Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

Resumo

Apresentamos um protocolo para avaliar os níveis de expressão de microRNA (miRNAs) em circulação em amostras de plasma de pacientes com câncer. Em particular, usamos um kit comercialmente disponível para circulação miRNA extração e transcrição reversa. Finalmente, analisamos um painel de 24 miRNAs selecionados usando placas personalizadas em tempo real sonda pre-manchado.

Resumo

Existe uma crescente interesse na biópsia líquida para câncer diagnóstico, prognóstico e monitorização terapêutica, criando a necessidade de biomarcadores confiáveis e úteis para a prática clínica. Aqui, apresentamos um protocolo para extrair, reverso transcrever e avaliar os níveis de expressão de miRNAs de amostras de plasma de pacientes com câncer colorretal (CRC) em circulação. microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNA não-codificante de 18-25 nucleotides no comprimento que regulam a expressão de genes-alvo a nível translacional e desempenham um papel importante, incluindo o da função de pro - e antiangiogênico, na fisiopatologia da vários órgãos. os miRNAs são estáveis em fluidos biológicos, tais como soro e plasma, que processa-los ideal circulando biomarcadores para tomada de decisão diagnóstico, prognóstico e tratamento do câncer e monitoramento. Extração de miRNA de circulação foi realizada usando um método rápido e eficaz que envolve metodologias orgânicas e baseados em colunas. Para miRNA retrotranscription, foi utilizado um processo de várias etapa que considera poliadenilação 3' e a ligadura de um adaptador em 5' dos miRNAs maduros, seguidos de Pre-amplificação aleatória miRNA. Selecionamos um painel personalizado 24-miRNA para ser testado por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) e avistou as sondas de miRNA em placas personalizadas de matriz. Realizamos qRT-PCR placa é executado em um sistema de PCR em tempo real. Os miRNAs limpeza para normalização foram selecionados usando o software GeNorm (v. 3.2). Os dados foram analisados utilizando o software suite de expressão (v 1.1) e análises estatísticas foram realizadas. O método mostrou-se tecnicamente robusto e confiável e pode ser útil para avaliar os níveis de biomarcador em amostras líquidas, tais como o plasma ou soro.

Introdução

CRC representa o terceiro mais frequentemente diagnosticado malignidade e a quarta causa de morte relacionada com câncer em todo o mundo. Até à data, bevacizumab (B), um anticorpo monoclonal dirigido contra o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e cetuximab (C) ou panitumumab (P), anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), foram aprovados para tratamento de primeira linha, em combinação com regimes de quimioterapia (CT).

Mutações nos genes K-RAS e N-RAS são os biomarcadores clinicamente útil única capazes de identificar os pacientes que são menos susceptíveis de....

Protocolo

Nota: Execute todas as etapas seguintes sob uma coifa esterilizados de acordo com boas práticas de laboratório (BPL).

1. armazenamento e coleta de plasma

1. Colete 3 mL de amostra de sangue periférico em um tubo de EDTA K3E.
2. Centrifugar o tubo à temperatura ambiente a 1.880 x g durante 15 min.
3. Recupere o plasma sobrenadante em alíquotas de 450 µ l.
4. Armazene as amostras a-80 ° C até o uso.
   Nota: Processo de tubo até 2 horas após a coleta de sangue periférico. Quando recuperar o plasma do tubo, não perturbe a camada de linfócitos.

Resultados

Analisou-se um painel de angiogênese relacionados miRNAs circulantes em relação a sobrevivência livre de progressão (PFS), global sobrevivência (OS) e objetiva resposta taxa (ORR) em um mCRC 52 pacientes tratados com tomografia baseada em B. A avaliação de tais biomarcadores em amostras de plasma é um desafio, devido a dificuldades técnicas. Utilizamos métodos estabelecidos para miRNA extração de amostras de plasma do paciente, transcrição reversa e pré-amplificação. Seguindo as instruçõe.......

Discussão

os miRNAs são pequenos RNAs (18-25 nucleotides no comprimento) capazes de ligação 3' UTR região do alvo do RNA mensageiro e inibindo e/ou degradante, não-codificante. Assim, podem ser considerados reguladores de expressão do gene no nível de translação. Na última década, vários miRNAs tem sido correlacionados com câncer iniciação e desenvolvimento, tornando-os úteis biomarcadores clínicos para diagnóstico, prognóstico e terapia. Protegido por RNases, miRNAs estão presentes em uma forma estável em fluidos biológicos como .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de 1,5 mL sem Rnase Safe-lock	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock Tubos de 2 mL	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µ Pontas L	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µ Pontas L	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µ Pontas L	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA e Kit de Purificação de Proteínas Nativas	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Kit Avançado de Síntese de cDNA de miRNA	Thermo Fisher	A28007
100% etanol anidroso ACS grau Carlo	Erba Reagentes	414605
2-mercapto-etanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Sistema de PCR em Tempo Real	Aplicado Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µ Pipetas
Microcentrífuga
Vortex
Bloco
Capela-vapor
			PCR de 0,2 mL