latente de alta resolução, permitem que um realize o seguimento espacial e temporal do movimento intracelular de mRNAs. Embora essa tecnologia seja o único método capaz de detectar transcrições endógenas, os biólogos celulares ainda não adotaram totalmente essa tecnologia devido às dificuldades de projetar tais sondas para imagens de células ao vivo. Uma aplicação de software nova, pinmol, permite o projeto realçado e rápido das pontas de prova seridas melhor para hibridizam eficientemente às regiões do alvo do mRNA dentro de uma pilha viva. Além disso, a aquisição de imagem de alta resolução, em tempo real e o software de análise de imagens de código aberto, permitem uma saída de dados refinada, levando a uma avaliação mais fina da complexidade subjacente aos processos dinâmicos envolvidos no ciclo de vida do mRNA.

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para projetar e entregar balizas moleculars em câmaras do ovo do melanogaster de Drosophila . A deteção e o visualização diretos e altamente específicos de mRNAs maternos endógenos são executados através da microscopia confocal do disco giratório. Os dados da imagem latente são processados e analisados usando a deteção e o seguimento do objeto no software gelado para obter detalhes sobre o movimento dinâmico dos mRNAs, que são transportados e localizados às regiões especializadas dentro do oocyte.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estudos de biologia celular que visualizam eventos dinâmicos com resolução espacial e temporal foram possibiliados pelo desenvolvimento de técnicas de imagens de células ao vivo baseadas em fluorescência. Atualmente, in vivo mRNA visualização é alcançada através de tecnologias que são baseadas em interações RNA aptamer-proteína, RNA aptamer-induzida por fluorescência de corantes orgânicos e ácido nucleico sonda de recozimento1,2, 3. They todos oferecem a especificidade elevada, a sensibilidade e a relação do sinal-à-fundo. No entanto, as abordagens centradas no RNA requerem manipulação genética extensiva, onde um transgene é projetado para expressar um RNA com motivos estruturais artificiais que são necessários para a ligação de proteínas ou corantes orgânicos. Por exemplo, o sistema MS2/MCP requer a coexpressão de um transgene expressando uma construção de RNA contendo múltiplas repetições em tandem da seqüência de ligação para a proteína de revestimento de bacteriófago MS2 (MCP), e outro transgene que codifica uma proteína fluorescente fundido para MCP4,5. A adição de tais motivos estruturais secundários ao RNA, junto com um volumoso cDNAs marcou a proteína, levantou as preocupações que os processos nativos do RNA podem ser afetados6. Uma tecnologia que aborda essa preocupação e oferece vantagens exclusivas adicionais é a abordagem baseada em ácido nucleico, balizas moleculares (MBs). MBS permitem a detecção multiplex de mRNAs endógenas, discriminação de variações de nucleotídeo único e cinética rápida de hibridação com mRNA alvo7,8. Os MBs são sondas de oligonucleotídeo que permanecem em uma prega de hairpin extinto antes de sofrer uma mudança conformacional fluorogênica, uma vez que eles hibridizam para seus alvos (Figura 1C)9. Diversos grupos tiveram o sucesso em usar MBS para detectar ambos não-codificando RNAs (microRNAs e lncrnas) 10,11,12,13, retrovirus14 do RNA e ADN-proteína dinâmica interações15. Foram empregados com sucesso para a imagem latente em vários organismos e tecidos, tais como embriões do zebrafish16, neurônios13, o tecido17do tumor, diferenciando os cardiomiócitos18, e as salmonelas a 19.

Aqui nós descrevemos a aproximação do projeto, da entrega e da deteção para mRNAs endógenos em câmaras de ovo vivas do D. melanogaster acopladas com uma estrutura da microscopia que seja rápida bastante capturar a escala dinâmica do transporte molecular ativo. A câmara do ovo de D. melanogaster serviu como um sistema modelo multicelular ideal para uma escala larga de estudos desenvolventes, da divisão adiantada da pilha de haste do germline e da expressão genética materna à geração do plano segmentar20do corpo, a 21. As câmaras de ovo são facilmente isoladas, grandes e translúcidas, e capazes de suportar horas de análise ex vivo , tornando-os altamente aptos a experimentos de imagem. Muito trabalho centrou-se na localização assimétrica das transcrições maternas a regiões subcelulares discretas antes de serem traduzidas ativamente. No detalhe, a localização de Oskar mRNA e sua tradução subseqüente no pólo do posterior do oocyte devem ocorrer em uma maneira firmemente regulada para evitar um phenotype bicaudal letal do embrião22. Oskar mRNA é transcrito nas 15 células germinais, denominadas células de enfermagem, e transportada ativamente através de pontes citoplasmáticas, denominadas canais de anel, para o oócito, a célula germinativa que se torna o ovo maduro e é finalmente fertilizado (Figura 1a ). A quantidade considerável de informações já disponíveis sobre o recrutamento dinâmico e a troca de fatores proteicos de e para Oskar mrnp, juntamente com sua viagem intracelular de longo alcance, fazem de Oskar um candidato preferencial para estudar os muitos processos do ciclo de vida do mRNA. Os MBs têm sido fundamentais para revelar detalhes sobre o processo de localização de mRNA e decifrar a regulação e a função de fatores proteicos que controlam o transporte de mRNA durante a Drosophila oogenesis. Em particular, por microinjetar MBS em células de enfermeira e realizando experimentos de imagens de células ao vivo, o rastreamento de mRNAs endógenas é possível8,23.

O roteiro aqui apresentado oferece as etapas de um processo completo, desde a realização de um experimento de imagens de células ao vivo usando MBs, adquirindo dados de imagem, até a realização de análises de dados para rastrear o mRNA endógeno em seu ambiente celular nativo. As etapas podem ser modificadas e otimizadas para atender às necessidades dos pesquisadores que trabalham com outros tecidos/tipos de células dentro de seu próprio ambiente de laboratório.

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Protocolo

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1. projeto de MBs para a imagem latente viva da pilha

  1. Dobre a sequência de RNA alvo para prever a estrutura secundária do alvo do mRNA usando o "formulário RNA" do servidor mfold (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. Colar/carregar a seqüência de destino no formato FASTA, selecione 5 ou 10% sub-optimality (estruturas com uma energia livre de dobrar dentro de 5 ou 10% do valor de MFE, respectivamente), e ajustar o número máximo de dobraduras computadas em conformidade (por exemplo, maior para 10% sub-optimality).
      Nota: a inclusão de estruturas secundárias sub-optimal ao projetar MBs permite a identificação das regiões dentro do mRNA do alvo que pode ser mais flexível ou mais rígida do que como previsto para a estrutura mínima da energia livre (MFE) sozinho, que melhora o projeto geral de MBs serido para a imagem latente viva da pilha.
    2. Selecione um "trabalho imediato" para alvos de mRNA de 800 nucleotídeos (NT), ou um "trabalho em lote" para comprimentos de mRNA entre 801 e 8.000 NT. Salve o arquivo "SS-Count" como arquivo de texto simples.
  2. Use o arquivo "SS-Count" obtido na etapa 1,1 como entrada para o programa pinmol (https://bratulab.WordPress.com/software/) com os parâmetros desejados, para projetar vários MBS para o alvo mRNA (veja tutoriais descrevendo o uso do programa pinmol 24 às https://bratulab.WordPress.com/tutorial-pinmol-Mac/).
    1. Determine a especificidade dos MBs selecionados realizando a análise BLAST: use "blastn" com o banco de dados apropriado (por exemplo, para MBs específicos de Oskar mRNA usar o banco de dados "RefSEQ-RNA" e o organismo de Drosophila melanogaster ).
    2. Identifique qualquer expressão específica do tecido do alvo de mRNA (por exemplo, para Oskar mRNA flybase > dados de expressão de alta taxa de transferência ≫ Flyatlas Anatomy microarray ou MODENCODE Anatomy RNA-Seq; http://FlyBase.org/reports/FBgn0003015) e comparar com qualquer hits explosão positiva. Elimine sondas que mostrem > 50% de homologia cruzada com outros mRNAs que também são expressos no tecido/célula de interesse.
  3. Selecione o par de fluoróforo e quencher apropriado para o conjunto de microscopia disponível para executar imagens de células ao vivo (por exemplo, Cy5/BHQ2)25.

2. MB síntese, purificação e caracterização

  1. Use a síntese e a purificação in-House como descrito previamente7, ou serviços dos fornecedores comerciais, para sintetizar e purificar um a cinco MBS (veja acima a nota), usando o seguinte esquema de rotulagem: [5 ' (fluorophore)-(C3 ou C6 Linker)-(2 '-O -seqüência de metil MB)-(quencher) 3 ']. Purify MBs usando HPLC de fase reversa, em casa ou usando os serviços do provedor comercial.
    Nota: Os phosphoramidites usados para a síntese automatizada da ponta de prova devem ter a modificação do ribonucleotídeo 2 '-o-methyl. Pode-se também usar quimeras de alternância de ácido nucleico bloqueado (LNA) e 2 '-O-metil modificações para aumentar a estabilidade de um híbrido entre um MB mais curto e seu alvo mRNA26.
  2. Sintetizar oligonucleotídeos de DNA que correspondem à sequência da região de RNA alvo e, portanto, são complementares à região de sonda de MBs, para uso em caracterização in vitro (ver etapas 2,3 a 2,5; nota acima). Maximize a hibridação do MB com o imitar do alvo do ADN-oligonucleotide, incluindo em cada extremidade do alvo do ADN quatro nucleotides adicionais, como encontrado na seqüência do mRNA do alvo.
    Nota: uma caracterização mais rigorosa da eficiência da MB para detectar a sequência alvo pode ser realizada usando alvos de RNA sintetizados in vitro em vez de oligonucleotídeos complementares de DNA8.
  3. Realize a desnaturação térmica do MB sozinho, meça sua temperatura de derretimento (TM), e confirme que o MB supõe a forma desejada do hairpin na temperatura fisiológica. Observamos valores de TM entre 60 e 90 ° c.
  4. Realize a desnaturação térmica do MB na presença do alvo do oligonucleotide do ADN e meça o MB: híbrido do alvo do ADN TM, como descrito previamente7. Um TM entre 55 e 60 ° c é desejado para o híbrido de MB: DNA.
  5. Realize reações in vitro da hibridação com o alvo correspondente do oligonucleotide do ADN, e determine a eficiência do MB: formação híbrida do ADN na temperatura physiological, como descrita previamente7. A cinética rápida da hibridação com o imitações do alvo do ADN é desejada, porém os MBs que não mostram a eficiência elevada da hibridação com alvos do ADN podem ter um desempenho melhor com o alvo mRNA in vitro e/ou in vivo.

3. dissecção e preparação de câmaras de ovo individuais para microinjecção

  1. Feed recém-eclosão, fêmeas acasaladas por 2-3 dias com pasta de levedura fresca.
  2. Anestesiar moscas em uma almofada de co2 e, usando pinças finos (Dumont #5), transfira 1-2 fêmeas em uma gota do óleo 700 de halocarbon em um deslizamento de tampa de vidro.
  3. Usando um par de tweezers, Oriente a mosca com o lado dorsal acima um stereomicroscope. Dissecar o abdômen fêmea fazendo uma incisão pequena na extremidade do posterior e esprema delicadamente o par de ovários no óleo.
  4. Explante os ovários em uma gota de óleo em uma nova lamínula. Segure suavemente um ovário com uma pinça, enquanto beliscando os estágios mais jovens do ovaríolo com o outro pinça. Oskar mRNA está ativamente localizado em e depois de meados da oogénese (estágios > 7), e as câmaras de ovo mais jovens (estágios < 7) são mais difíceis de injetar e não sobrevivem tanto tempo. Arraste lentamente no deslizamento da tampa (com um movimento descendente) até que os de ou as câmaras de ovo individuais estejam isolados e alinhados verticalmente. Separe mais as câmaras de ovo únicas deslocando os estágios indesejados da corrente do ovo do ovaríolo.
    Nota: Assegure-se de que as câmaras de ovo brincadas individualmente não flutuem no óleo, e que aderem ao deslizamento de tampa. Isto é importante tanto para a microinjecção bem sucedida e aquisição de imagem.

4. microinjeção de MBs nas células da enfermeira de câmaras de ovo

  1. Prepare a solução MB, usando um farol molecular (por exemplo, osk2216Cy5), ou uma mistura de dois MBs que visam diferentes mRNAs e que são rotulados com fluoróforos especulalmente distintos (por exemplo, osk2216Cy5 e drongo1111Cy3). Use uma concentração de 200-300 ng/μL cada MB em HybBuffer (50 mM Tris-HCl-pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 e 100 mm NaCl). Para um coquetel de quatro MBs rotulados com o mesmo fluoróforo que estão direcionando o mesmo mRNA em 200 ng/μL cada um em HybBuffer (por exemplo, osk82, osk1236, osk2216). Gire para baixo a solução do MB imediatamente antes de carregar a agulha para o microinjection.
  2. Selecione o objetivo. Um objetivo do óleo 40x é recomendado para encontrar uma câmara de ovo apropriada e para executar o microinjection.
  3. Monte a lamínula com a câmara de ovo dissecada no estágio do microscópio. Levante o objetivo na posição de foco e identifique uma câmara de ovo em uma fase de desenvolvimento mid-to-late, que seja orientada corretamente para a microinjeção (isto é, com o eixo AàP perpendicular à ponta da agulha para permitir a injeção fácil dentro de uma enfermeira célula proximal ao oócito).
  4. Coloque uma agulha (comercial ou preparada na casa27) com a solução ~ 1 μl MB (consulte a etapa 4,1) e conecte-a ao microinjector. Para microinjeções em câmaras de ovo D. melanogaster , orientar a agulha (ver tabela de materiais) em um ângulo < 45 ° para o estágio do microscópio (por exemplo, 30 °) para evitar a punção de várias células de enfermeira.
  5. Configurar o injector com pressão de injeção de 500-1000 hPa e pressão de compensação de 100-250 hPa (ver tabela de materiais).
  6. Mova lentamente o estágio para trazer no campo de visão uma área da gota do óleo vazia de câmaras de ovo.
  7. Usando o joystick micromanipulador, abaixe suavemente a agulha na gota de óleo e leve sua ponta em foco para a periferia do campo de visão.
  8. Execute uma função ' Clean ' para remover o ar da ponta da agulha e para garantir que há fluxo da agulha.
  9. Traga a agulha para a posição inicial e concentre-se na câmara de ovo para ser microinjetado, em seguida, trazer a agulha de volta em foco e posicioná-lo perto da borda da câmara de ovo.
  10. Realize um ajuste fino da posição Z do objetivo de tal forma que a membrana que separa as células do folículo das células da enfermeira esteja em foco.
  11. Insira a agulha em uma célula de enfermeira e realize a injeção por 2-5 s.
  12. Retire suavemente a agulha e retraia-a para a posição inicial.
  13. Mude o objetivo para a ampliação desejada para aquisição de imagem (60-63x ou 100x), concentre-se na câmara do ovo e comece a aquisição.

5. aquisição de dados usando uma configuração de microscópio confocal de disco giratório

Nota: Consulte a tabela de materiais para a nossa configuração específica.

  1. Configure o protocolo de aquisição para gravar uma pilha XYZCt de imagens de 8-16 bits (XYZ = volume, C = Channel, t = time).
  2. Selecione linhas de laser para os canais desejados (por exemplo, 641 nm laser para Cy5 e 491 nm para GFP) e adquirir os canais sequencialmente: primeiro o sinal de fluorescência em cada canal e, em seguida, alterar a posição Z, para permitir a análise de colocalização adequada.
  3. Selecione a etapa Z (por exemplo, 0,3 μm) e os limites Z superior e inferior (por exemplo ,-2 μm a 2 μm).
  4. Insira o tempo de aquisição e a taxa de amostragem (por exemplo, cada 15-30 s para até 1 h).
  5. Iniciar a aquisição.

6. processamento, análise de dados para obter informações de rastreamento e colocalização, e preparação de arquivos de vídeo

  1. Processamento de imagem
    1. Baixe, descompacte e abra Icy, uma plataforma de comunidade aberta para a informática bioimage (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Abra a pilha XYZCt adquirida no passo 5: imagem/sequência > Ficheiro > abrir.
    3. Converta a pilha em ImageJ: ImageJ > Tools > Convert to IJ, tem o modo destacado ativado.
    4. Faça um Interlude (uma seleção de uma escala de etapas de Z e de pontos do tempo a ser analisados mais): ImageJ > imagem > pilhas > Ferramentas > fazer Interlude...; Selecione os canais desejados, Z-passos e pontos de tempo.
    5. Salvar Interlude como arquivo TIFF: ImageJ > Arquivo > salvar como > TIFF...; Utilize este ficheiro para as etapas subsequentes.
    6. Canais divididos: ImageJ > Image > cor > dividir canais.
    7. Subtrair fundo usando uma pilha de plano de fundo: ImageJ > Process > Image Calculator..., ou usando a opção bola rolando: ImageJ > Process > subtrair background..., selecione o raio da bola rolando. Visualize a imagem para o raio selecionado antes de selecionar "aceitar".
      Nota: o sinal do fundo levantará principalmente da têmpera imprópria do flurorophore. O sinal: a relação do fundo (S:B) é usado frequentemente como um indicador para o "brilho" de um MB, e é medido dos experimentos in vitro da hibridação do MB e do oligonucleotide do alvo do ADN. Por exemplo, MBs osk1236 e osk2216 têm um S:B de ~ 81 e ~ 120, respectivamente.
    8. Ajuste o brilho e o contraste para cada canal: ImageJ > Image > ajustar > brilho/contraste, selecione aplicar.
    9. Salve cada canal como um arquivo TIFF separado: ImageJ > Arquivo > salvar como > TIFF....
    10. Mesclar os dois canais: ImageJ > imagem > cor > Mesclar canais...; seleccionar os canais. Salve a nova pilha como um novo arquivo TIFF (consulte a etapa 6.1.8).
  2. Detecção e rastreamento de pontos
    1. Converta de volta para Icy: ImageJ > Tools > converter para Icy.
    2. Uma barra de escala é automaticamente sobreposta para a pilha após a conversão para Icy, se o plugin da barra de escala está instalado [pesquisa usando plugins > Setup > plugin online]. Se necessário, edite a barra de escala via janela Inspetor (lado direito da tela) > Layer Tab > nome > barra de escala.
    3. Desmarque/inative o ícone ' olho ' para a barra de escala na guia Camada > nome para remover a barra de escala da pilha original. Ele pode ser reativado na pilha final.
    4. Salve a pilha recém-processada, fazendo uma captura de tela usando o ícone "câmera" na barra de menus da janela de imagem, "faça uma captura de tela da exibição atual" e arquivo > salvar como > TIFF....
    5. Determine a sensibilidade do ponto, se os parâmetros da sensibilidade do ponto já foram determinados movem-se na etapa 6.2.7.
    6. Detectar manchas: selecione a janela com a imagem ou pilha a ser analisada, detecção & Tracking > detecção > detector Spot, e preencha os parâmetros de configurações:
      1. Para entrada, selecione "currentSequenceInputDetection" (padrão).
      2. Para pré-processamento, selecione "canal 0" (padrão) ou o canal desejado, fazendo referência cruzada do número na guia Inspetor Window > Sequence.
      3. Para detector, selecione "detectar ponto brilhante sobre fundo escuro;" Use "forçar o uso de wavelets 2D para 3D" somente se não houver fatias Z suficientes nas pilhas para realizar a análise. Selecione "Scale (s)" e "Sensitivity" para cada escala (adicione mais escalas para pontos maiores). A escala e a sensibilidade (quanto maior o número mais sensível é a detecção, um máximo de 140 é sugerido por Icy) são variáveis de tentativa e erro, que devem ser verificadas visualmente depois e decidido em cima.
      4. Para região de interesse, use "ROIfromSequence" (padrão).
      5. Para filtrar, use "NoFiltering" (padrão) ou selecione "SizeFiltering" para definir o "intervalo de objetos aceitos (em pixels)".
      6. Saída: selecione a configuração de saída XLS ou XML (selecione o formato XML ao usar 2007 MS Excel ou anterior e há > 65.000 pontos). Se os resultados do detector Spot forem usados para a análise de rastreamento, também selecione "exportar para SwimmingPool".
      7. Repita a detecção de manchas usando vários valores de escala/sensibilidade até que todos ou a maioria dos pontos sejam detectados. Registre todos os parâmetros finais.
      8. Para a análise da colocalização, repita a deteção do ponto para o outro canal.
    7. Para rastrear pontos, selecione detecção & rastreamento > Tracking > rastreamento de spot > execute o detector de manchas com parâmetros da etapa 6.2.6., ou use o menu suspenso "selecionar resultados de detecção aqui" para selecionar um conjunto de dados existente (para isso, mantenha a janela do detector de manchas aberto a partir do passo 6.2.5). Pressione o botão "estimar parâmetros" e selecione o movimento desejado na janela pop-up de estimativa de parâmetros (por exemplo, "é diffusivo e direcionado"). Pressione o botão "Executar rastreamento".
    8. Repita a detecção de spot e rastreamento para outros canais ao rastrear pontos de pilhas multicanal, seguindo as etapas 6.2.6 e 6.2.7, começando com a pilha gerada a partir da etapa 6.2.7.
    9. Para visualizar faixas, selecione detecção & acompanhamento > Tracking > Track Manager – esta janela abre automaticamente após a conclusão de uma execução de rastreamento. Para "processador de faixa de cores", selecione "ativar" e escolha a representação desejada de cor para as faixas. Processadores de faixa relevantes podem ser acessados através do "Adicionar processador Track..." menu suspenso (por exemplo, selecione "rastrear clipe de tempo do processador", ative a janela "rastrear Clipper" e escolha o número desejado de detecções a serem exibidas antes e depois do ponto de hora atual.)
    10. Salvar informações de faixas como um arquivo XML Track: detecção & rastreamento > rastreamento > Track Manager > Arquivo > salvar como....
    11. Salve os resultados tirando uma captura de tela usando o ícone "câmera" na barra de menus da janela de imagem, "faça uma captura de tela da exibição atual". Capturas de tela podem ser tiradas com os pontos detectados e/ou as faixas simplesmente ativando/desativando o ícone de olho correspondente (s) encontrado no Inspetor janela > Layer Tab > nome > Overlay wrapper.
    12. Instale o plugin TimeStamp Overlay: Plugins > Setup > plugin Online > TimeStamp Overlay > install.
    13. Adicionar carimbo de data/hora: Plugins > TimeStamp Overlay (New). Siga as instruções na janela pop-up (canto inferior direito da tela) para obter instruções sobre como colocar e formatar o carimbo de data/hora. O intervalo de tempo pode ser adicionado/alterado no Inspetor janela > Sequence guia > Sequence Propriedades > Edit.
    14. Salve os resultados tirando outra captura de tela. Salvar imagem como 1) formato TIFF, e 2) como formato AVI; para o formato AVI primeiro converta para renderização RGB (imagem/sequência > Renderização > imagem RGB).
    15. Girar imagem para orientação desejada: Inspetor janela > sequência guia > Canvas > Rotation.
    16. Salvar imagem girada por "tirar uma captura de tela do modo de exibição atual". Certifique-se de que o ícone "olho" da barra de escala esteja desmarcado, pois ele também girará com a imagem.
    17. Escolha e corte o ROI: selecione região de interesse > ROI 2D > escolha a forma de ROI e, em seguida, criar/desenhar ROI na imagem; Imagem/sequência > plano (XY) > Fast Crop.
  3. Análise de colocalização
    1. Prepare um protocolo de colocalização; vários exemplos são fornecidos no site da Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (ver materiais complementares).
    2. Protocolo de colocalização de carga: Ferramentas > Scripting > Protocols > carregar e ajustar parâmetros nos blocos interagindo (por exemplo, no bloco "wavelet Spot detectando" parâmetros de uso determinados na etapa 6.2.6.).
    3. Meça o tamanho de uma partícula em pixels, determine a distância de colocalização e insira-a no bloco "Colocalizer" como "distância máxima".
      Nota: O tamanho da partícula em pixels depende do sistema de detecção. Para medir o tamanho, aumente o zoom em uma única partícula e conte manualmente os pixels que abrangem a largura do sinal. Média das medições de pelo menos três partículas. A distância máxima a ser definida para colocalização é o tamanho da partícula em pixels (isso representa a soma máxima do raio de duas partículas tocando).
    4. Se desejado, selecione um ou mais ROIs para análise de colocalização: região de interesse > ROI 2D > escolha ROI Shape > desenhe ROI na imagem.
    5. ROI (s) da cultura: imagem/sequência > plano (XY) > Fast Crop.
    6. Executar colocalização: janela do editor de protocolos > guia de protocolo escolhido > Run. O bloco final na janela do editor de protocolos conterá a porcentagem de colocalização geral com base na detecção de ponto, enquanto as informações em cada ponto de tempo podem ser encontradas na janela Inspetor > guia saída.
    7. Rastreie as partículas colocalizadas e únicas seguindo a etapa 6.2.7 (rastrear pontos).
    8. Salvar conforme descrito na etapa 6.2.16.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando o Pinmol, vários MBS podem ser projetados para um alvo de mRNA (Figura 1b-C). Após síntese e purificação, os MBs selecionados são caracterizados e comparados por meio da análise in vitro.

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Figura 1: técnica e descrição tecidual para imagens de células ao vivo de mRNAs endógenas...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A visualização ao vivo do tráfico endógeno de mRNA em câmaras de ovos de Drosophila depende do uso de MBS específicos, eficientes e resistentes a nucleases, que agora podem ser facilmente projetados com o software pinmol . Os MBs são sondas específicas projetadas para detectar sequências exclusivas dentro de um mRNA alvo (preferencialmente regiões livres de estrutura secundária), possibilitando uma detecção altamente resolvida de uma transcrição. A única limitação ao adotar esta técnica/protocolo para o...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflito de interesse em divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Salvatore AE Marras (centro do Instituto de pesquisa em saúde pública, Universidade Rutgers) pela síntese, rotulagem e purificação de balizas moleculares, e Daniel St Johnston (Instituto Gurdon, Universidade de Cambridge) para o Oskar-MS2/ Estoque de mosca transgênica MCP-GFP. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de carreira da Fundação Nacional de ciência 1149738 e um Congresso de pessoal profissional-prêmio CUNY para DPB.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EspectrofluorômetroFluoromax-4 Horiba-Jobin Yvonn/aEspectrofluorômetro de contagem de fótons
Cubeta de quartzoFireflysci (antiga Precision Cells Inc.)Pinça 701MFL
Dumont #5World Precision Instruments501985Pinças finas são muito importantes para separar as câmaras de ovos individuais
Óleo de halocarbono 700Sigma-AldrichH8898
Lamínula de cobertura nº 1 22 mm x 40 mmVWR48393-048
Microscópio de dissecaçãoLeica MZ6 Leica Microsystems Inc.n / a
CO2< / sub> almofada de anestesia para mosca-da-frutaGenesee Scienific59-114
Tris-HCL pH 7,5Sigma-Aldrich1185-53-1
Cloreto de magnésioSigma-Aldrich7791-18-6
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Microscópioconfocal de disco giratórioMicroscópio invertido Leica DMI-4000B equipado com disco giratório Yokogawa CSU 10 Leica Microsystems Inc.n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD câmeraHamamatsun/a
PatchMan NP 2 MicromanipuladorEppendorf Inc.
Microinjetor FemtoJetEppendorf Inc.
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Referências

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