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Recuperação de Biocytin e reconstruções 3D de CA2 Hippocampal enchido interneurônios

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DOI:

10.3791/58592

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20 de novembro de 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo descrito aqui descreve a análise de imunofluorescência, recuperação de biocytin e reconstruções de alta qualidade de hippocampal CA2 interneurônios seguindo o intracelulares gravações eletrofisiológicas in vitro, permitindo neuronal caracterização e anatomia neuronal, finalmente, bem a ser estudado.

Resumo

Como atividade cortical rede processa informações é de importância para um grande número de questões científicas básicas e clínicas. O protocolo descrito aqui identifica os blocos de construção básicos deste circuito. Os estudos em profundidade das regiões corticais, finalmente, irão fornecer outros cientistas com os componentes do circuito necessário para a compreensão de como o cérebro adquire, processa e armazena as informações e o que dá errado na doença, enquanto o eletrofisiológicos e dados morfológicos são amplamente utilizados pelos neurocientistas computacionais na construção de redes de modelo que explorar o processamento de informações. O protocolo descrito aqui descreve como células cheias de biocytin gravadas na região do hipocampo de CA2 são recuperadas e depois reconstruídas em 3D. Além disso, o protocolo descreve a demonstração da proteína de ligação de cálcio ou peptídeo conteúdo em interneurônios gravados.

Introdução

O córtex e hipocampo são estruturas de complexidade que a classificação de neuronal subtipos1,2,3,4, mapas das conexões entre eles5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 e como este circuito suporta funções cognitivas12,13,14,15 ainda estão sob intenso estudo e objecto de debate contínuo. Por exemplo, para entender os detalhes e complexidades do circuito e coordenar dados obtidos de muitos estudos diferentes, é extremamente útil ser capaz de definir e descrever os componentes, mas continua a ser tema de debate como muitos diferentes classes de neurônios existem, ou mesmo se é possível definir todos os neurônios como pertencendo a uma classe específica. Ferramentas computacionais que podem construir e testar circuitos com diferentes graus de complexidade estão sendo desenvolvidos16,17,18, mas central para estes empreendimentos é a necessidade de estudos detalhados, os tipos de células e as propriedades das conexões entre eles. Uma grande quantidade de informações sobre os circuitos locais do neocórtex de ratos adultos já foram coletada usando o protocolo descrito aqui10,19,20,21, 22. embora o "diagrama de fiação" está longe de ser completa, alguns limpar padrões ou regras surgiram. Além disso, embora alguns detalhes variam, estas regras são comuns a duas espécies de mamíferos (rato e gato) e através de várias regiões neocortical, permitindo o desenvolvimento de blocos de construção básicos que são susceptíveis de ser igualmente aplicável ao neocórtex humano. A técnica descrita aqui é usada para estender a nossa compreensão do mapa funcional de circuitos corticais identificando os neurônios pré-sináptica e pós-sináptica envolvidos nas conexões, nas regiões que não têm sido estudadas em detalhe antes, usando um protocolo Isso permite que tecido excelente preservação e recuperação de coloração notável no tecido do cérebro de um adulto. Foram coletados dados sobre os circuitos locais em CA2 e propriedades neuronais neste subcampo com este método combinando intracelulares eletrofisiológicas gravações (emparelhado com microeletrodos afiados) com biocytin de enchimento, imunofluorescência, procedimentos histológicos e reconstruções neuronais altamente detalhados, permitindo a comparação direta com o vizinho CA regiões23,24,25.

A técnica descrita neste artigo foi desenvolvida ao longo dos anos para obter detalhadas sobre anatomia neuronal, permitindo a correcta classificação das células e da alta qualidade e precisa reconstruções de ambos seus dendríticas e axonal mandris, dados que podem ser correlacionados com dados eletrofisiológicos coletados de emparelhados gravações usando eletrodos afiados. O protocolo histológico foi otimizado para preservar a ultraestrutura dos neurônios e obter excelente recuperação de mandris axonal e dendríticas (incluindo espinhos). Por exemplo, o princípio da técnica dupla fixação imergindo-se em primeiro lugar em uma solução de fixador e em segundo lugar, pós-fixação em tetróxido de ósmio dá um bom contraste para microscopia de luz26. Uma pequena quantidade de solução de ácido pícrico e glutaraldeído são adicionados à solução fixador para melhorar a penetração do anticorpo e preservar a ultraestrutura das células, como sugerido em um anterior de estudo27. A permeabilização das fatias de cérebro usando o método de congelamento-descongelamento combinado com cryo-proteção com sacarose, ao invés de um detergente tradicional, também oferece óptima preservação dos tecidos para análise morfológica detalhada das células gravadas. Além disso, a visualização particularmente de muito belas estruturas é melhorada através da redução de coloração de fundo, com a incubação com peróxido de hidrogênio (H2O2) e o boro-hidreto de sódio (NaBH4). Adição de cloreto de níquel (NiCl2) para a peroxidase de rábano (HRP) reação para obtenção de um produto de reação de pigmento preto também aumenta o contraste.

O protocolo seguinte descreve os procedimentos utilizados para determinar a preservação de tecido excelente e altamente detalhadas reconstruções 3D neuronais após gravações intracelular em vitro. A descrição da preparação fatia, intracelulares emparelhadas gravações usando eletrodos em ponto e subsequentes procedimentos histológicos utilizados em nosso laboratório têm sido relatado anteriormente28. Embora o protocolo aplica-se às células intracelular repleta de biocytin em fatias grossas de 450-500 μm, o mesmo protocolo pode ser usado após gravações de células inteiras. No entanto, o uso das mais finas fatias resultará em menos completas reconstruções das células.

Protocolo

Todos os procedimentos utilizados ao longo deste estudo foram realizados de acordo com os regulamentos da British Home Office no que respeita a lei de procedimentos científicos Animal 1986.

1. determinação da ligação da proteína ou proteína conteúdo de interneurônios e visualização de Biocytin seguintes gravações eletrofisiológicas e enchimento de Biocytin de cálcio

Nota: No final das gravações eletrofisiológicos, que contêm células cheias de biocytin fatias são fixos durante a noite antes de procedimentos histológicos. A solução fixador será substituída com uma simples mudança de tampão de fosfato 0,1 M na manhã seguinte, se o resto do procedimento é realizado em outro dia, a fim de evitar danos aos tecidos. A solução de fixação (paraformaldeído 4%, solução de ácido pícrico 0,2% saturada, solução de glutaraldeído 0.025% em tampão de fosfato 0,1 M (PB)) deve ser feita fresca no dia das gravações para obter melhores resultados.

  1. No final da gravação eletrofisiológica, cuidadosamente pegar a fatia que contém as células gravadas com um pincel e colocá-lo em um pote contendo fluido espinal cerebral artificial (ACSF).
    Nota: Informações sobre o protocolo usado para a preparação de fatia e intracelulares gravações usando eletrodos afiados tem sido descrito anteriormente,28.
  2. Em uma coifa, cuidadosamente pegar a fatia do cérebro com um pincel e rolá-la sobre um pequeno pedaço de papel de filtro de qualidade fina. Coloque outro pedaço de papel de filtro umedecido para a fatia e coloque os dois pedaços de papel de filtro molhado em um pequeno pote de plástico contendo 5-10 mL de solução fixador e guarde na geladeira durante a noite a 4 ° C.
  3. Prepare uma solução de gelatina em água destilada. Colocar 20 mL de água destilada num copo num prato quente e aquecê-lo a 60 ° C. Adicionar progressivamente a 2,4 g de gelatina na água, espere até dissolver e deixe-a esfriar a 35 – 40 ° C antes do uso para evitar danos aos tecidos.
  4. Substitua a solução fixador com 2 mL de PB de 0,1 M. Coloque a fatia em um prato de Petri e corte qualquer excesso de tecido com uma lâmina de bisturi. Coloque o tecido cortado em um prato de Petri (diâmetro de 9 cm, altura de 1,4 cm), garantindo que fica Lisa sem dobras ou vincos e remover o excesso buffer usando um pincel seco.
  5. Cubra o tecido com a solução de gelatina quente e coloque o prato de Petri sobre um bloco congelado arrefecer rapidamente a solução.
  6. Usando uma lâmpada de ângulo-poise para fornecer contraste, olhe pelo lado do prato e manter a fatia plana exercendo uma ligeira pressão de um pincel fino até que a gelatina comece a definir.
    Nota: A gelatina pode ser re-derretida se o tecido não deite-se. Todas as imperfeições na superfície da gelatina causada pela remoção do pincel como ela se solidifica podem ser removidas pelo derretimento da camada de superfície suavemente movendo o bulbo da lâmpada perto da superfície por alguns segundos.
  7. Mover o prato da gelatina de configuração para a geladeira e deixe a 4 ° C por 30-60 min.
  8. Em uma coifa, cortar um pequeno bloco (~ 1 x 1 cm) contendo o gelatina-encaixados do tecido do prato usando uma lâmina de bisturi, retire o bloco usando uma espátula pequena e coloque-o cuidadosamente na mesma mas fresca solução fixador utilizada para fixar as fatias pelo menos 30 min a 4 ° C .
  9. Lave o bloco de gelatina em 5 mL de 0.1 M PB três vezes, seque-o com um pedaço de papel tecido e vara a bloco para cima (ou seja, com o tecido na parte superior) em um vibratome chuck usando Super Bonder.
  10. Remover o excesso de cola com um pedaço de papel de filtro e use uma lâmina de bisturi para cortar os cantos do bloco, deixando uma forma de diamante.
  11. Seção a fatia de 50 µm espessura, usando um vibratome e colocar cada seção cuidadosamente em um frasco de vidro contendo 10% de sacarose.
  12. Cuidadosamente pegue uma seção do frasco, colocá-lo horizontalmente em uma tampa da placa de Petri. Usando um microscópio de dissecação e uma lâmina de bisturi fresco, retire a gelatina ao redor da seção e retornar a seção para um frasco contendo 2 mL de fresco 10% de sacarose
    Nota: É fundamental remover tanto gelatina quanto possível, nesta fase, para reduzir o encolhimento do tecido durante a etapa de desidratação (passo 1,37).
  13. Cryo-proteger as seções em 0.1 solução de sacarose-glicerol M PB-baseado na temperatura de quarto, incubando-os por 10 minutos em solução de sacarose 10%, 20 min em solução de glicerol 20% sacarose - 6% duas vezes e, finalmente, 30 min em solução de glicerol 30% sacarose - 12% duas vezes sob agitação constante.
  14. Coloca as seções planas em um pequeno retângulo de papel alumínio usando um pincel. Remover qualquer excesso de líquido das seções e dobre cuidadosamente o papel alumínio em uma parcela.
  15. Segure o pacote perto da superfície do nitrogênio líquido sem tocar a superfície por 30 s e em seguida, permitir que as seções descongelar completamente para aproximadamente 30 s. repetir o congelamento-descongelamento outro duas vezes.
  16. Remover todas as seções com um pincel e colocá-los em um frasco de vidro contendo 2 mL de 0.1 M PB sob agitação constante para lavar o excesso de sacarose.
  17. Remover o PB com uma pipeta Pasteur e incubar as seções em 2 mL de 1% aquosa H2O2 por 30 min. Lave as seções em 2 mL de 0.1 M PB 3 x 5 min.
  18. Remover o PB de 0,1 M, com uma pipeta Pasteur e adicione borohidreto de sódio de 1% (NaBH4) 0,1 M PB.
    Nota: Não tampa o frasco, como NaBH4 solução desprende-se gás hidrogênio.
  19. Remova o borohidreto de sódio com uma pipeta Pasteur e lave as seções completamente em 2 mL de 0.1 M PB 5 x 5 min.
  20. Substitua o PB 0,1 M com 10% de soro normal de cabra (NGS) em PB de 0,1 M por 30 min.
  21. Retire o soro de cabra e incubar as seções durante a noite a 4 ° C, numa mistura de anticorpo monoclonal de rato e Anticorpos policlonais de coelho, compostos em solução de ABC.
    Nota: Uma lista de anticorpos primários usados em estudos anteriores é exibida na tabela 1 no cretino et al (2014) 29.
  22. Incube as seções para 2h no escuro em uma mistura de fluorescente etiquetado anticorpos secundários (Tabela de materiais).
  23. Monte as seções sobre as guias em meio de montagem e cobrir com uma lamela.
  24. Com imagens de fluorescência rotulagem na ampliação de X 40 (figura 1Bb).
  25. Após a fluorescência de imagem, colocar o slide em um prato de Petri de vidro contendo PBS e remova cuidadosamente a lamela. Em seguida, lave as seções fora do slide usando suaves impulsos de PBS de uma pipeta Pasteur. Coloca as seções em um frasco de vidro limpo contendo PBS.
  26. Realizar a reação de avidina-HRP incubando em primeiro lugar as seções no ABC pelo menos 2 h para amplificar o produto de reação de HRP.
  27. Prepare a solução de 3,5 diaminobenzidina (DAB) pela adição de um comprimido de 5 mL de água destilada.
  28. Lave as seções com PBS, três vezes por 10 minutos e em seguida, com tampão Tris duas vezes durante 10 min. Retire o tampão Tris após a última lavagem.
  29. Rapidamente, adicionar uma gota de solução a 8% NiCl2 para a solução DAB, adicionar a solução de dentro e para fora para misturar e rapidamente, adicionar 1 mL desta solução sobre as seções. Incube as seções na DAB/NiCl2 solução por 15 min.
  30. Adicione 10 µ l de 1% H2O2 para a solução DAB. Permitir que a reação prossiga no escuro sob agitação constante por cerca de 1 a 2 min e monitorar a rotulagem das células preenchidas com um microscópio de dissecação.
  31. Parar a reação, removendo a DAB/NiCl2/h2O2 solução e lave as seções com tampão Tris, duas vezes por 5 min.
  32. Em uma coifa, coloque um pequeno círculo de papel de filtro em uma placa de Petri e abafar com PB de 0,1 M. Levante as seções, uma de cada vez do vidro frasco usando um pincel e coloque-os cuidadosamente plana sobre o papel.
  33. Cobrir as seções com outro círculo umedecida de papel de filtro e remover o tampão excesso tocando delicadamente o papel de tecido para a superfície.
  34. Aplicam-se para o papel de top 8 – 9 gotas de tetróxido de ósmio 1% em 0.1 M PB, cubra o prato e reter na coifa pelo menos 30 min, mas não mais de 1 h.
  35. Abra a caixa de Petri e levantar o papel de filtro superior. Levantar as seções cuidadosamente um de cada vez com um pincel, coloque-os em um frasco de vidro e enxaguá-los em água destilada duas vezes.
  36. Descarte de resíduos de tetróxido de ósmio apropriadamente. Lavar todos os equipamentos descartáveis e colocá-los em tulhas apropriadas.
  37. Coloque cada seção plana sobre uma lâmina de vidro e lamela as seções. Transferir o slide em uma placa de Petri, coloque um frasco de vidro vazio sobre a lamela para retê-lo no lugar e cubra com 50% de álcool. Após 15 minutos, retire o slide da solução e remover as seções de slide. Lugar, as seções de volta no slide e, em seguida, coloque o slide em álcool 70% por 15 min. Repita o mesmo processo com 95% e, finalmente, a solução de álcool 100%.
  38. Após a etapa de desidratação, transferi as seções para um frasco de vidro contendo 100% de álcool em um shaker em uma coifa. Substitua a solução de álcool com óxido de propileno (C3H6O) e lavar três vezes por 5 min. Após a última lavagem, mantenha ~ 2 mL de óxido de propileno no frasco e adicione resina (proporção de 1:1). Certifique-se de que a resina é dissolvida e manter as seções sob constante agitação por 30 min.
  39. Coloque cada seção em uma tábua de alumínio contendo resina de cola epoxy usando uma vara de madeira e incubar durante uma noite.
    Nota: Não deixe as seções na resina mais de 24 h, para evitar o risco de danificar as seções.
  40. Lugar a tábua sobre uma chapa quente por aproximadamente 10 min. pegue cada seção com uma vara de madeira e colocá-los em uma lâmina limpa. Manter a orientação de cada seção consistente usando um microscópio de dissecação. Coloque uma lamela sobre as seções. Coloque o slide no forno por 48 h a 56 ° C, para curar.

2. 3D reconstruções Neuronal

Nota: O software de Neurolucida é usado. Instruções fornecidas abaixo aplicam-se somente a um sistema de reconstrução de neurônio específico (Tabela de materiais). As seções obtidas a partir do corte são comparadas antes as reconstruções usando um microscópio.

  1. Colocar um slide no palco e prenda com grampo de palco e abrir o software de reconstrução do neurônio. Clique em Acquire guia e selecione a imagem ao vivo.
  2. Medir a espessura de cada seção usando 100 X lente objetiva de óleo. Tome nota do valor no z-medidor na parte superior e inferior de cada seção e calcular a espessura de corte como a diferença dos dois valores.
  3. Use um objectivo de baixa ampliação para focalizar a seção casa contendo o corpo da célula. Em seguida, use um objectivo de 100x, concentrar-se no corpo da célula e clique no centro para marcar o ponto de referência.
  4. Guia de rastreamento , selecione Gerenciador de seção do Serial. Em seguida, selecione Criar nova seção (+ ícone) na janela Gerenciador de seção do Serial . Digite o número de seções. Nomeie cada seção na ordem correta de Z e digite a espessura de corte medida no passo 2.2.
  5. Para localizar o soma em 3D usando 100 objectivo X, selecione a guia rastreamento contorno e selecione o contorno do corpo celular . Use o joystick para mover o foco para o topo do corpo celular. Coloque os pontos clicando ao redor do perímetro da parte que está atualmente em foco. Botão direito do mouse e selecione Contorno perto de terminar esse primeiro esboço. Repita este processo em posições diferentes z até a parte inferior do corpo celular é atingido (Figura 2).
    Nota: Selecione 3D Visualizar na guia rastreamento para visualizar o corpo celular em 3D.
  6. Para rastrear o corpo celular em 2D usando 100 objectivo X, selecione o corpo celular do menu no guia rastreamento de foco no meio do corpo celular de neurônio . Coloque os pontos clicando em torno do perímetro do corpo celular. Para completar o corpo celular, botão direito do mouse e selecione corpo de célula acabamento.
  7. Para rastrear o arbor dendrítica, selecione Dendrite ou Dendrito Apical no menu do neurônio . Primeiro trace um segmento curto, inicial para cada dendrito usando a roda de rolagem do mouse para ajustar o diâmetro do cursor para coincidir com o diâmetro do dendrito. Rastrear ao longo de cada dendrites usando o joystick para mover toda a seção e a roda de rolagem do mouse para ajustar o diâmetro do que o rastreamento.
  8. Verifique o alinhamento do que o rastreamento com a imagem ao microscópio e ajustar, se necessário, especialmente depois de se mudar usando o joystick. Na aba de rastreamento , selecione Alinhar a rastreamento, clique sobre o rastreamento e, em seguida, clique no local correto.
  9. Quando um nó na árvore é alcançado, botão direito do mouse e selecione o Nó Bifurcating ou Trifurcating de menu drop-down.
  10. Quando for atingido o final de um ramo, selecione um final menu drop-down no menu do neurônio . Selecione o tipo correto de término, i. e., alta final, final normal ou lai terminando para facilitar a correspondência entre as seções.
  11. Reduza a ampliação no microscópio, uma vez que todos os dendritos na seção atual tem sido traçados, selecione a guia Livre de Joy e mover para uma seção que corresponda imediatamente acima ou abaixo da seção concluída.
  12. Para identificar pontos de correspondência entre os dendritos em uma seção que corresponda a seção concluída, clique em mover e selecione os pontos de partida. Selecione o número de pontos necessários para ser correspondido (três ou mais pontos é o preferido) e pressione Okey. Clique sobre o final de um ramo concluído e, em seguida, clique sobre o ramo. Repita isto para cada ponto de partida. Repita este processo de ampliação de 100 X para garantir a correspondência exata.
  13. Adicione ramos correspondentes à seção anterior diretamente clicando no final. Selecione Adicionar ao final quando o ramo se alinha com o ramo rastreado concluído e o rastreamento como descrito anteriormente.
  14. Uma vez que todos os dendritos de cada seção tem sido traçados, rastrear usando o mesmo processo, selecionando menu neurônio axônio axônio.
  15. Vá para a seção de casa , re-alinhar a reconstrução com a imagem de microscópio ao vivo e selecione contornos na guia rastreamento selecione uma borda da região fronteiriça/contorno/camada pre-definida e clique em rastrear ao longo de um contorno. Selecione contorno aberto final. Rastrear todas as camadas desejadas e contornos da região.
  16. Use 3D Visualizar na guia rastreamento para visualizar as reconstruções em 3D.
  17. Para gravar vídeos de reconstruções 3D (Video 1), abrir a reconstrução 3D e abrir criar filmes. Definir um arquivo de destino e desejado a velocidade de rotação. Recomenda-se definir a rotação de 270°. Selecione iniciar a gravação, gravar por alguns segundos, clique em girar automaticamente. Selecione parar gravação quando necessário. Edite o vídeo com um vídeo que edita o software (Tabela de materiais).
  18. Para exportar os arquivos em arquivos Tiff ou JPEG, selecione arquivo | Exportação | Rastreamento de exportação como imagem. Escolha uma relação µm/pixel e selecione ajustar. Selecione uma cor de fundo e selecione o arquivo. O nome do arquivo, selecione Tiff ou JPEG e pressione salvar. Para exportar os arquivos em arquivos vetoriais, selecione arquivo | Exportação | Rastreamento de exportação como arquivos vetoriais.
  19. Use um software de análise de reconstrução de neurônio para realizar análises morfométricas.
    1. Para analisar as árvores dendríticas e obter uma dendrograma, abrir o arquivo no Neurolucida Explorer. Selecione analisar | Estrutura e selecione dendrograma de menu drop-down (Figura 3).
    2. Para executar uma análise morfométrica abrangente das reconstruções 3D (ramo complexidade, volumes de ramos e somas, área de superfície), abra o arquivo no software. Na guia Exibir , clique em selecionar tudo. Selecione a guia Analyze . Em seguida, selecione estrutura e Análise de estrutura de ramificação.

3. resolução de problemas

  1. Alterar as configurações da câmera. Para melhores resultados, definir o tempo de exposição para menos de 100 ms e ganhar e deslocamento mais próximo 0 quanto possível.
  2. Se o software de reconstrução de neurônio não exibe automaticamente os contornos rastreados como um corpo celular 3D em 3D Visualizar na guia rastreamento , selecione selecionar objetos na guia rastreamento , mantenha pressionada a tecla Ctrl no teclado e clique em todos os contornos desenhados, botão direito do mouse e selecione definir corpo celular no menu drop-down.
  3. Para ajustar os parâmetros-z de cada filial, selecione a árvore (selecionar objetos na guia rastreamento ) e definir o z-ajuste de todos os pontos através do menu do botão direito do mouse deixe cair para baixo. Selecione Modificar posição de z, então selecione Shift z valor e digite o valor desejado.
  4. Realinhe as reconstruções usando 'Ir para' na aba ' mover', quando é necessário mover uma distância grande sobre o traçado.
  5. Adicione nós adicionais a qualquer momento durante o processo de reconstrução. Selecione o ramo onde o nó é para ser colocado em (Selecionar objeto no guia de rastreamento e clique em ramo), botão direito do mouse e selecione Inserir o nó árvore selecionado. Clique sobre o local certo no ramo.
  6. Quando reconstruir um complexo neurônio, rastrear correspondência ramos individualmente e depois juntá-los para mais fácil identificação dos ramos. Rastrear os ramos na nova seção individualmente e em seguida, anexar estes ramos aos ramos correspondentes na seção anterior, pairando sobre o final do ramo para ser emendada, botão direito do mouse e selecione a Splicee, em seguida, pairando sobre o final que o ramo é ser emendada para e clique em.
  7. Se um ramo é traçado sob o tipo de árvore errada, selecionar a árvore, botão direito do mouse e selecione Alterar tipo de árvoree selecione o tipo correto de árvore.
  8. Se um ponto é colocado incorretamente, executar Ctrl + Zou clique no botão desfazer no menu Trace para remover o último ponto. No entanto, este procedimento não funcionará se o joystick é usado para mover-se em toda a seção antes de tentar remover um ponto. Neste caso, o ponto pode ser removido quando o ramo é finalizado. Selecione o ramo (pressione Select Object e clique sobre o ramo), passe o mouse sobre o ponto a ser removido, com o botão direito e selecione remove ponto.
  9. Se não tiver certeza que se dois ramos são combinados, ou 1) usar 3D Visualize na aba de rastreamento para verificar se os ramos correspondem no plano z, ou 2) usam no Gerenciador de seção do Serial Mostrar flanqueando o recurso para exibir as seções imediatamente acima e abaixo da seção atual em cinza.
  10. Se uma seção é invertida, vá para ferramentas , na guia rastreamento selecione Ajustar escala XY e mudança de eixo x-1. Selecione Z-encolhimento correto e mudar o eixo z-1. Então trace ramos como de costume. Lembre-se de reverter essas alterações quando se deslocam para uma seção que tinha a orientação original. Mudando para o x - e z - axis não mudarão o ramo terminando rótulos, então tome cuidado ao emendar que as terminações corretas estão sendo usadas.
  11. Z-encolhimento correta pode ser corrigido, se houver uma diferença significativa entre a seção cortada a espessura e a espessura montada medido. Na aba de rastreamento , selecione ferramentase, em seguida, corrigir Z-encolhimentoe digite o fator de encolhimento para o eixo z como uma representação decimal da espessura de corte dividida pela espessura montada.

Resultados

Neurônios no hipocampo CA2 estavam cheios de biocytin seguindo eletrofisiológicas gravações (figuras 1Ac, Ad e 1Bc, Bd). As fatias foram corrigidas durante a noite, após as gravações e a neuroquímica e caracterização morfológica de neurônios foram revelados seguindo o protocolo descrito aqui.

A proteína de ligação de cálcio ou teor de proteínas dos interneurônios preenchidos foi determinada por incubar as fatias primeiro com os anticorpos primários e, em seguida, com fluorescente etiquetados anticorpos secundários. As características de disparo dos interneurônios durante as gravações irão ditar a escolha de anticorpos primários usados. Avidina-AMCA foi usado para visualizar o interneurônio cheio de biocytin e isotiocianato de fluoresceína anti-rato (FITC) e de cabra anticoelho vermelho Texas (TR) foram usado para caracterizar a neuroquímica interneuronal (Figura 1Bb).

Após a visualização de fluorescência, utilizou-se um protocolo HRP para revelar o biocytin (Figura 1Ab). Bem anatomia detalhada do CA2 interneurônios então foi desenhada em 3D usando um software de reconstrução do neurônio (Figura 2 e Figura 3a). Um vídeo de uma reconstrução 3D de uma célula de cesta gravado e preenchido CA2 é exibido no vídeo. Neuronais reconstruções foram consideradas como concluída se ambos os mandris dendríticas e axonal foram confinados a profundidade da fatia 450-500 μm. Pobre arbor axonal coloração foi avaliada pela presença de ramos truncados com um final aberto no topo ou no fundo da fatia, ou por uma mancha que foi limitada para o segmento inicial do axônio e ramos muito proximais. A Figura 4 representa os exemplos de uma boa e uma má HRP coloração seguir biocytin visualização.

Análise morfométrica de reconstruções 3D (Figura 3) pode ser realizada para demonstrar a complexidade do ramo, área de superfície de soma e a área de superfície e volume dos mandris dendríticas e axonal.

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Figura 1 : Neuronais reconstruções de dois tipos de células de cesta gravado e preenchido na região CA2 hippocampal e correlacionaram eletrofisiológicos dados obtidos após as gravações intracelulares em vitro. Esta figura foi modificada em anteriores estudos23,24. Então Stratum Oriens, SP estrato Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM estrato Lacunosum Moleculare. (A) Aa: reconstrução de uma célula de cesta de CA2 com restrito da árvore dendrítica e axonal usando um tubo de desenho (1000 X). Os dendritos são em preto, e o axônio é em vermelho. AB: Imagem da célula de cesto cheio de biocytin, seguindo o protocolo de avidina-HRP descrito aqui. AC: Traço representativo de respostas tensão hiperpolarização e despolarizantes injeção atual de uma célula de cesta de CA2 com restrito da árvore dendrítica e axonal. Anúncio: Exemplo de uma pirâmide de CA2 para restringir ligações de celular cesta arbor gravado usando eletrodos afiados. Potencial pós-sináptico excitatório composto (EPSP) médias mostram trem breve depressão aparente durante respostas para trens de três pontas. (B) Ba: reconstrução 2D de uma célula de cesta de CA2 com mandris dendríticas e axonal larga usando um tubo de desenho (1000 X). A árvore dendrítica desta célula de cesta (em preto) estendida radialmente por meio de todas as camadas da região CA2 e horizontalmente em SO e SP das regiões CA2 e CA3. Um dendrito horizontal também atingiu a região CA1. O axônio (em vermelho) estendido às regiões CA3 e CA1. BB: A biocytin-cheia (AMCA coloração) célula cesta foi PV-immunopositive (coloração de FITC) e CB-immunonegative (coloração vermelho-Texas). BC: Traço representativo de respostas tensão hiperpolarização e despolarizantes injeção atual de uma célula de cesta de CA2 com largura dendrítica e axonal arbor. BD: Composto EPSP médias mostram breve trem facilitação aparente durante respostas para trens de três pontas. Exemplos de outros tipos de interneurônios gravados em CA2 podem ser encontrados em anteriores estudos25,30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

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Figura 2 : Reconstrução 3D corpo celular. (A) rastreamento 3D do corpo celular. Vista de contornos diferentes rastreados em posições diferentes z enquanto centrando-se através do corpo celular. (B) vista 3D de contornos diferentes. (C) vista 3D do corpo celular em um ângulo diferente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

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Figura 3 : Análises de morfometria das reconstruções 3D de neuronais. (A) reconstrução 3D de uma célula de cesta CA2 arbor estreitas. Cada ramificação dendrítica é representada por uma cor (verde, azul, vermelho e rosa) e axônio é em azul claro. (B) dendrograma da célula cesta que representa o número de ramificações dendríticas e o comprimento de cada segmento contido em esferas concêntricas com o soma e a 100 μm intervalos do soma. As cores sobre a dendrograma correspondem dos dendritos na. (C) exemplo de Análise morfométrica realizada em células piramidais de CA2 (adaptadas de um anterior estudo23). O número de ramificações dendríticas foi plotado contra a distância entre a soma das células piramidais CA2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

figure-results-4
Figura 4 : Exemplos de bom (A) e pobre (B) HRP coloração. (A) Biocytin recuperação revelou um interneurônio muito bem preenchido em CA2. O corpo celular (CB) é límpdo e tem contornos claros. Os dendritos são frisados e exibido algumas espinhas (representadas por estrelas vermelhas). A arbor axonal (A) é densa e apresenta pequenas boutons. (B) exemplo de um pobre dendrítica e axonal coloração de 2 células piramidais em CA2. A coloração de CB é fraca com nenhum esquema claro. Coloração pobre é frequentemente associada com gravações eletrofisiológicas mais curtas, resultando na presença de muito poucos ramos biocytin-cheia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Vídeo 1: Reconstrução neuronal 3D de uma célula de cesta de CA2 com arbor dendrítica restrita (também referida como célula de cesto estreito arbor CA2) com sua soma no estrato pyramidale, dendrites, abrangendo todas as camadas e axônio em CA2 estrato pyramidale e estrato adjacentes oriens e radiatum. Muito poucos ramos chegaram a proximal CA3 estrato oriens e CA3 estrato pyramidale. Esta célula foi preenchida com biocytin após gravações eletrofisiológicas e seções foram processadas com avidina-HRP seguindo o protocolo descrito aqui. Devido ao corte, apenas o axônio dentro da profundidade da fatia foi recuperado, embora os dendritos estão intactos. Dendritos são em rosa escuro e axônio em branco. Limites de camada e região foram adicionados no início do vídeo. Reconstrução 3D por Georgia Economides-3D de vídeo por Svenja Falk. O vídeo foi gravado com um software de reconstrução do neurônio, como indicado no passo 2.17 e editado com um software de edição de vídeo. Link para o vídeo:30. Clique aqui para baixar este vídeo.

Soluções utilizadasComposição/instruções
Solução de fixaçãoparaformaldeído 4%, 0,2% solução saturada de ácido pícrico, solução de glutaraldeído 0.025% em tampão de fosfato 0,1 M (PB)
0,1 M tampão fosfato pH 7,6Adicionar 100 mL de Buffer de 1 M de fosfato de estoque para 900 mL de água destilada
Tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4/7.5Adicionar 10 mL de tampão de fosfato 0,1 M, 0,2 g de KCl e 8,76 g de NaCl a 990 mL de água destilada
Tampão de pH TRIS 7.5Dissolva 5,72 g de cloridrato de Tris e 1,66 g de Tris Base em 50 mL de água destilada. Então faça até 1 L com água destilada.
Solução tamponada de fixador glutaraldeído e paraformaldeídoparaformaldeído 4%, 0,2% saturada, solução de ácido pícrico, solução de glutaraldeído 0.025% em tampão de fosfato 0,1 M.
Solução de ABCSolução a ser feita pelo menos 30 min antes do uso do kit de ABC. Adicione 1 gota da solução A e 1 gota de solução B a 2,5 mL de PBS.
Resina epóxi de Durcupan:Para fazer 20 potes: 20 g de um componente, 20 g de componente B, 0,6 g de componente C e 0,4 g de componente D -
Protege o equilíbrio dos derramamentos, cobrindo a placa com um círculo de papel de filtro. Pese cuidadosamente os reagentes para um copo de tripour nas proporções acima referido. Misture bem, agitando vigorosamente usando duas varas de madeira pelo menos 5 min. A mistura deve tornar-se uma cor marrom escura de densidade uniforme. Coloca o copo no forno a ~ 50 ° C por um período máximo de 10 min para remover todas as bolhas de ar possível. Nota: A resina vai começar a curar, se você deixa o béquer no forno mais 10 min. decantar a resina em potes de plástico ou seringas de 5ml, datá-los e guarde no congelador-20 ° C pronto para uso.

Tabela 1: Tabela de soluções. 

Discussão

Eletrofisiológicos gravações em vitro (Figura 1 Ac,d e A.c., d) combinado com histoquímico e imuno-histoquímica procedimentos permitem a morfologia detalhada, conteúdo de proteína de ligação de cálcio e identidade do adultos interneurônios corticais registrado para ser revelado. Na região de CA2, esta técnica permitiu o estudo do circuito local pela primeira vez e revelou as subclasses de interneurônios que não tinham sido descritas anteriormente em CA1 ou CA3: células de cesta da árvore dendrítica e axonal larga (figura 1B), células bistratified e interneurônios SP-SR.

O protocolo descrito aqui foi otimizado para preservar a ultraestrutura dos neurônios e obter excelente recuperação de mandris axonal e dendríticas (incluindo espinhos). Passos críticos inclui o uso da técnica dupla fixação para realçar o contraste para microscopia de luz26 e a adição da solução de glutaraldeído e ácido pícrico à solução fixador para aumentar a penetração do anticorpo e preservar o neuronal ultraestrutura27. Permeabilização de congelamento-descongelamento suave dá melhor preservação de estrutura fina, enquanto osmication e resina incorporação reduzem encolhimento do plano z28. Além disso, a visualização de muito belas estruturas (multa axônios com pequenas boutons, por exemplo) é melhorada incubando-se as seções com H2O2 e NaBH4 reduzir a coloração de fundo. Contraste também pode ser aumentada com a adição de NiCl2 para a reação de HRP.

O procedimento histológico detalhado aqui oferece excelentes resultados em termos de confiabilidade e reprodutibilidade. No entanto, a duração das gravações eletrofisiológicas irá determinar a qualidade da coloração, com gravações mais curtas, geralmente associadas com coloração axonal pobre biocytin/fluorescência. A escolha de gravação de protocolos (intracelulares gravações usando eletrodos afiados vs aperto de células inteiras remendo) também pode influenciar o biocytin retenção e preservação da anatomia bem.

Enquanto as dificuldades encontradas na preservação de estrutura fina durante o processamento histológico, descrito aqui e o tempo necessário para reconstruir a ampliação de 100 X (1-4weeks dependendo da complexidade do axônio) são apreciados, este método dá um Represtação precisa de diâmetros dendríticas e axonal. O uso de menos exigentes protocolos para revelar biocytin-rotulagem é compreensível, no entanto, estas muitas vezes impedem a visualização clara de galhos finos axonal. Detergentes, para promover a entrada de avidina-HRP para revelar o biocytin e anticorpos, são muitas vezes necessárias em seções grossas, mas podem atrapalhar a estrutura fina. Neurocientistas busca constantemente para métodos semi-automático de reconstrução, mas, para agora e para axônios especialmente, biocytin-HRP com reconstrução manual continua a ser o padrão-ouro de31.

Altamente detalhados reconstruções neuronais, especialmente desenhos precisos de boutons axonal e nós, a presença ou ausência de mielina e mais geralmente o desenho da arbor axonal completa, com a representação do axônio-diâmetro exato muda ao longo de sua comprimento, fornecer mais informações para a identificação precisa de um tipo distinto de interneurone. Embora muitos interneurônios podem não se encaixam exatamente uma classe específica, a técnica descrita acima fornece dados correlacionados em Propriedades eletrofisiológicas neuronais, a plasticidade a curto prazo, associado a um tipo específico de conexão e detalhadas reconstruções neuronais, permitindo que o diagrama de fiação, na região de CA2, por exemplo, para ser estudado em detalhe.

Estrutura fina, detalhada é frequentemente simplificada em modelos computacionais. Embora compreensível, isto resulta na perda da informação que poderia provar crítica no futuro. Análise das reconstruções 3D detalhadas com dados paralelos sinápticas permitirá a adição de novos critérios para a classificação interneuronal. Dados podem ser depositados em repositórios públicos e usados por modeladores para explorar o resultado de mudanças esporádicas no diâmetro do axônio e mielinização na propagação do potencial de ação computacionalmente.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa recebeu financiamento da Novartis Pharma (Basel) e o Conselho de pesquisa médica, atribuído a Prof Alex Thomson, a biotecnologia e biológicas Ciências do Conselho de pesquisa (BBSRC-BB/G008639/1), a sociedade Physiological, União Europeia Horizonte de 2020 programa-quadro de investigação e inovação sob o subsídio específico acordo n. º 720270 (cérebro humano projeto SGA1) e sob o acordo específico Grant n º 785907 (cérebro humano projeto SGA2). Somos extremamente gratos ao Prof Alex Thomson para configurar o protocolo em outras regiões corticais, financiamento e o seu contínuo apoio para este projeto. Contribuições feitas pelo laboratório-Membros, que ajudou a optimização do protocolo de recuperação e reconstruíram CA2 neurônios são reconhecidas com gratidão: Deuchars J. H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo Avidin-7-amino-4-metilcumarina-3-ácido acético (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/mL Vector laboratoriesA2008
Biocytin  ≥ 98% (TLC)SigmaB4261
3,5 comprimido de diaminobenzidina (DAB), Para preparar 5 mLSigmaD4293
Resina epóxi Durcupan ASigma44611
Resina epóxi Durcupan BSigma44612
Resina epóxi Durcupan CSigma44613
Resina epóxi Durcupan DSigma44614
Etanol, puriss. p.a., absoluto, ≥ 99,8%Sigma32221
GelatinaSigma48723
Solução de glutaraldeído, grau I, 25% em H2OSigmaG5882
Glicerol, ≥ 99% SigmaG5516
Soro de cabraSigmaG9023
Isotiocianato de fluoresceína anti-camundongo de cabra (FITC) - 14,3 mg / mLSigmaF2653
Cabra anti-coelho Texas Red (TR) - 3,3 mg / mLInvitrogenT2767
Peróxido de hidrogênio, solução a 30%SigmaH-1009
Óleo de imersão, viscosidade 1,250 cSt (lit.)SigmaI0890
Cloreto de níquel (NiCl2 . 6H2O)Sigma N5756
Tetróxido de ósmio, para microscopia eletrônica, 4% em H2O Sigma75632
Paraformaldeído, grau reagente, cristalino SigmaP6148
Ácido pícrico, umedecido com água, ≥ Tampão de fosfato 98%Sigma197378
1 MSigmaP3619
Óxido de propileno (C3H6O), 99%Alfa Aesar 30765
Tetrahidroborato de sódioVWR27885.134
SacaroseFisher scientificS/8600/53
Cloridrato de Trizma, ≥ 99.0%SigmaT5941
Base Trizma, ≥ 99.9%SigmaT6066
Vectashield Antifade Montagem Média, , índice de refração 1.45 Vector laboratoriesH-1000
Vectastain Elite ABC HRP kitVector laboratoriesPK6100
Equipamento usado 
VibratomeAgar Scientific
C4A Pranchetas de alumínio em forma de concha GA-MA & ASSOCIADOS, INC.
Microscópio Leica DMR Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  fonte de luz de fluorescênciaExcelitas Technologies 
Câmera de microscópio digital Leica DFC450Leica Microsystems 
Caneta de desenho técnico Rapidograph 0.18mm gráfico de Londres
0.18 mm pontade Londres Centro de gráficos
de Londres Caneta de desenho técnico de rapidógrafo 0.25mm gráfico de Londres
0,25 mmgráfico
Sistema Neurolucida incluindo estação de trabalho para PC, palco, câmera e joystic para controle de palco XYZMicrobrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida software versão 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW graphics Suite X5Corel
Software de edição de vídeo Adobe Premiere Pro
14 mLFisher scientific 
Centro de gráfico Centro ponta rápida de Centro de LondresFrascos de vidro

Referências

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