Este artigo fornece um método eficiente e viável para a construção de várias camadas de células estaminais folhas com propriedade de célula-tronco favorável.
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Artigo de método
Construção de uma folha de células-tronco mesenquimais em várias camadas com um sistema de cultura dinâmica 3D
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Terapia de células-tronco mostra um promissor futuro em regenerar órgãos feridos e tecidos, e a técnica de folha célula foi desenvolvida para melhorar a retenção de cela baixa e pobre sobrevivência dentro da zona alvo. No entanto, durante o processo construção in vitro , uma solução para a manutenção de células-tronco Bioatividade e aumentando a quantidade de células dentro da camada de células é urgentemente necessária. Aqui, este protocolo apresenta um método para a construção de uma folha de várias camadas de células com bioatividade de células-tronco favorável e operabilidade ideal. Decellularized Pericárdio Porcino (DPP) é preparado pela fosfolipase um método de decellularization2 (PLA2) como o andaime de folha de célula, e rato medula células-tronco mesenquimais (BMSCs) são isoladas e expandiu-se como as células semeadas. O organelo várias camadas folha temporária é construído usando RAD16-eu hidrogel de peptídeo. Finalmente, a camada de células é cultivada com um sistema dinâmico de perfusão para estabilizar a estrutura tridimensional (3D), e a camada de células poderia ser obtida após uma cultura de 48 horas em vitro. Este protocolo fornece um método eficiente e viável para a construção de uma folha de células-tronco em várias camadas, e a camada de células poderia ser desenvolvida como um produto de terapia de células-tronco favorável no futuro.
Introdução
Terapia de células-tronco tem sido relatada como um tratamento eficaz para muitas doenças; no entanto, a célula baixa retenção e sobrevivência pobre dentro da zona alvo permanecem questões críticas depois da injeção de células-tronco tradicional. Para resolver esse problema, cientistas engenharia de tecido desenvolveram a técnica de folha de célula. Uma folha de monolayered células com matriz extracelular intacta em primeiro lugar foi preparada usando o prato de cultura de temperatura-resposta1, e seus estudos de seguimento relataram as melhorias significativas da retenção de células-tronco e sobrevivência dentro o enfartado área
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Protocolo
Todas as células-tronco e experimento animal procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do guia nacional para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê de uso (Guangzhou, China) e cuidado de Animal de Universidade de Jinan.
1. preparação do cadafalso DPP com o PLA2 Decellularization método14
Nota: Ver figura 1A para um esquema do método PLA2 decellularization.
- Prepare 100 mL de solução de2 200 U/mL PLA. Adicione 0,5 g de Deoxycholate do sódio e 2 mL de PLA2 e....
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Resultados
O esquema da construção folha várias camadas de células estaminais é mostrado na Figura 1. Preparar o andaime de folha célula pelo método de decellularization PLA2 é o primeiro passo. Com base no cadafalso, uma estrutura temporária celular 3D é construída misturando as células-tronco com o hidrogel de peptídeo RAD16-1. A fim de obter uma folha de várias camadas de células com bioatividade de células-tronco favorável e ótima resistência mecânica, a .......
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Discussão
O presente protocolo relata um método eficiente para a construção de uma folha MSC em várias camadas. Esta folha de célula apresenta ótima resistência mecânica e densidade de semeadura de pilha alta Bioatividade favorável células-tronco. Usando BMSCs como exemplo, a estrutura celular 3D rapidamente é construída com RAD16-eu hidrogel de peptídeo. Depois a ser cultivada no sistema de perfusão dinâmico, folha de várias camada BMSC é obtida com êxito e os BMSCs mantêm uma alta expressão de marcadores de células estaminais.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (número de concessão 31771064); a ciência e a tecnologia planejamento projeto da província de Guangdong (concessão números 2013B010404030, 2014A010105029 e 2016A020214012); a ciência e a tecnologia planejamento projeto de Guangzhou (número de concessão 201607010063); e a inovação de graduação e programa de formação de empreendedorismo (número de concessão 201610559028); a National Science Foundation para jovens cientistas da China (conceder número 31800819).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fosfolipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Desoxicolato de sódio | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Tampão fosfato | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicilina estreptomicina / anfotericina | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonato | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Concentrador de mesa | Changzhou Aohua Instrument Co. | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| Soro fetal bovino sul-americano | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamina | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Tripsina/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Armário de Biossegurança | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Incubadora de temperatura constante | CLS-170B-8 | da Esco,Singapore | |
| Corning | 430790 | ||
| EP tubo | Axygen | 31617934 | |
| Máquina centrífuga | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Sistema de cultura de perfusão dinâmica | Minucells e Minutissue | D-93077 | |
| Bomba peristáltica | Ismatec | IPC N8 | |
| Tubulação da bomba | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | ||
| Sistema de perfusão dinâmica | MINUSHEET | Regensburg | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | ||
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | garrafa de vidro de 500 mL | |
| MINUSHEET 1301 | recipiente para cultura de perfusão |
Referências
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al.
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Reimpressões e permissões
