Construção de uma folha de células-tronco mesenquimais em várias camadas com um sistema de cultura dinâmica 3D

Summary

Este artigo fornece um método eficiente e viável para a construção de várias camadas de células estaminais folhas com propriedade de célula-tronco favorável.

Abstract

Terapia de células-tronco mostra um promissor futuro em regenerar órgãos feridos e tecidos, e a técnica de folha célula foi desenvolvida para melhorar a retenção de cela baixa e pobre sobrevivência dentro da zona alvo. No entanto, durante o processo construção in vitro , uma solução para a manutenção de células-tronco Bioatividade e aumentando a quantidade de células dentro da camada de células é urgentemente necessária. Aqui, este protocolo apresenta um método para a construção de uma folha de várias camadas de células com bioatividade de células-tronco favorável e operabilidade ideal. Decellularized Pericárdio Porcino (DPP) é preparado pela fosfolipase um método de decellularization₂ (PLA₂) como o andaime de folha de célula, e rato medula células-tronco mesenquimais (BMSCs) são isoladas e expandiu-se como as células semeadas. O organelo várias camadas folha temporária é construído usando RAD16-eu hidrogel de peptídeo. Finalmente, a camada de células é cultivada com um sistema dinâmico de perfusão para estabilizar a estrutura tridimensional (3D), e a camada de células poderia ser obtida após uma cultura de 48 horas em vitro. Este protocolo fornece um método eficiente e viável para a construção de uma folha de células-tronco em várias camadas, e a camada de células poderia ser desenvolvida como um produto de terapia de células-tronco favorável no futuro.

Introduction

Terapia de células-tronco tem sido relatada como um tratamento eficaz para muitas doenças; no entanto, a célula baixa retenção e sobrevivência pobre dentro da zona alvo permanecem questões críticas depois da injeção de células-tronco tradicional. Para resolver esse problema, cientistas engenharia de tecido desenvolveram a técnica de folha de célula. Uma folha de monolayered células com matriz extracelular intacta em primeiro lugar foi preparada usando o prato de cultura de temperatura-resposta¹, e seus estudos de seguimento relataram as melhorias significativas da retenção de células-tronco e sobrevivência dentro o enfartado área^2,3. Entre os métodos, a construção de camada de células em várias camadas tem sido relatado como uma estratégia eficaz para melhorar a sobrevivência da célula e a célula folha efeito terapêutico^3,4. Desde então, cientistas têm trabalhado no desenvolvimento de métodos de construção de folha de célula diferente a fim de aumentar a quantidade de células, células-tronco Propriedade e propriedade mecânica das folhas de célula. Até agora, foram construídos e estudados no tratamento de infarto do miocárdio⁵, lesão de cartilagem⁶, certos tipos de folha de célula e pele ferida⁷.

A bioatividade de células-tronco antes do transplante mostrou uma influência emergente na regeneração do tecido lesado, e estratégias de construção de folha de célula diferentes têm efeitos diferentes sobre as células-tronco. Por um lado, folhas de célula confluente consistiam apenas de células-tronco de alta densidade, e matrizes extracelulares naturais poderiam ser adquiridas por empilhamento de folhas de célula monolayered⁸ ou por meio de técnicas engenharia de tecido magnético⁹. Por outro lado, os pesquisadores desenvolveram diferentes andaimes para fornecer resistência mecânica adequada e apoio celular crescimento^10,11,12, que permitiu uma célula-tronco baixa densidade para garantir a nutrição de semeadura abastecimento. No entanto, apesar dessas abordagens, o fornecimento de baixa nutrição eficiente dentro da estrutura da folha em várias camadas de células continua a ser uma grande preocupação durante a construção em vitro . Portanto, um sistema de construção de folha célula eficiente e viável é urgentemente necessário.

Este protocolo descreve as etapas para preparar uma camada de células multilayeredmesenchymal células-tronco (MSC). Neste sistema de construção, a resistência mecânica de folha de célula é fornecida por um DPP. Baseia este andaime, a estrutura celular 3D pode ser rapidamente construída com RAD16-eu hidrogel peptídeo e um sistema dinâmico de perfusão é usado para cultura folha de várias camadas de células, a fim de estabilizar a estrutura da folha célula 3D e fornecer nutrição suficiente fornecimento para as células. Usando este sistema, uma folha BMSC várias camada com êxito foi preparada e exibiu um efeito terapêutico ideal no rato do miocárdio modelo¹³.

Protocol

Todas as células-tronco e experimento animal procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do guia nacional para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê de uso (Guangzhou, China) e cuidado de Animal de Universidade de Jinan.

1. preparação do cadafalso DPP com o PLA₂ Decellularization método¹⁴

Nota: Ver figura 1A para um esquema do método PLA₂ decellularization.

1. Prepare 100 mL de solução de₂ 200 U/mL PLA. Adicione 0,5 g de Deoxycholate do sódio e 2 mL de PLA₂ em 198 mL de solução tampão de carbonato. Esta solução deve ser usada dentro de 24 h após sua preparação.
2. Obter o pericárdio porcino fresco (FPP) do matadouro e retornar ao laboratório dentro de 1 h.
   Nota: O FPP deve ser armazenado a 4 ° C, durante o transporte. Etapas 1.2-1.10 devem ser conduzidas com agitação contínua em um banho de água controlado por termostato.
3. Lave cuidadosamente o FPP com 200 mL de tampão fosfato (PBS) contendo 1% penicilina-estreptomicina em um copo de 500 mL em 10 min. ° Cfor 10 Repita este passo 2x.
4. Dividir o FPP em duas camadas e remover o tecido adiposo com pinças e tesouras.
   Nota: Mantenha o FPP molhado, adicionando 50 mL de PBS cada 20min durante a remoção do tecido adiposo.
5. Moldar o FPP em pedaços de² 10 x 10 cm com uma tesoura. Lave o FPP com 200 mL de solução tampão de carbonato (CBS), que contém 1% penicilina-estreptomicina em um copo de 500 mL a 10 ° C por 10 min. Repita este passo 2x.
6. Transferir o FPP para água pura e mergulhe-a 10° C, durante 12 h.
7. Mergulhe as amostras de² 10 x 10 cm em 50 mL de CBS contendo 200 U/mL PLA₂ e solução de 0,5% (p/v) de sódio deoxycholate a 37 ° C, durante 6 h.
8. Lave as amostras com CBS contendo 1% penicilina-estreptomicina a 10 ° C durante 10 min. Repita este passo 2x.
9. Mergulhe cada amostra em 50 mL de CBS contendo 200 U/mL PLA₂ e solução de 0,5% (p/v) de sódio deoxycholate a 37 ° C por 2 h.
10. Lave as amostras com CBS contendo 1% penicilina-estreptomicina a 10 ° C, durante 2 h. Repita esta etapa para x 10 pelo menos. Colocar as amostras em placas planas e secá-las até peso constante em um forno de temperatura constante, a 55 ° C.
    Nota: A amostra precisa estar completamente seca. Pesar a amostra DPP cada 10min e repetir isso 3 x ou até o peso já não muda.
11. Forma cada amostra DPP em um círculo de 10,5 mm de diâmetro com uma trefina. Embale cada DPP em um saco lacrado estéril.
12. Esterilize as amostras DPP por irradiação gama (25 kGy). Armazenadas as amostras DPP a 4 ° C antes do uso.
    Nota: Todas as amostras podem ser armazenadas por até seis meses a 4 ° C.

2. os preparativos para a célula da folha construção

1. Autoclave todos os instrumentos e componentes de tecido portador a 121 ° C por 30 min, incluindo tubos de centrífuga de 1,5 mL, fórceps, com dentes pinça, tesoura, preto bases (componente do portador de tecido) e anéis de tensão branco (componente do portador de tecido).
2. Prepare-se 20 mL da solução de sacarose 10% livre de germes. Peso 2 g de sacarose e dissolver a sacarose em 18 mL de água ultrapura. Autoclave a 121 ° C por 30 min ou filtrar a solução com um filtro de 0,22 µm a solução de 10% de sacarose.
3. Autoclave os dispositivos de sistema dinâmico de perfusão a 121 ° C por 30 min, incluindo um gás trocam de equipamento, uma garrafa de vidro de 500 mL, um recipiente de cultura de perfusão e os tubos de conjuntivo.
4. Prepare os instrumentos esterilizados e tecidos componentes do portador. Coloque a parte preta de base da transportadora tecido em um prato de cultura.
5. Pegar um andaime DPP secado e colocá-lo no centro da base preta. Colocar um anel branco tensão no cadafalso DPP e fixá-lo à transportadora de tecido.
   Nota: Certifique-se o andaime é totalmente fixo no portador de tecido e não há nenhuma diferença entre a base preta e o anel de tensão branco. Se não, separar o portador de tecido e corrigi o andaime novamente.
6. Adicione 100 µ l de meio de cultura no cadafalso DPP para reidratação.
   Nota: Se o andaime não é fixa bem no portador de tecido, meio de cultura vai se infiltrar o prato de cultura.
7. Colocar o andaime em uma incubadora de 37 ° C e deixe de molho por 15 min.

3. preparação das células para a construção de folha de célula

Nota: Este protocolo é para cultura de células, usando um prato de 100 mm. Ver figura 1B para um esquema de construção da estrutura de várias camadas de células.

1. Isole o BMSCs¹³.
   Nota: Este método destina-se para a construção de uma camada de células MSC em várias camadas. BMSCs rato são utilizados no presente protocolo. Os BMSCs são isolados usando o método aderente toda medula óssea, e os BMSCs são expandidos em vitro para obter suficiente quantidade de célula.
   1. Autoclave os instrumentos a 121 ° C por 30 min, incluindo fórceps fórceps dentado e tesoura. Prepare uma seringa de injeção de 2 mL e meio de cultura BMSC (Dulbecco modificado da águia médio [DMEM], 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina-estreptomicina).
   2. Eutanásia em ratos Sprague-Dawley (SD) do macho três semanas pela luxação de vértebra cervical. Mergulhe o animal em 100 mL de solução de álcool 75% num copo por 5 min.
   3. Tire o copo do animal e colocá-lo inclinado sobre a mesa de operação. Faça uma incisão na pele na parte de trás do animal com tesoura e pinça. Isole os tecidos da pele e músculo para expor os fêmures de coxa.
   4. Isolar os fêmures de coxa e colocá-lo em 30 mL de PBS em um tubo de centrífuga de 50 mL. Coloque dois fêmures de coxa em um tubo. Tubo de centrífuga para lave o tecido de vórtice. Repita este passo 2x.
   5. Corte as duas extremidades dos fêmures com uma tesoura e expor a cavidade da medula.
   6. Aspire 2 mL do meio de cultura BMSC com uma seringa de injeção. Introduza a agulha na cavidade da medula e expulsar da medula óssea com meio de cultura. Expulsar todos os fêmures duas coxas em um prato de cultura de 100 mm.
   7. Para cada prato de cultura de 100mm, adicione 2 mL de meio de cultura a placa de cultura. Colocar o prato de cultura a incubadora 37 ° C e a cultura estática para 72 h.
   8. Retire o prato de cultura da incubadora. Substitua o sobrenadante com 6 mL de meio de cultura fresco.
   9. Observe a BMSCs primárias sob um microscópio. Em seguida, passagem as BMSCs d cada 5-7.
2. Leve as células fora da incubadora. Observar as células sob um microscópio e escolha células adequadas para construção de folha de célula. Quando os BMSCs chegarem a confluência de 80-90%, as células podem ser escolhidas como as células semeadas.
3. Retire o prato de cultura, o meio de cultura. Lave delicadamente as células com 2 mL de PBS quente. Remova todos os PBS o prato de cultura e fazer restos de certeza não líquidos. Adicionar 2 mL de tripsina 0,25% (ou outra solução dissociating) ao prato e incubar a 37 ° C por 3 min.
4. Parar o efeito de tripsina, adicionando 2 mL de meio de cultura e lave delicadamente as células do prato. Transferi a suspensão de células para um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugate as células a 225 x g por 5 min.
5. Remova o sobrenadante. Ressuspender as células com 3 mL de solução de sacarose 10% (p/v).
   Nota: a solução de sacarose 10% (p/v) é usada para lavar as células a fim de obter uma mistura uniforme de célula-hidrogel nas etapas a seguir.
6. Aspirar 10 µ l da suspensão celular e contar o número de células com um hemocytometer. Calcule o volume necessário para o próximo passo. Para a folha de uma célula, são utilizados 3 milhões BMSCs.
7. Extrato de 3 milhões de células e transferi-los para um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar as células a 225 x g por 5 min.
8. Remova o sobrenadante. Ressuspender as células com 1 mL de solução de sacarose 10% (p/v). Transferi a suspensão de células para um tubo de centrifugação de 1,5 mL.
   Nota: Usar um tubo de centrífuga de 1,5 mL é benéfico para preparar a mistura de célula-hidrogel.
9. Centrifugar as células a 260 xg por 5 min. completamente remover o sobrenadante e obter o sedimento da célula.

4. preparação dos BMSCs e o RAD16-eu peptídeo Hydrogel mistura

Nota: Ver figura 1B para um esquema de construção da estrutura de várias camadas de células.

1. Adicione 20 µ l de solução de sacarose 10% (p/v) no tubo de centrífuga de 1,5 mL. Delicadamente Resuspenda os BMSCs e obter uma suspensão uniforme.
   Nota: Não geram quaisquer bolhas durante a ressuspensão.
2. Adicionar 20 µ l de RAD16-eu peptídeo hidrogel na parte superior da suspensão. Misture delicadamente o RAD16-eu suspensão do peptide e celular com a ponta da pipeta. A suspensão de células e hidrogel são misturados, delicadamente Pipete a mistura algumas vezes.
3. Pegue o andaime DPP do compartimento de tecido e aspire suavemente o meio de cultura com uma ponta da pipeta.
   Nota: Certifique-se que o cadafalso DPP é totalmente reidratado antes de adicionar a mistura de célula-hidrogel.
4. Aspirar a mistura e adicioná-lo uniformemente para o cadafalso DPP.
   Nota: O volume total da mistura seria sobre 40-50 µ l. Recomenda-se adicionar a mistura 10 µ l de cada vez do centro para o exterior do cadafalso.
5. Adicione 1 mL de meio de cultura para o fundo da transportadora tecido. Colocar a folha de célula na incubadora 37 ° C por 5 min.
6. Retire a camada de células da incubadora. Delicadamente, adicione 4 mL de meio de cultura a placa de cultura e mergulhe a camada de células. Colocar a folha de célula na incubadora 37 ° C por 2 h de cultura estática.

5. cultura in Vitro de uma folha de célula de várias camadas 3D usando um sistema dinâmico de cultura

Nota: Consulte a Figura 1 para um diagrama esquemático do sistema dinâmico 3D.

1. Prepare o sistema de perfusão dinâmico, incluindo uma bomba peristáltica, equipamento de troca de gás, uma garrafa de vidro de 500 mL, um recipiente de cultura de perfusão e os tubos de conjuntivo. Monte o sistema de perfusão dinâmico, como mostrado na Figura 2.
2. Adicione 200 mL de meio de cultura para o frasco de vidro estéril. Inserir a folha de célula dentro da câmara do contêiner de cultura.
   Nota: Preste atenção à direção da superfície superior da camada de células.
3. Adicionar 3 mL de meio de cultura no recipiente de tecido e fechar o recipiente. Colocar o sistema de perfusão dinâmico na incubadora e ligue a bomba. Defina a taxa de fluxo da bomba peristáltica no 8 mL/min. cultura camada de células no sistema dinâmico de perfusão por 48 h.

6. obtenção de camada de células de várias camadas de MSC

1. Autoclave a instrumentos e componentes de tecido portador a 121 ° C por 30 min, incluindo tubos de centrífuga de 1,5 mL, pinças e pinças dentadas.
2. Retire o duto de entrada da garrafa de vidro para parar o fornecimento do meio de cultura para o recipiente.
   Nota: Pare a bomba peristáltica quando o recipiente de cultura está vazio.
3. Retire a folha de célula do contêiner de cultura e colocá-lo em um prato de cultura.
4. Use uma pinça para imobilizar o portador de tecido e outra pinça dentada para separar o anel branco tensão da base preta. Finalmente, obter a camada de células BMSCs em várias camadas.
5. Para preservação curta, cada folha de célula pode ser transferida para um tubo de centrífuga de 1,5 mL com a pinça. O andaime do DPP deve ser anexado à parede interna do tubo de centrífuga, e camada de células deve se espalhar para fora tanto quanto possível no tubo de centrífuga.
6. Delicadamente, adicione 1 mL do meio de cultura no tubo de centrífuga de imergir a camada de células. Feche a tampa do tubo de centrífuga e armazenar a camada de células, a 4 ° C.
   Nota: A camada de células deve ser transplantada ou analisada logo que possível. É recomendável usar a camada de células dentro de 4 h.

Results

O esquema da construção folha várias camadas de células estaminais é mostrado na Figura 1. Preparar o andaime de folha célula pelo método de decellularization PLA₂ é o primeiro passo. Com base no cadafalso, uma estrutura temporária celular 3D é construída misturando as células-tronco com o hidrogel de peptídeo RAD16-1. A fim de obter uma folha de várias camadas de células com bioatividade de células-tronco favorável e ótima resistência mecânica, a ...

Discussion

O presente protocolo relata um método eficiente para a construção de uma folha MSC em várias camadas. Esta folha de célula apresenta ótima resistência mecânica e densidade de semeadura de pilha alta Bioatividade favorável células-tronco. Usando BMSCs como exemplo, a estrutura celular 3D rapidamente é construída com RAD16-eu hidrogel de peptídeo. Depois a ser cultivada no sistema de perfusão dinâmico, folha de várias camada BMSC é obtida com êxito e os BMSCs mantêm uma alta expressão de marcadores de células estaminais.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fosfolipase A2	Sigma-Aldrich	P6534
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Tampão fosfato	Gibco BRL	89033
Penicilina estreptomicina / anfotericina	Gibco BRL	15640055
Buffer bicarbonato	Sigma-Aldrich	C3041
Concentrador de mesa	Changzhou Aohua Instrument Co.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
Soro fetal bovino sul-americano	Gibco BRL	10270-106/P30-3302
L-Glutamina	Corning Cellgro	25-005-CI
0.25% Tripsina/2.21 mM EDTA	Corning Cellgro	25-053-CI
Armário de Biossegurança	Esco,Singapore	AC2-2S1
Incubadora de temperatura constante	CLS-170B-8		da Esco,Singapore
	Corning	430790
EP tubo	Axygen	31617934
Máquina centrífuga	TOMOS	1-16R
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378-500G
Pura Matrix	BD	354250
Sistema de cultura de perfusão dinâmica	Minucells e Minutissue	D-93077
Bomba peristáltica	Ismatec	IPC N8
Tubulação da bomba	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300	Regensburg
Sistema de perfusão dinâmica	MINUSHEET	Regensburg
MINUSHEET 0006	Regensburg
MINUSHEET 0002	Regensburg		garrafa de vidro de 500 mL
MINUSHEET 1301			recipiente para cultura de perfusão