Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma

Resumo

Aqui, apresentamos metodologias para avaliar a integridade de membrana spermatozoan, uma celular característica associada com a competência de fertilização do espermatozoide. Nós descrevemos três técnicas para a avaliação de fluorimétrica de membranas de esperma: coloração simultânea com sondas fluorescentes específicas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma. Também são apresentados exemplos de combinar as metodologias.

Resumo

Spermiograms padrão, descrevendo a qualidade do esperma baseiam-se principalmente os parâmetros fisiológicos e visuais, tais como o volume de ejaculação e concentração, motilidade e motilidade progressiva e morfologia do esperma e viabilidade. No entanto, nenhuma destas avaliações é bom o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Dado que a manutenção da viabilidade do esperma e fertilização potencial depende da integridade de membrana e funcionalidade intracelular, avaliação desses parâmetros poderá permitir uma melhor previsão de competência de fertilização do espermatozoide. Aqui, descrevemos três métodos viáveis para avaliar a qualidade do esperma utilizando sondas fluorescentes específicas, combinadas com análises de citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. Análises avaliaram integridade de membrana plasmática usando 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e iodeto de propidium (PI), integridade da membrana acrossomal usando conjugada com isotiocianato de fluoresceína aglutininas Pisum sativum (FITC-PSA) e integridade de membrana mitocondrial usando 5, 5', 6, 6-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1). Combinações destes métodos também são apresentadas. Por exemplo, uso de anexina V combinado com ativa de fluorochromes PI avaliar apoptose e calcular a proporção de espermatozoides apoptotic (índice apoptótico). Acreditamos que essas metodologias, que são baseadas em examinar as membranas do espermatozoide, são muito úteis para a avaliação da qualidade do esperma.

Introdução

Integridade e funcionalidade de membranas de esperma são alguns dos fatores indicando a viabilidade do esperma e fertilização potencial. A membrana plasmática funciona como uma barreira entre os compartimentos intracelulares e extracelulares, mantendo assim o equilíbrio osmótico celular¹. Qualquer estresse que induz os danos para a integridade da membrana plasmática pode prejudicar a homeostase, reduzir a capacidade de viabilidade e fertilização e aumentar a morte celular. Por exemplo, criopreservação reduz viabilidade de esperma devido a danos a sua membrana plasmática, como resultado de mudanças de temperatura e estresse osmótico

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações de 1994 israelense para o bem-estar animal. Esperma de bovina foi fornecida pela empresa israelense comercial para inseminação artificial e reprodução. Ejacula de 11 touros foram avaliadas neste estudo.

1. preparação da amostra esperma

Nota: O procedimento baseia-se protocolo^{1,3 no laboratório Roth}.

1. Obter cerca de 1 – 6 mL de sêmen de touro em um tubo de 15 mL à temperatura ambiente.
2. Para cada 1 mL de sémen, adicionar 6 mL de tampão NKM escaldada....

Resultados

A Figura 1 mostra simultânea fluorimétrica avaliação das membranas de esperma (plasma, acrossomal e mitocondrial) usando PI, DAPI, FITC-PSA e JC-1. Avaliação das membranas de esperma usando coloração simultânea com quatro sondas fluorescentes, por exemplo, permite avaliar a proporção de espermatozoides em cada categoria — live vs mortos; alta vs baixa ΔΨm; intacta vs. danificado o acrossoma — simultaneamente para cada espermatozoide.......

Discussão

Fecundação do esperma potencial depende de múltiplos fatores, refletindo sua qualidade. Uma alta concentração de espermatozoides e uma elevada proporção de espermatozoides móveis altamente progressivamente podem ser considerados o sêmen de alta qualidade. No entanto, essa avaliação não leva em conta outros parâmetros celulares e funcionais. O uso de 'bancada' conta citômetro de fluxo pode ser facilmente adaptado para avaliação de várias estruturas de esperma utilizando sondas fluorescentes, como mostrado anteriormente po.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
MOPS [ácido propanossulfônico 3-N-morfilino]	Sigma	M1254
PBS	Sigma	P5493
DMSO	Sigma	D2438
Etanol absoluto	Sigma	64-17-5
Hemacitômetro	Neubauer Alemanha		hemocitômetro
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo)	Sonda fluorescente	Sigma	D9542
PI (iodeto de propídio)	Sonda fluorescente	Sigma	P4170
FITC-PSA (aglutinina Pisum sativum conjugada com isotiocianato de fluoresceína)	Sonda
fluorescente Sigma L0770JC-1 (iodeto de 5,5',6,6'-tetra-cloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil carbocianina)	ENZOBiochem, Nova York, NY, EUA	sonda fluorescente	ENZ52304
Anexina V conjugada a FITC	Sonda fluorescente	Miltenyi Biotec	130-093-060
Tampão de ligação de anexina V 20x solução estoque	MACS, Miltenyi Biotec	130-092-820	tampão
Nikon Eclipse, TE-2000-u	Nikon, Tóquio, Japão		microscópio de fluorescência invertida
Nis Elements	Nikon, Tóquio, Japão		software
Nikon DXM1200F	Nikon, Tóquio, Japão		câmera digital
Guava EasyCyte Plus	IMV Technologies, L'Aigle, França		citômetro de fluxo de esperma microcapilar
CytoSoft	Guava Technologies Inc., Hayward, CA, EUA; distribuído pelo software IMV Technologies
Solução tamponada para citometria	IMV Technologies, L'Aigle, França	Tampão 023862
Kit de viabilidade e concentração	IMV Technologies, L'Aigle, França	024708	para avaliação de viabilidade
Kit de atividade mitocondrial	IMV Technologies, L'Aigle, França		Kit 024864 para atividade mitocondrial avaliação
Kit de viabilidade e integridade acrossômica	IMV Technologies, L'Aigle, França	de 025293	para avaliação da integridade acrossômica
JMP-13	SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, EUA		software
Esperma bovino	"SION", empresa israelense para inseminação artificial e drenagem, Hafetz-Haim, Israel

MACS, Kit Kit