Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.
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Artigo de método
Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Injeção intratecal (IT) do vírus adeno-associado (AAV) tem atraído considerável interesse na terapia de gene CNS em virtude de sua segurança, noninvasiveness e transdução excelente eficácia no SNC. Estudos anteriores têm demonstrado a potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração. No entanto, altas taxas de falha imprevisível devido a limitação técnica de administração de ti em pequenos animais têm sido relatadas. Aqui, nós estabelecemos um sistema de Pontuação para indicar o grau de sucesso de punção lombar em pequenos animais pela adição de cloridrato de lidocaína a 1% para a solução de injeção. Vamos mostrar ainda mais que a extensão da fraqueza transitória após injeção pode prever a eficiência de transdução de AAV. Assim, este método de injeção de IT pode ser usado para otimizar os ensaios terapêuticos em modelos do rato de doenças CNS que afligem largas regiões do SNC.
Introdução
AAV pode mediar a expressão do gene a longo prazo e generalizada na transdução de CNS com poucos efeitos colaterais e, portanto, tornou-se um dos veículos mais promissoras para terapia gênica tratar doenças do CNS, incluindo esclerose lateral amiotrófica (ela), Huntington doença (HD), a doença de Alzheimer (AD), doenças de depósito lisossômico (LSD), doença de Gaucher (GD) e neuronal ceroid Doenà (NCL)1. Atualmente, mais de 100 sorotipos de vírus adeno-associados têm sido isolados de humanos e animais. Entre estes, pelo menos 12 foram usados em pré-clínicos e clínicos, incluindo o mais comumente usado vetores de gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9....
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Protocolo
Camundongos FVB/NJ foram criados na instalação de animais de laboratório chave de Neurologia de Hebei. Todos os experimentos de rato foram aprovados pelo segundo Hospital de Hebei médica Universidade Comitê de ética e realizados de acordo com os regulamentos de animais de laboratório, promulgada pelo Ministério da ciência e tecnologia da República Popular da China.
1. preparação da solução-mãe cloridrato de lidocaína 20%
- Pese 2 g de cloridrato de lidocaína. Adicione 5 a 6 mL de água estéril e vórtice suavemente. Aumente o volume para um total de 10 mL com água estéril.
- 1.2 filtre a solução através de filtros de 0,2 mícro....
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Resultados
Camundongos mostraram graus diferentes de fraqueza transitória logo após ele injeção da solução AAV no cloridrato de lidocaína 1% devido a vários qualidade de injeção intratecal. De acordo com o semigrau 5 sistema de pontuação que estabelecemos, nós testamos os padrões de transdução da AAV em camundongos com graus diferentes de fraqueza induzida por lidocaína membro (Pontuação 0, n = 2; escore 1, n = 1; marcar 4, n = 4; Pontuação 5, n = 3). EGFP imunocoloração de espinais mostrou nenhuma .......
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Discussão
Tecnicamente, há várias etapas críticas durante a injeção de IT em ratos acordados. Primeiro, bom gesto e firme controle dos ratos ao longo de toda a operação é um pré-requisito para o sucesso na entrega. Em segundo lugar, o ponto mais difícil é sentir o espaço intervertebral com a ponta da agulha, como é necessário para não inserir profundamente sem resistência ou inserir forçadamente sob forte resistência no caso de ferir os animais ou dobra a ponta da agulha. Em terceiro lugar, embora a paralisia transitória devido a .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento Provincial de recursos humanos da HEBEI e Segurança Social (CY201605) e uma bolsa da Fundação ciência Natural da província de Hebei (H2017206101), e agradecemos muito ao Dr. Gao Guangping, que forneceu o vírus adeno-associados para Este estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos FVB/NJ | Charles River Laboratories China | ||
| Cloridrato de lidocaína monohidratado | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Núcleo de vetor viral do Centro de Terapia Gênica da Escola | ||
| 25 µ L Seringa Hamilton / agulha 27-30 G | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H < sub> 2< / sub> O 2< / sub> | SHUI HUAN PAI | ||
| Soro de cabra | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Coelho anti-GFP | Tecnologia da vida | G10362 | Diluição 1:333 |
| O segundo anticorpo (cabra-anti coelho) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | Diluição 1:1.000 |
| VECTASTAIN ABC REAGENTE | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Meio de montagem para fluorescência com DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4· 2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Yong Da Paraformaldeído Químico | ||
| Yong Da | de | 307699 | |
| CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm | |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopia Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Tubo de centrífuga | CORNING | 430790 | |
| 96 poço cluster de cultura de células | Coster | 3599 | |
| cluster de cultura de células de 24 poços | Coster | 3524 | |
| 70% Etanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| seringa de 1 mL | Microtubos de Microtubos | ||
| Plasmados | |||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet dicas | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regenerador | Haier | BCD-539WT | |
| Filtro | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Bomba | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscópio | Olympus | BX53 | |
| micrótomo de congelamento | Leica | CM1520 |
Referências
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., <....
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Reimpressões e permissões
