Artigo de método

Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

DOI:

10.3791/58587

⸱

3 de junho de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Center for Systems Biology Dresden

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo fornece uma metodologia Fiji-baseada, user-friendly junto com instruções diretas que explicam como analisar confiantemente o comportamento do actomiosina em pilhas individuais e em tecidos epithelial curvados. Nenhuma habilidade de programação é necessária para seguir o tutorial; todas as etapas são executadas de forma semiinterativa usando a interface gráfica do usuário de Fiji e plugins associados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os ovos imaturos da Drosophila são chamados de câmaras de ovos, e sua estrutura se assemelha a órgãos primitivos que sofrem alterações morfológicas de uma rodada a uma forma elipsóide durante o desenvolvimento. Esse processo de desenvolvimento é chamado de oogênese e é crucial para gerar ovos maduros funcionais para garantir a próxima geração de moscas. Por estas razões, as câmaras de ovo serviram como um modelo ideal e relevante para compreender o desenvolvimento de órgãos animais.

Diversos protocolos in vitro da cultura foram desenvolvidos, mas há diversas desvantagens a estes protocolos. Um envolve a aplicação de várias coberturas que exercem uma pressão artificial nas câmaras de ovos imaged, a fim de imobilizá-los e aumentar o plano de aquisição imaged da superfície circunferencial das câmaras de ovos analisadas. Essa abordagem pode influenciar negativamente o comportamento da maquinaria de actomiosina fina que gera o poder de girar as câmaras de ovo em torno de seu eixo mais longo.

Assim, para superar esta limitação, nós cultura câmaras de ovo de Drosophila livremente na mídia, a fim de analisar de forma confiável a maquinaria de actomiosina ao longo da circunferência das câmaras de ovo. Na primeira parte do protocolo, fornecemos um manual detalhando como analisar a maquinaria de actomiosina em um plano de aquisição limitado na escala celular local (até 15 células). Na segunda parte do protocolo, fornecemos aos usuários um novo plugin baseado em Fiji que permite a extração simples de uma camada fina definida da superfície circunferencial das câmaras de ovos. O seguinte protocolo descreve então como analisar sinais da actomiosina na escala do tecido (> 50 pilhas). Finalmente, nós apontemos as limitações destas aproximações nas escalas locais do celular e do tecido e discutimos seu desenvolvimento futuro potencial e aplicações possíveis.

Introdução

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O desenvolvimento contínuo de novas tecnologias de imagem e software com aplicações nas ciências da vida tem proporcionado um enorme impacto na compreensão dos princípios básicos da vida. Um dos principais desafios é a visualização confiável dos processos de desenvolvimento em combinação com sua imagem ao vivo em vários tecidos. Os tecidos são partes de órgãos e corpos e, como tal, a maioria não são facilmente acessíveis para a imagem. Portanto, protocolos que permitam sua dissecção e cultivo in vitro foram desenvolvidos para Visualizar eventos biológicos que refletem suficientemente a situação in vivo dentro de um corpo vivo.

Ao longo das últimas décadas, a cultura e a imagem ao vivo de câmaras de ovos de Drosophila , estruturas acinares semelhantes a órgãos primitivos, contribuiu imensamente para a compreensão dos princípios básicos do desenvolvimento de órgãos primitivos1 , 2. º , 3. atualmente, existem vários protocolos de cultivo disponíveis, e seu uso depende do tempo de aquisição, tipo de célula a ser imaged, e sua acessibilidade (por exemplo, germline interior vs. linha somática externa)4.

Uma característica comum em todos estes protocolos de cultivo é a necessidade para a imobilização de câmaras de ovo analisadas que exibem uma atividade contrátil elevada nos meios líquidos. A atividade contrátil das câmaras de ovos é causada principalmente pela folha muscular que abrange uma longa seqüência de câmaras de ovo conectadas5,6,7. Portanto, para conseguir a imobilização adequada das câmaras de ovo jovens, várias abordagens foram desenvolvidas, envolvendo a cobertura de câmaras de ovo com coberturas6,8,9 ou cobertores flexíveis4, 10 ou encaixá-los em agarose de ponto de fusão baixa3,11. Estas aproximações são populares porque igualmente permitem a imagem latente de um plano Visual maior devido ao aplainamento subtil da superfície circunferencial das câmaras de ovo.

Entretanto, recentemente, mostrou-se que as câmaras de ovo novas (estágio 1-8) giram em torno de seu eixo anterior-posterior6 e que este movimento do tecido está alimentado por uma rede fina do actomiosina perto da superfície circunferencial destas câmaras de ovo novas 12. portanto, a alteração artificial da superfície celular causada por um achatamento sutil deste tecido pode ter um impacto negativo sobre o comportamento da maquinaria de actomiosina geradora de força. O contraponto é que se o tecido da câmara do ovo não é aplainado, a imagem latente microscópica das proteínas na superfície circunferencial de câmaras de ovo torna-se ainda mais limitada pelo tamanho diminuído do plano da aquisição.

Por isso, combinámos protocolos de Prasad et al.9 e o laboratório de Celeste Berg4,10 e modificou-os ainda mais para que não se utilizava lamínula/manta flexível/agarose no método desenvolvido. As câmaras do ovo de Drosophila são cultivadas livremente nos meios e o protocolo apresentado aqui aplica-se somente a microscopia invertida. Há duas partes no protocolo. A primeira parte é focada na análise de sinais de actomiosina na escala celular local (até 15 células) dentro das câmaras de ovo. Na segunda parte, focamos em superar as limitações associadas a um pequeno plano de aquisição causado pela livre cultivo de câmaras de ovos. A este respeito, desenvolvemos um novo método computacional baseado em Fiji com uma interface de usuário gráfica semiinterativa que extrai e desdobra seletivamente camadas definidas de uma superfície circunferencial do tecido. Isso é seguido por um protocolo que descreve como analisar a actomiosina na escala tecidual (i.e., > 50 células). Como a extração seletiva de uma camada fina definida de tecidos epiteliais curvados não foi facilmente possível usando uma projeção de pilha z clássica (Figura 1), este método Easy-to-use serve como um pré-requisito importante para compreender compreensivamente o comportamento de uma rede de actomiosina fina (< 1 μm) na escala tecidual em câmaras de ovos de Drosophila .

Além disso, para facilitar o protocolo, fornecemos exemplos de filmes de lapso de tempo (TLMs) e arquivos de amostra de comportamento de myosin II convencional sem músculo fluorescentamente marcados (ver arquivo complementar 3). Myosin II é uma proteína do motor e representa a parte contrátil ativa da maquinaria do actomiosina. Para a imagem de myosin II, utilizamos linhas de Drosophila transgênicas que contêm uma cadeia leve regulatória modificada de miosina II denominada mrlc:: GFP (ver tabela de materiais para detalhes)12,13. A fim de visualizar as membranas celulares, o protocolo é baseado em corantes comerciais (ver tabela de materiais). Este protocolo é apropriado não somente para a análise de mrlc subcellular pequeno:: sinais de GFP12 mas também para todas as partículas subcellular de tamanho semelhante em torno de ± 300 μm, tais como aquelas observadas com vida-ato:: GFP12,14.

Embora ambos estes protocolos sejam apresentados usando in vitro as câmaras de ovo cultivadas da Drosophila , a aquisição de sinais do actomiosina podem igualmente ser executadas usando outros tecidos em cima da optimização dos meios cultivando e dependendo da disponibilidade de proteínas com marcas fluorescentamente marcadas com corantes comerciais correspondentes ou, por exemplo, microinjeções de mRNA para obter perfis transitórios de expressão gênica. Similarmente, o protocolo Fiji-baseado para a extração de uma camada fina de uma superfície circunferencial pode ser aplicado mais geralmente aos elipsóide e órgão-como tecidos.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: O protocolo a seguir fornece instruções sobre como analisar a actomiosina no celular local e a escala tecidual em câmaras de ovos de Drosophila . A abordagem em escala local permite aos usuários analisar o comportamento detalhado da actomiosina em até 15 células por câmara de ovo e requer a aquisição de TLMs por um curto período de tempo (5 – 10 min) usando imagens de alta velocidade e um microscópio confocal invertido. Ao contrário, a escala do tecido fornece usuários a informação do actomiosina em 50-100 pilhas e exige a aquisição de TLMS por um longo período de tempo (≥ 30 minutos) usando a imagem latente de baixa velocidade e um microscópio de giro invertido do disco (veja Figura 2 e parâmetros recomendados em cada escala na tabela 1). A decisão na qual a escala para analisar os sinais de actomiosina depende inteiramente da questão científica do usuário. Os TLMs de teste acompanhados devem ajudar a tomar esta decisão.

1. escala celular local (LCS)

Nota: Para dissecar e imagem in vitro cultivadas câmaras de ovo de Drosophila , siga o protocolo descrito em arquivo complementar 1. Para analisar os TLMs adquiridos, continue com o seguinte protocolo. Links para acompanhar arquivos de teste de TLMs são fornecidos no arquivo complementar 3.

  1. Processamento de dados de TLMs na escala celular local (LCS)
    1. Correção de lixívia de TLMs para compensar a deterioração da intensidade de rótulos fluorescentes
      1. Certifique-se de que um aplicativo Fiji atualizado esteja instalado no computador que está sendo usado seguindo estas instruções: fiji > abra um TLM (por exemplo, TestMovie1. tif do arquivo complementar 3).
      2. Divida os canais de cores clicando em imagem > cor > canais divididos.
      3. Realize uma correção de lixívia em ambos os canais usando a imagem > ajustar ≫ correção de lixívia ≫ razão simples > intensidade de fundo 0,0.
        Nota: Se resultados insatisfatórios são obtidos, explorar quais os métodos de correção neste plugin se encaixa melhor (por exemplo, usar histograma correspondência em vez de uma relação simples).
    2. Segmentação de célula para gerar uma máscara de célula para TLMs
      1. Se Fiji ainda não estiver aberta, reabra-a (e certifique-se de que está atualizada) após a ajuda > atualização ≫ aplicar alterações > OK.
      2. Se isso ainda não tiver sido feito, baixe a macro Tissuecellsegmentmovie. IJM (de http://ADM.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.IJM). Arraste e solte este script em Fiji.
      3. Abra o arquivo TLM. TIFF corrigido por lixívia (consulte a seção 1.1.1). Divida os canais do arquivo corrigido por lixívia usando a imagem > cor > canais divididos.
      4. Execute o script carregado no canal de membrana de célula ativa do TLM selecionado pressionando o ícone executar no script aberto. Defina o borrão Gaussian para 2,500 e a sensibilidade de detecção de célula para -1 e clique em OK. A fim de obter uma boa máscara celular, não altere esses parâmetros acima. Defina a tolerância de ruído estimada entre 10 – 20 para TLMs adquiridos com o objetivo 63x e clique em OK.
        Nota: Para outros objetivos, podem ser necessários diferentes parâmetros. O limpador de fundo em um TLM, a menor tolerância ao ruído estimado é necessária.
      5. Uma máscara gerada da pilha aparece no TLM analisado e igualmente em uma janela nova chamada Particlestack (G), e além, uma janela pequena chamada ação exigida aparece. Da máscara da pilha no TLM, concentre-se somente nas pilhas no centro do TLM e selecione aquelas que podem fornecer esboços completos e bem definidos durante todo o TLM.
      6. Se as células selecionadas contiverem contornos de células artificiais/extras, use a janela da ferramenta de mesclagem chamada ação necessária no TLM. Para este último, siga as instruções na janela.
        Nota: Certifique-se de que os contornos da célula estão bem definidos e correspondem às membranas celulares reais em um TLM, pois qualquer imprecisão pode impactar as análises subsequentes. Ajustes e alterações adicionais, como a remoção de células indesejadas, podem ser feitos posteriormente usando a ferramenta Gerenciador de superfície (descrita na seção 1.1.3).
      7. Quando as células selecionadas no centro correspondem bem às membranas celulares reais, salve ParticleStack como um arquivo. TIFF após o arquivo ≫ salvar como > TIFF.
    3. Carregamento da máscara de célula gerada no Gerenciador de superfície
      1. Instale o Surface Manager plugin15 na configuração de Fiji usada. Siga as instruções de Viktorinova et al.16.
      2. Abra o Surface Manager utilizando Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D).
        Nota: A janela do Gerenciador de superfície exibe vários botões de ação à direita e uma janela vazia à esquerda. Para ver todos os botões de ação, pode ser necessário esticar a janela em sua altura/largura. Observe que os prazos aparecerão como fatias z.
      3. Abra o arquivo ParticleStack. TIFF correspondente no Surface Manager clicando em arquivo > abrir e selecione a imagem para abrir (por exemplo, ParticlesStack1. tif).
      4. No Surface Manager, clique no botão ler imagem da estrutura de tópicos e defina o índice Jacquard para 60%.
        Nota: Carregar o arquivo ParticlesStack1. tif pode demorar até vários minutos, dependendo da potência de processamento do computador.
      5. Uma vez carregado, cada célula será atribuída com um número S e aparecerá na parte esquerda da janela do Surface Manager.
        Nota: Para mostrar contornos e nomes de célula para todas as células, marque as caixas de seleção Mostrar todas e Mostrar rótulos na parte inferior da janela do Gerenciador de superfície. Recomenda-se usar esta função uma vez que os números de pilha estiveram verificados para sua exatidão.
      6. Clique no primeiro número S; o contorno da célula importada de ParticlesStack1. tif aparece no TLM. Verifique cada número S importado para a qualidade do contorno da célula em todo o TLM e remova as células indesejadas que exibem contornos de célula incorretos. Para fazer isso, realce o contorno da célula e clique no botão delete.
        Nota: Também é possível corrigir os contornos das células imprecisas e adicionar novos contornos de células. Isso é descrito na seção de discussão.
      7. Salve todas as células corrigidas como um arquivo RoiSet. zip pressionando o botão salvar no disco .
        Nota: Se a sessão precisa ser interrompida, é possível carregar o arquivo RoiSet no Gerenciador de superfície mais tarde: Abra um TLM em Fiji (arquivo > abrir) e selecione um TLM. Abra o Gerenciador de superfície via Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D). Carregue o arquivo RoiSet. zip correspondente clicando no botão Load do disco e escolhendo o arquivo roiset. zip apropriado. Verifique se as máscaras de célula carregadas correspondem ao TLM carregado.
    4. Correção para tração tecidual em TLMs
      Nota: Durante o tempo de aquisição dos TLMs, os efeitos de deriva podem ser observados devido à rotação epitelial ou a um movimento indesejado. Em ambos os casos, nós recomendamos corrigir para toda a tração a fim simplificar a análise manual do actomiosina mais tarde. A correção de deriva é necessária apenas para a análise de actomiosina manual. Este tutorial requer software up-to-date de Fiji com o MultiStackReg plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) instalado.
      1. Abra o TLM lixívia-corrigido em Fiji através do arquivo > abrir e selecione o arquivo Bleach-corrigido criado usando o tutorial mencionado acima.
      2. Divida os canais e selecione aquele que identifica as membranas celulares através da imagem > cor > canais divididos.
      3. Use o seguinte protocolo quando os contornos da célula não são visivelmente suaves: processo > filtros ≫ borrão Gaussian. Defina-o como ~ 1 – 2 para um objetivo de 63x e clique em OK e então Sim. Clique em processar > binário > converter para mascarar usando as configurações padrão; em seguida, clique em OK.
      4. Carregar o plugin MultiStackReg seguintes Plugins > Registration > multistackreg.
      5. Certifique-se de que a pilha 1 está definida para o canal de membrana da célula, ação 1 é definida como alinhar e transformação é definida como tradução. Marque a caixa de seleção salvar arquivo de transformação e clique em OK.
      6. Reabra o TLM selecionado, o plug-in MultiStackReg e o arquivo de transformação salvo usando o arquivo > abrir e selecione um TLM. Divida os canais de cores usando a imagem > cor > canais divididos.
      7. Carregue o plugin MultiStackReg clicando em Plugins > Registration > multistackreg. Selecione carregar arquivo de transformação como ação 1.
      8. Deixe a transformação como corpo rígido e clique em OK. Selecione o arquivo de transformação salvo anteriormente e clique em OK novamente.
      9. Mesclar os canais de imagem e salvar o TLM registrado como um arquivo. TIFF após a imagem > cor > mesclar canais. Salve o arquivo clicando em arquivo ≫ salvar como > TIFF.
        Nota: Existem maneiras alternativas para corrigir uma deriva de tecido em Fiji, ou seja, através de Plugins > registro > Stackreg/desvio 3D correto.
  2. Análise de pulsos de actomiosina no gerente de superfície da LCS
    Nota: Esta etapa do protocolo permite que os cientistas identifiquem se os pulsos do actomiosina estão atuais no tecido analisado e para compreender o comportamento detalhado assim como a direcionalidade de sinais do actomiosina.
    1. Abra Fiji e assegure-se de que um TLM e sua máscara de célula correspondente estejam abertos no Gerenciador de superfície.
      Nota: Assegure-se de que Fiji esteja instalado e atualizado e que o plugin do Surface Manager esteja instalado (etapa 1.1.3.1).
    2. Abra um TLM com arquivo > abrir e selecione um TLM para abrir (por exemplo, TestMovie1_bleach. tif). Carregar o Gerenciador de superfície plugin via Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D). Carregar a máscara de célula salva criada no tutorial aqui (por exemplo, ParticlesStack1. tif) via arquivo > abrir e selecione uma máscara de célula (por exemplo, ParticlesStack1. tif). Carregue a região de interesse correspondente (ROI, por exemplo, TestMovie1_RoiSet. zip). Consulte a Figura 3a.
    3. Mude para o canal de interesse no TLM seleccionado.
      Nota: Para distinguir os canais, siga o código de cores indicado em torno do TLM.
    4. No Surface Manager, clique no botão estatísticas para obter a janela denominada valor cinzento médio fatia por fatia (Figura 3B). Note-se que os valores de intensidade média/mediana dos sinais de actomiosina em um determinado canal analisado dentro dos contornos das células definidas ao longo do tempo serão exibidos, bem como outros parâmetros relacionados à área celular e à forma celular.
      Nota: Os valores de intensidade estão em unidades de arbitraty (U.A.); a área da célula está em pixels e precisa ser convertido em micrômetros quadrados.
    5. Salve os valores obtidos como um arquivo de planilha. Clique na janela estatísticas, arquivo ≫ salvar como.
      Nota: É possível verificar os valores estatísticos obtidos mais tarde como segue: Abra o TLM lixívia-corrigido em Fiji e abra o gerente de superfície. Carregue o RoiSet. zip correspondente ao TLM pressionando o botão Load do disco e abra o arquivo. A máscara salva com contornos de célula será carregada e os nomes das células aparecerá na janela do Gerenciador de superfície à esquerda. Clique no botão estatísticas para valores estatísticos.
  3. Análise manual de sinais de actomiosina subcelular individuais na LCS
    Nota: Este protocolo exige a maioria de concentração e é demorado. Em geral, um TLM adquirido pode ser confortavelmente analisado dentro de 1 dia. Isto não inclui o tempo para a preparação da mosca antes de sua dissecção, a dissecção própria, e a aquisição da imagem.
    1. Abra um TLM selecionado, lixívia-corrigido e registrado (drift-corrigido) em uma aplicação up-to-date de Fiji. Use uma TLM corrigida por lixívia e corrigida por deriva (por exemplo, TestMovie1_bleach_reg. tif) como exemplo de teste.
    2. Ajuste o brilho e o contraste para ver os sinais de actomiosina individuais usando a imagem > ajustar > brilho/contraste.
    3. Alinhe os TLMs na mesma direção em relação ao eixo do tecido/corpo. No caso das câmaras de ovo, alinhe o lado anterior das câmaras de ovo sempre à esquerda da imagem/subfilme/TLM antes da análise.
    4. Divida o filme selecionado em curtas 30 s submovies e time-Project cada um deles. Salve SubFilmes projetados em tempo não projetado e projetados por tempo com nomes correspondentes. Mantenha a fonte original.
      Nota: Os SubFilmes podem ser criados a partir de TLMs originais pela primeira exclusão de quadros indesejados via Image > Stacks > Slice remover. Defina as fatias a serem removidas e defina incremento. Transforme em RGB antes de usar o removedor de fatia quando Increment = 1. Para projetar um subfilme de 30 s, clique em imagem > Stacks > Z-Project > intensidade máxima para os quadros definidos (fatias) e, em seguida, clique em OK. Pule cada segundo subfilme de 30 s, a fim de evitar a contagem de sinais de actomiosina 2x em dois SubFilmes 30 s subsequentes.
    5. Coloque uma imagem projetada para o tempo ao lado do subfilme correspondente de 30 s (figura 4a, B). Identifique a linha de sinal no subfilme projectado pelo tempo. Identifique a direção do movimento do sinal de actomiosina (0 ° – 360 °) ao longo desta linha no subfilme original ao reproduzir manualmente o subfilme. Use a ferramenta Angle (na barra de Fiji) para medir manualmente a direção do movimento do sinal em relação ao eixo do tecido definido ou a uma ferramenta disponível semelhante.
      Nota: Fiji só funciona em uma escala de 0 ° – 180 ° (Figura 4C), e um recálculo dos valores obtidos para uma escala de 0 ° – 360 ° é necessário. Uma linha de sinal corresponde à trajetória de um movimento de sinal de actomiosina ao longo do tempo.
    6. Para evitar a duplicação na análise dos sinais de actomiosina, marque as linhas de sinal analisadas dentro das células no subfilme projectado pelo tempo (Figura 4B, D).
    7. Analise todas as células selecionadas no subfilme de 30 s e salve os ângulos obtidos.
      Nota: Analise somente sinais citoplasmáticos subcelulares do actomiosina nas pilhas com os esboços bem definidos da pilha durante todo um TLM. Exclua células individuais com menos de 15 – 20 sinais detectados em todo o TLM. Ignore sinais de actomiosina que se movem através de células devido à sua origem desconhecida. Um exemplo de contagem de sinais para uma célula analisada no subfilme de 30 s é mostrado na Figura 4D.
    8. Continue até que todos os 30 s-Long submovies de um TLM são analisados, e salvar todos os ângulos medidos de sinais de actomiosina de um TLM em um arquivo de planilha.
    9. Resumir todos os ângulos medidos sobre o número relevante de TLMs (dependente do experimento). Plotar a porcentagem da direção dos sinais de actomiosina analisados, por exemplo, como um diagrama de rosa com um intervalo de 0 ° a 360 ° com um software preferencial.
      Nota: Para se obter resultados estatisticamente significantes, recomenda-se a análise de cinco a dez câmaras de ovos independentes de qualquer fase da câmara de ovos.

2. escala do tecido

Nota: Para dissecar e imagem in vitro cultivadas câmaras de ovo de Drosophila , siga o protocolo em arquivo complementar 2. Para analisar os TLMs adquiridos, continue com o seguinte protocolo abaixo. Os arquivos de teste acompanhados de TLMs são colocados no arquivo complementar 3.

  1. Extração seletiva de superfície de tecidos epiteliais curvados
    Nota:Este protocolo permite que os usuários extraem seletivamente uma camada fina de actomiosina em um tecido epithelial curvado sobre o tempo. Esta etapa de protocolo é fácil de usar e baseada em uma interface gráfica intuitiva. É possível analisar confortavelmente (superfície do extrato) vários TLMs. Use TestMovie2. CZI (doArquivo complementar 3) como um exemplo TLM de teste.
    1. Abra um aplicativo up-to-date Fiji (fiji > ajuda ≫ Atualizar > aplicar alterações > OK).
    2. Assegure-se de que o plugin de projeção de superfície Ellipsoid15 esteja instalado. Seguir Viktorinova et al. a 16.
    3. Abra um TLM e exportá-lo como um arquivo XML/HDF5 clicando em Plugins ≫ bigdataviewer > Exportar imagem atual como arquivo XML/HDF5.
      Nota: É necessário definir um caminho de exportação. A poupança em si pode demorar vários minutos e depende do comprimento TLM.
    4. Abra o arquivo exportado na projeção de superfície Ellipsoid clicando em Plugins ≫ bigdataviewer ≫ projeção de superfície ELIPSÓIDE > Selecionar arquivo XML.
      Nota: Uma nova janela com vistas sagitais da câmara de ovo e uma caixa de diálogo para guiar o usuário através do processamento aparecerá. Detalhes sobre como navegar na vista de fatia podem ser encontrados em https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. A janela de diálogo chamada projeção de ovários tem várias abas. Na primeira guia de diálogo chamada caixa delimitadora, defina as bordas x e y de uma câmara de ovo no TLM juntamente com a largura z da caixa delimitadora (ou seja, a profundidade de uma pilha z/câmara de ovo) e pressione set (Figura 5a).
    6. Para definir bordas, arraste os botões ao lado de x, y e z ou defina as coordenadas numéricas nas caixas x, y e z. Assegure-se de que as beiras sejam generosas bastante para começ a parte da câmara de ovo do interesse na extração de superfície. As partes selecionadas da câmara de ovo são destacadas em rosa.
    7. Alterne para a guia chamada Localizar BLOBs na janela Ovaria projeção. Defina o Sigma e o valor mínimo de pico; em seguida, pressione COMPUTE para identificar os sinais de actomiosina (Figura 5b), que aparecerá como BLOBs verdes. Repita esta etapa com parâmetros diferentes até que pontos suficientes (cerca de 100) sejam encontrados.
      Nota: Sigma 1 \ u20123 com valor mínimo de pico 20 \ u2012100 funciona o melhor para identificar sinais de actomiosina de Stage-6 para-8 câmaras de ovo. A identificação de sinais de actomiosina é um passo crucial e depende da qualidade do sinal e do seu tamanho. É importante confirmar o tamanho correto dos BLOBs existentes. Nenhuma mancha verde visível/BLOBs na imagem significa que a próxima etapa não funcionará. Navegue pelos planos z selecionados para ver os BLOBs.
    8. Para projetar o elipsóide, continue com a guia chamada elipsóide de ajuste. Defina amostras aleatórias para 10.000, fora/dentro da distância de corte para 1 \ u201210 e, em seguida, clique em Compute (Figura 5C).
      Nota: Quanto menor a distância de corte, mais precisa será o elipsóide desejado. Depois disso, a guia chamada projeção abrirá automaticamente e permite a definição da extração de superfície. As configurações precisam ser otimizadas.
    9. Continue com a guia chamada projeção (Figura 5D). Configure uma distância de projeção mínima e máxima (ou seja, a largura do elipsóide desejado). É necessário definir uma distância de projeção mínima e máxima para que a região elipsóide definida por rosa inclua toda a camada externa da câmara de ovo. Defina a distância da fatia (1 é recomendado).
      Nota: Exemplos de um ajuste elipsóide incorreto e ótimo, resultando em parâmetros de projeção incorretos e ideais são mostrados na figura 6A, C. A camada circunferencial fina do interesse pode ser definida mais tarde. Certifique-se de que a região rosa do elipsóide com a largura definida na câmara de ovo seja visível antes de pressionar a computação. É importante que o elipsóide desejado (linha única rosa) caiba bem a superfície elipsóide de uma câmara de ovo, a fim de obter os melhores resultados. Se o ajuste elipsóide não for bom, organize configurações diferentes até que a extração de superfície desejada seja obtida.
      1. Defina uma largura de saída (≥ 800) e altura (≥ 400) do elipsóide. Definir a partir da qual ponto de hora a que ponto de tempo a extração de superfície deve ser criada (ou seja, definir o comprimento da extração TLM). Escolha uma projeção esférica ou cilíndrica. Flip Z e alinhar Y se necessário.
      2. Pressione COMPUTE para obter uma extração de superfície para ambos os canais em novas janelas chamadas Image. Ajuste o brilho e o contraste das janelas de imagem obtidas para poder ver os sinais de actomiosina projetados, clicando em imagem > ajustar > brilho/contraste.
        Nota: Uma comparação de exemplo de uma projeção resultante de um ajuste elipsóide incorreto e ideal é mostrada na Figura 6B, D.
    10. Se a extração de superfície parece boa, salve as imagens (ambos os canais separadamente) como. TIFF. Além disso, salve o arquivo de janela de log para referência futura sobre como a superfície desta câmara de ovo em particular foi extraída.
      Nota: Esta é uma informação particularmente importante se a camada fina extraída deve ser devolvida à sua forma original desdobrada (apenas para programadores).
    11. Mesclar os canais com um código de cores preferido em Fiji.
      Nota: Se necessário, projese camadas z-Stack selecionadas com sinais de actomiosina. A projeção de camadas z-Stack selecionadas é necessária quando o foco de aquisição muda ligeiramente ao longo do tempo em um TLM. Para obter melhores resultados, projelhe no máximo uma a duas camadas de pilha z.
    12. Salve os resultados como arquivos. TIFF.
      Nota: Exemplos representativos de camadas finas (superfície basal e apical seletiva) que representam o sinal de myosin II (MRLC:: GFP) do epitélio folículo do controle e das câmaras de ovos mutantes corporal2 podem ser encontrados na Figura 8.
  2. Processamento de dados de uma superfície de tecido selectivamente extraída
    1. Bleach-corrija os TLMs para compensar a deterioração da intensidade das etiquetas fluorescentes.
      1. Abra Fiji. Abra um TLM (por exemplo, TestMovie2_extraction. tif do arquivo complementar 3) usando o arquivo > abrir. Selecione a imagem para abri-la.
      2. Divida os canais de cores e converta-os em imagens de 16 bits, se necessário, clicando em imagem > cor > canais divididos. Converta os canais em imagens de 16 bits (de imagens de 32 bits) usando o tipo Image > > 16 bits.
      3. Realize uma correção de lixívia em ambos os canais usando a imagem > ajustar ≫ correção de lixívia ≫ razão simples > intensidade de fundo 0,0.
        Nota: Se resultados insatisfatórios são obtidos, é necessário para explorar quais os métodos de correção neste plugin melhor ajuste (por exemplo, usar histograma Matching em vez de uma relação simples).
      4. Mesclar os canais das duas imagens corrigidas por lixívia clicando em imagem > cor > mesclar canais. Salve a imagem mesclada como um arquivo. TIFF clicando em arquivo ≫ salvar como > TIFF.
        Nota: Ajuste o contraste e o brilho dos canais, se necessário.
    2. Segmentação de célula para gerar uma máscara de célula para TLMs
      1. Se Fiji ainda não estiver aberta, reabra-a (e certifique-se de que está atualizada clicando em ajuda > Atualizar ≫ aplicar alterações > OK).
      2. Se isso ainda não estiver feito, baixe a macro TissueCellSegmentMovie. IJM (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Arraste e solte este script em Fiji. Abra o arquivo corrigido de lixívia (por exemplo, TestMovie2_bleach. tif do arquivo complementar 3, consulte também 2.2.1).
      4. Divida os canais do arquivo corrigido por lixívia clicando na imagem > cor > canais divididos. Ajuste o canal de membrana para garantir contornos de células claras clicando em imagem > ajustar > brilho/contraste.
      5. Execute o script carregado no canal de membrana de célula ativa do TLM selecionado pressionando o ícone executar no script aberto. Defina Gaussian Blur para 1,500. Defina a sensibilidade de detecção de célula como-1 e clique em OK. Defina a tolerância ao ruído estimada para ~ 8 para TLMS adquiridos com o objetivo de 40x e clique em OK.
        Nota: A fim de obter uma boa máscara celular, não altere esses parâmetros acima. Para outros objetivos, podem ser necessários diferentes parâmetros. O limpador de fundo em um TLM, a menor tolerância ao ruído estimado é necessária.
      6. Uma máscara de célula gerada aparece no TLM analisado e também em uma nova janela chamada Particlestack (G). Além disso, uma pequena janela chamada ação necessária aparece. Da máscara da pilha no TLM, concentre-se somente nas pilhas no centro do TLM e selecione aquelas que podem fornecer esboços completos e bem definidos durante todo o TLM.
      7. Se as células selecionadas contiverem contornos de células artificiais/extras, use a janela da ferramenta de mesclagem chamada Action necessária no TLM. Para este último, siga as instruções na janela.
        Nota: Certifique-se de que os contornos da célula estão bem definidos e correspondem às membranas celulares reais em um TLM, pois qualquer imprecisão pode impactar as análises subsequentes. Ajustes e alterações adicionais, como a remoção de células indesejadas, podem ser feitos posteriormente usando a ferramenta Gerenciador de superfície (descrita no tutorial abaixo).
      8. Quando as células selecionadas no centro correspondem bem às membranas celulares reais, salve o ParticleStack como um arquivo. TIFF após o arquivo ≫ salvar como > TIFF. Prossiga para executar o carregamento da máscara de célula gerada e a análise de actomiosina no Surface Manager como anteriormente realizada nas secções 1.1.3 e 1,2 (também descrita em pormenor nas secções 2.2.3 e 2,3).
    3. Carregamento da máscara de célula gerada no Gerenciador de superfície
      1. Se o plug-in do Surface Manager já estiver instalado na configuração de Fiji utilizada, avance para o passo 2. Se não, siga Viktorinova et al.16. Para os desenvolvedores, apenas o código-fonte também está disponível15.
      2. Abra o Surface Manager clicando em Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D).
        Nota: A janela do Gerenciador de superfície exibe vários botões de ação à direita e uma janela vazia à esquerda. Para ver todos os botões de ação, pode ser necessário esticar a janela em sua altura/largura. Observe que os prazos aparecerão como fatias z.
      3. Abra o arquivo ParticleStack. tif correspondente no Surface Manager via arquivo > abrir e selecione a imagem para abrir (por exemplo, ParticleStack2. tif do arquivo complementar 3).
      4. No Surface Manager, clique no botão ler imagem da estrutura de tópicos e defina o índice Jacquard para 60%.
        Nota: Carregando um arquivo ParticleStack. tif pode demorar até vários minutos, dependendo da energia do computador.
      5. Uma vez carregado, cada célula será atribuída com um número S e aparecerá na parte esquerda da janela do Surface Manager (Figura 7a).
        Nota: Para mostrar contornos e nomes de célula para todas as células, marque as caixas de seleção Mostrar todas e Mostrar rótulos na parte inferior da janela do Gerenciador de superfície. Recomenda-se usar esta função uma vez que os números de pilha estiveram verificados para sua exatidão.
      6. Clique no primeiro número S; o contorno da célula importada de ParticleStack. tif aparece no TLM. Verifique cada número S importado para a qualidade do contorno da célula em todo o TLM e remova as células indesejadas que exibem contornos de célula incorretos. Para fazer isso, realce o contorno da célula e clique no botão delete.
        Nota: Também é possível corrigir os contornos das células imprecisas e adicionar novos contornos de células. Isso é descrito na seção de discussão.
      7. Salve todas as células corrigidas como um arquivo RoiSet. zip pressionando o botão salvar no disco .
        Nota: Se a sessão precisa ser interrompida, é possível carregar o arquivo RoiSet. zip no Surface Manager mais tarde: Abra um TLM em Fiji via arquivo > abrir e selecione um TLM. Abra o Gerenciador de superfície da seguinte maneira: Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D). Carregue o RoiSet. zip correspondente clicando no botão Load do disco e escolhendo o arquivo RoiSet. zip apropriado (por exemplo, TestMovie2_RoiSet. zip). Verifique se as máscaras de célula carregadas correspondem ao TLM carregado.
  3. Análise de pulsos de actomiosina no Surface Manager
    Nota: Abra Fiji e assegure-se de que um TLM e sua máscara de célula correspondente estejam abertos no Gerenciador de superfície. Assegure-se de que Fiji esteja instalado e atualizado e que o Surface Manager plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) esteja instalado.
    1. Abra um TLM com arquivo > abrir e selecione um TLM para abrir (por exemplo, TestMovie2_bleach. tif). Carregue o plugin do Surface Manager através de Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D). Carregar a máscara de célula salva criada no tutorial aqui (por exemplo, ParticlesStack2. tif) via arquivo > abrir e selecione uma máscara de célula (por exemplo, ParticlesStack2. tif). Carregue o ROI correspondente (por exemplo, TestMovie2_RoiSet. zip).
    2. Mude para o canal de interesse no TLM seleccionado.
      Nota: Para distinguir entre os canais, siga o código de cores indicado em torno do TLM.
    3. No gestor de superfície, clique no botão estatísticas para obter a janela denominada valor cinzento médio fatia por fatia (Figura 7B). Note-se que os valores de intensidade média/mediana dos sinais de actomiosina em um determinado canal analisado dentro dos contornos das células definidas ao longo do tempo serão exibidos, bem como outros parâmetros relacionados à área celular e à forma celular.
      Nota: Os valores de intensidade estão em U.A.; a área da célula está em pixels e precisa ser convertido em micrômetros quadrados.
    4. Salvar os valores obtidos como um arquivo de planilha: clique na janela estatísticas, arquivo ≫ salvar como.
      Nota: É possível verificar os valores estatísticos obtidos posteriormente, como se segue. Abra a TLM corrigida com lixívia em Fiji. Abra o Gerenciador de superfície. Carregue o RoiSet. zip correspondente ao TLM pressionando o botão Load do disco e abra o arquivo. A máscara salva com contornos de célula será carregada e os nomes das células aparecerá na janela do Gerenciador de superfície à esquerda. Clique no botão estatísticas para valores estatísticos.
      Nota: Em relação a uma análise manual de sinais de actomiosina subcelular individuais, não é possível realizar uma análise manual dos sinais de actomiosina subcelular na escala tecidual. A otimização é necessária para a análise de sinais de actomiosina individuais na escala semitecidual, como destacado na seção de discussão.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo permite que os cientistas investiguem o comportamento das redes de actomiosina nos tecidos epiteliais. Isso só é possível quando uma análise detalhada do comportamento da actomiosina na escala celular local (algumas células) é combinada com uma análise semelhante na escala tecidual (muitas células). No entanto, os tecidos epiteliais são frequentemente curvados e a extração de uma fina camada desses tecidos não foi antes facilmente possível, como mostrado nas câmaras de ovos...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etapas críticas e solução de problemas para a dissecação e cultivo de câmaras de ovo

Se muitas moscas são colocadas em um pequeno frasco, o alimento mosca pode virar lamacento após 2 – 3 dias devido a grandes quantidades de larvas de alimentação e moscas adultas ficando presos no alimento mosca. Nesse caso, vire o resto dessas moscas em um novo frasco com alimentos frescos e reduzir seu número. Em particular, excluir as fêmeas que estavam presas na comida.

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores são muito gratos a Miriam Osterfield por compartilhar seu Conselho sobre a vida in vitro de imagens de câmaras de ovo usando uma abordagem adotada a partir do laboratório Celeste Berg4. Agradecemos também a Sebastian Tosi pelo roteiro de Fiji que permite a segmentação de células.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Schneider MediumGibco21720-024[+]-Glutamina
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140-122 [ +] 10.000 Unidades/mL Penicilina [+] 10.000 µ g/mL de Estreptomicina
Fetal Bovino SerumSigma  Solução deInativada por Calor
HumanSigma  I9278
Tubos Falcon de 50 mLestérilEppendorf
Millex-GVMilliporeSLGV033NS33 mm
Pratos de micropoços com fundo de vidroMatTek CorporationP35G-1.5-14-CPlaca de Petri de 35 mm, Micropoço de 14 mm, vidro de cobertura nº 1.5
FórcepsA. Dumont & Fils #55
CellMask Deep Red (corante de membrana celular)InvitrogenC10046
FM4-64 (corante de membrana celular)ThermoFisher/InvitrogenT13320
Lâmina de dissecção de depressãoFisher Scientific12-560B
Equipamento microscópico
Steromicroscopepor exemplo, ZeissStemi SV 6
Microscópio confocal invertido, por exemplo, Zeiss/Olympus
Microscópio de disco giratório, por exemplo, Zeiss/Andor
Vidro microscópico/vidro de cobertura, por exemplo, Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit porta-agulhasHammacher9160020
Espinha de cactoEchinocactus grusonii / cacto
< strong>Drosophila< / em> estoques usados no manuscrito< / strong>
AX3< / sup> / AX3< / sup>; sqh-MRLC :: GFP / sqh-MRLC :: GFP< / em>Para obter detalhes, consulte Rauzi et al.: Os fluxos contráteis de actomiosina polarizada planar controlam a remodelação da junção epitelial. Natureza 2010, Vol. 468, pág. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103CPara detalhes, consulte Viktorinova et al.: A rotação epitelial é precedida pela quebra da simetria planar da actomiosina e protege o tecido epitelial das deformações celulares. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Edição 11, pág. e1007107.
Insulina F135 Filtro de barril

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
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  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511(2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
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  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
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  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

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