Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.
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Artigo de método
Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos
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Resumo
Resumo
Injeção intratecal (IT) do vírus adeno-associado (AAV) tem atraído considerável interesse na terapia de gene CNS em virtude de sua segurança, noninvasiveness e transdução excelente eficácia no SNC. Estudos anteriores têm demonstrado a potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração. No entanto, altas taxas de falha imprevisível devido a limitação técnica de administração de ti em pequenos animais têm sido relatadas. Aqui, nós estabelecemos um sistema de Pontuação para indicar o grau de sucesso de punção lombar em pequenos animais pela adição de cloridrato de lidocaína a 1% para a solução de injeção. Vamos mostrar ainda mais que a extensão da fraqueza transitória após injeção pode prever a eficiência de transdução de AAV. Assim, este método de injeção de IT pode ser usado para otimizar os ensaios terapêuticos em modelos do rato de doenças CNS que afligem largas regiões do SNC.
Introdução
AAV pode mediar a expressão do gene a longo prazo e generalizada na transdução de CNS com poucos efeitos colaterais e, portanto, tornou-se um dos veículos mais promissoras para terapia gênica tratar doenças do CNS, incluindo esclerose lateral amiotrófica (ela), Huntington doença (HD), a doença de Alzheimer (AD), doenças de depósito lisossômico (LSD), doença de Gaucher (GD) e neuronal ceroid Doenà (NCL)1. Atualmente, mais de 100 sorotipos de vírus adeno-associados têm sido isolados de humanos e animais. Entre estes, pelo menos 12 foram usados em pré-clínicos e clínicos, incluindo o mais comumente usado vetores de gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Doenças de CNS diferentes exigem diferentes estratégias de entrega AAV, devido a várias regiões afectadas do CNS e tipos de células. As regiões de CNS e célula tipos que AAV pode transduce varia dependendo do serótipo bem como método de entrega. Por exemplo, rAAVrh10 tem demonstrado transduce predominantemente astrócitos quando entregue por sistêmica injeção intravenosa (IV), Considerando que ele nao tanto neurônios e glia quando entregue por intratecal injeção4,7. Além disso, a injeção de parênquima resultou na transdução de local para as imediações do local da injeção, Considerando que a injeção no fluido cerebrospinal (CSF) através de intraventricular ou injeção intratecal resultou na transdução generalizada de CNS8 . Estudos também demonstraram potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração9,10,11. Em doenças que afetam grandes áreas do SNC tais como ALS, injeção intratecal para o CSF foi mostrada para cobrir a maior parte das áreas que são afectados pela doença com uma dose mais baixa, em comparação com um método de entrega sistêmica4,10. Estudos recentes têm mostrado também que a punção lombar pode ser usada para injetar o vírus adeno-associados em modelos do rato para ALS, que evita lesões potenciais associados com laminectomia e intratecal cateterismo4.
Experimental punção direta foi usada primeiramente para entregar agentes anestésicos, especialmente, para a medula espinhal para analgesia e anestesia em 188512,13. Neste relatório, podemos ilustrar a punção lombar método de injeção é em ratos adultos, com o auxílio de 1% de cloridrato de lidocaína, um anestésico local Amida derivada, na solução de injeção para avaliar e monitorar a qualidade de injeção. Injeções bem sucedidas foram marcadas por paralisia transitória induzida por lidocaína, Considerando que a falha de injeções não mostrou esse comportamento. Estamos classificados o nível de fraqueza transitória, como uma das cinco classes para ajudar a prever a eficiência de injeção. Finalmente, mostramos que o nível de transdução de rAAVrh10 pode ser previsto pelo grau de paralisia. Portanto, este método de entrega AAV intratecal pode ser usado para melhorar a AAV-mediada gene-entrega para terapia experimental das doenças do CNS.
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Protocolo
Camundongos FVB/NJ foram criados na instalação de animais de laboratório chave de Neurologia de Hebei. Todos os experimentos de rato foram aprovados pelo segundo Hospital de Hebei médica Universidade Comitê de ética e realizados de acordo com os regulamentos de animais de laboratório, promulgada pelo Ministério da ciência e tecnologia da República Popular da China.
1. preparação da solução-mãe cloridrato de lidocaína 20%
- Pese 2 g de cloridrato de lidocaína. Adicione 5 a 6 mL de água estéril e vórtice suavemente. Aumente o volume para um total de 10 mL com água estéril.
- 1.2 filtre a solução através de filtros de 0,2 mícron. Alíquota da solução, 1ml por microcentrifuga de 1,5 mL do tubo e selá-lo com uma película de vedação. Loja a 4 ° C.
2. direct intratecal AAV entrega em ratos acordados
- Limpe a área de trabalho usando gaze esterilizada com 70% de etanol e preparar os materiais necessários, conforme mencionado na tabela 1.
- Prepare-se 100 µ l de cloridrato de lidocaína AAVrh.10/1% complexo adicionando 95 µ l de solução rAAVrh10 (5 x 1012 genoma cópias/mL) em um tubo estéril de microcentrifuga µ l 200 e adicione 5 µ l de solução-mãe cloridrato de lidocaína 20%. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Em seguida, armazene a solução de vírus no gelo (4 ° C).
Nota: 8 µ l por rato4 será usado. -
Preparar a seringa com a solução AAV para injeção
- Monte um 25 µ l Hamilton a seringa com uma agulha 27G e alinhe a ponta chanfrada da agulha com a escala volumétrica na seringa.
- Desenhe 8 µ l com 4 x 1010 cópias do genoma da solução de vírus para a seringa delicadamente. Certifique-se de remover as bolhas de ar.
-
Preparando o mouse
Nota: ratos FVB/NJ masculino ou femininos (30 a 70 dias de idade) foram utilizados neste estudo. Injeção foi operada no capô.- Esterilize a área de trabalho em um capuz com etanol a 70%. Coloque o mouse acordado (masculinos ou femininos, 30-70 dias de idade, 13-20 g de peso) em um bedpiece em posição de capuz. Cubra a parte superior do corpo com gaze estéril para acalmar o mouse e evitar ser mordido.
- Corrigi o animal, agarrando-se adequadamente e firme em sua cintura pélvica com um polegar em um lado e o dedo indicador/médio dedo do outro lado. Manter a pele entre bilaterais cinturas pélvicas tensa com o polegar e o indicador. Segure suavemente na parte superior do corpo do animal com a palma da mão.
- Raspar o pelo nas costas entre a cintura pélvica bilateral e, em seguida, esterilizar a superfície da pele com um iodeto esfoliante e 70% do etanol.
-
De injeção intratecal12
- Sinta o espaço intervertebral ao longo da linha média entre a cintura pélvica bilateral com um polegar ou o dedo indicador da outra mão e pressione uma marca com uma unha para indicar o espaço intervertebral L5-L6 (localizar o local da injeção).
- Girar a base da cauda ligeiramente e suavemente para indicar a linha média da coluna vertebral. Ajuste o bisel da agulha para a cabeça do animal antes da injeção (mencionado na etapa 2.3.1).
- Certifique-se que os animais são fixados firmemente e alinham a agulha ao longo da linha mediana da coluna vertebral.
- Inserir a agulha suavemente e verticalmente (ou incline ligeiramente a 70-80°) na interseção de recuo e mantenha a seringa em um plano sagital central. Reduzir o ângulo de aproximadamente 30° lentamente, quando ele se conecta ao osso e, em seguida, enfiar a agulha no espaço intervertebral.
Nota: Um filme de cauda evidente de repente é um sinal de entrada bem sucedida no espaço intradural. Uma vez que a agulha entra no espaço intervertebral, vai sentir a ponta da agulha firmemente preso. A agulha 27G utilizada neste estudo é adequada para a entrega IT em ratos, mas não ratos. - Injecte a solução de vetor (mencionada na etapa 2.2). Iniciar o temporizador e injetar 8 µ l da solução de vetor a uma velocidade de 1 µ l/4 s. reter a agulha aproximadamente 1 min depois de terminar entrega. Retire a agulha com rotação suave para evitar vazamento.
- Marca a fraqueza transitória do mouse Membros imediatamente após o parto para avaliar a qualidade de injeção4.
Nota: O padrão é da seguinte forma4. Pontuação 0: nenhuma fraqueza; escore 1: menor fraqueza dos membros posteriores sem anormalidade da marcha; Pontuação 2: moderada fraqueza dos membros posteriores com anormalidade óbvia da marcha; Pontuação 3: completar a paralisia dos membros posteriores; marcar 4: completar a paralisia dos membros posteriores, falta de ar e fraqueza moderada dos membros dianteiros; e pontuação 5: completa paralisia de todos os quatro membros e evidente falta de ar. - Mova o mouse de volta para a gaiola para a recuperação da paralisia.
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Limpar
- Lave a seringa com 1 mL de água estéril. Classificar materiais de laboratório e coletar todos os materiais não-descartáveis para a esterilização autoclave. Limpe o banco com etanol a 70%.
3. tecido preparação para a coloração imuno-histoquímica
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Coleção de tecido
- Anestesia profundamente ratos no pós-injeção de 21 dias com 3% hidrato de cloral (0,1 mL/10g) por injeção intraperitoneal.
- Perfuse transcardially com 20 mL de PBS gelado de 0,01 M (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K.2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) em primeiro lugar, então 4% gelada paraformaldeído (em PBS de 0,01 M) com bomba (10 mL/min por 1 min, em seguida 5 mL/min. para 9 min).
Atenção: Paraformaldeído é tóxico e cancerígeno. Amanhar-apenas a coifa usando luvas.
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Dissecação do cérebro e da medula espinhal
- Corrigir os membros e a cabeça de cada animal em posição na capa de uma caixa de espuma com agulhas de seringa, em seguida, tira e remover a pele da cabeça ao Sacro com tesoura.
- Clip do crânio entre os olhos, corte ao lado da rota média do crânio e linha horizontal sobre o cerebelo e, em seguida, abrir o crânio para cada lado.
- Levante o osso occipital com pinças e abrir o canal medular bilateral com tesouras oftálmicas. Corte as costelas em ambos os lados e remova a metade superior das vértebras com cuidado.
- Levante o cérebro com uma pinça curvada e cortar os nervos da base do crânio e, em seguida, dissecar cuidadosamente para fora o cérebro ea medula espinhal. Fixar os tecidos em paraformaldeído 4% por 24 h.
-
Preparação de fatias de tecido
- Crioproteção do cérebro e da medula espinhal cervical e lombar em 30% de solução de sacarose durante a noite a 4 ° C. Incorporar o tecido no ideal da temperatura de corte (OCT) composto e congelar rapidamente com nitrogênio líquido.
- Corte o tecido na 25 µm usando um criostato e armazenar as seções congeladas em PBS 0,01 M a 4 ° C para uso.
4. imuno-histoquímica
- Pré-tratamento seções flutuantes em 1% H2O2 por 10 min, em seguida, lave em PBS durante 10 min. Incubar em uma solução de bloqueio contendo 5% de soro e detergente não-iônico 0,3% em PBS por 1h.
- Incubar as fatias com anticorpos primários correspondentes durante a noite a 4 ° C. Lave as seções em PBST (0,2% Tween 20 em PBS) por 30 min (3 vezes por 10 min cada).
- Incube as fatias com anticorpo de biotina-secundário correspondente à temperatura ambiente por 1 h. lavagem em PBST por 30 min (3 vezes por 10 min cada).
- Incubar as secções com peroxidase de biotina afinidade complexa por 40 min e mancha com agente achromogenic. Montar as seções sobre guias e seque bem.
- Mergulhe os slides em etanol anidro por 5 min e xileno por 10 min e, em seguida, selar os slides com um meio de montagem. Finalmente, imagem dos slides com um microscópio equipado com um dispositivo de carga acoplada (CCD) em x 100 x 200 e 400 ampliações de x.
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Resultados
Camundongos mostraram graus diferentes de fraqueza transitória logo após ele injeção da solução AAV no cloridrato de lidocaína 1% devido a vários qualidade de injeção intratecal. De acordo com o semigrau 5 sistema de pontuação que estabelecemos, nós testamos os padrões de transdução da AAV em camundongos com graus diferentes de fraqueza induzida por lidocaína membro (Pontuação 0, n = 2; escore 1, n = 1; marcar 4, n = 4; Pontuação 5, n = 3). EGFP imunocoloração de espinais mostrou nenhuma ...
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Discussão
Tecnicamente, há várias etapas críticas durante a injeção de IT em ratos acordados. Primeiro, bom gesto e firme controle dos ratos ao longo de toda a operação é um pré-requisito para o sucesso na entrega. Em segundo lugar, o ponto mais difícil é sentir o espaço intervertebral com a ponta da agulha, como é necessário para não inserir profundamente sem resistência ou inserir forçadamente sob forte resistência no caso de ferir os animais ou dobra a ponta da agulha. Em terceiro lugar, embora a paralisia transitória devido a ...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento Provincial de recursos humanos da HEBEI e Segurança Social (CY201605) e uma bolsa da Fundação ciência Natural da província de Hebei (H2017206101), e agradecemos muito ao Dr. Gao Guangping, que forneceu o vírus adeno-associados para Este estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos FVB/NJ | Charles River Laboratories China | ||
| Cloridrato de lidocaína monohidratado | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Núcleo de vetor viral do Centro de Terapia Gênica da Escola | ||
| 25 µ L Seringa Hamilton / agulha 27-30 G | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H < sub> 2< / sub> O 2< / sub> | SHUI HUAN PAI | ||
| Soro de cabra | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Coelho anti-GFP | Tecnologia da vida | G10362 | Diluição 1:333 |
| O segundo anticorpo (cabra-anti coelho) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | Diluição 1:1.000 |
| VECTASTAIN ABC REAGENTE | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Meio de montagem para fluorescência com DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4· 2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Yong Da Paraformaldeído Químico | ||
| Yong Da | de | 307699 | |
| CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm | |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopia Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Tubo de centrífuga | CORNING | 430790 | |
| 96 poço cluster de cultura de células | Coster | 3599 | |
| cluster de cultura de células de 24 poços | Coster | 3524 | |
| 70% Etanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| seringa de 1 mL | Microtubos de Microtubos | ||
| Plasmados | |||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet dicas | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regenerador | Haier | BCD-539WT | |
| Filtro | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Bomba | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscópio | Olympus | BX53 | |
| micrótomo de congelamento | Leica | CM1520 |
Referências
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Reimpressões e permissões
