Artigo de método

Construção de uma folha de células-tronco mesenquimais em várias camadas com um sistema de cultura dinâmica 3D

DOI:

10.3791/58624

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20 de outubro de 2018

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1Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University, 2Department of Developmental and Regenerative Biology, Jinan University, 3Nansha College Preparatory Academy, 4Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Jinan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este artigo fornece um método eficiente e viável para a construção de várias camadas de células estaminais folhas com propriedade de célula-tronco favorável.

Resumo

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Terapia de células-tronco mostra um promissor futuro em regenerar órgãos feridos e tecidos, e a técnica de folha célula foi desenvolvida para melhorar a retenção de cela baixa e pobre sobrevivência dentro da zona alvo. No entanto, durante o processo construção in vitro , uma solução para a manutenção de células-tronco Bioatividade e aumentando a quantidade de células dentro da camada de células é urgentemente necessária. Aqui, este protocolo apresenta um método para a construção de uma folha de várias camadas de células com bioatividade de células-tronco favorável e operabilidade ideal. Decellularized Pericárdio Porcino (DPP) é preparado pela fosfolipase um método de decellularization2 (PLA2) como o andaime de folha de célula, e rato medula células-tronco mesenquimais (BMSCs) são isoladas e expandiu-se como as células semeadas. O organelo várias camadas folha temporária é construído usando RAD16-eu hidrogel de peptídeo. Finalmente, a camada de células é cultivada com um sistema dinâmico de perfusão para estabilizar a estrutura tridimensional (3D), e a camada de células poderia ser obtida após uma cultura de 48 horas em vitro. Este protocolo fornece um método eficiente e viável para a construção de uma folha de células-tronco em várias camadas, e a camada de células poderia ser desenvolvida como um produto de terapia de células-tronco favorável no futuro.

Introdução

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Terapia de células-tronco tem sido relatada como um tratamento eficaz para muitas doenças; no entanto, a célula baixa retenção e sobrevivência pobre dentro da zona alvo permanecem questões críticas depois da injeção de células-tronco tradicional. Para resolver esse problema, cientistas engenharia de tecido desenvolveram a técnica de folha de célula. Uma folha de monolayered células com matriz extracelular intacta em primeiro lugar foi preparada usando o prato de cultura de temperatura-resposta1, e seus estudos de seguimento relataram as melhorias significativas da retenção de células-tronco e sobrevivência dentro o enfartado área

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Protocolo

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Todas as células-tronco e experimento animal procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do guia nacional para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê de uso (Guangzhou, China) e cuidado de Animal de Universidade de Jinan.

1. preparação do cadafalso DPP com o PLA2 Decellularization método14

Nota: Ver figura 1A para um esquema do método PLA2 decellularization.

  1. Prepare 100 mL de solução de2 200 U/mL PLA. Adicione 0,5 g de Deoxycholate do sódio e 2 mL de PLA2 e....

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Resultados

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O esquema da construção folha várias camadas de células estaminais é mostrado na Figura 1. Preparar o andaime de folha célula pelo método de decellularization PLA2 é o primeiro passo. Com base no cadafalso, uma estrutura temporária celular 3D é construída misturando as células-tronco com o hidrogel de peptídeo RAD16-1. A fim de obter uma folha de várias camadas de células com bioatividade de células-tronco favorável e ótima resistência mecânica, a .......

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Discussão

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O presente protocolo relata um método eficiente para a construção de uma folha MSC em várias camadas. Esta folha de célula apresenta ótima resistência mecânica e densidade de semeadura de pilha alta Bioatividade favorável células-tronco. Usando BMSCs como exemplo, a estrutura celular 3D rapidamente é construída com RAD16-eu hidrogel de peptídeo. Depois a ser cultivada no sistema de perfusão dinâmico, folha de várias camada BMSC é obtida com êxito e os BMSCs mantêm uma alta expressão de marcadores de células estaminais.

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (número de concessão 31771064); a ciência e a tecnologia planejamento projeto da província de Guangdong (concessão números 2013B010404030, 2014A010105029 e 2016A020214012); a ciência e a tecnologia planejamento projeto de Guangzhou (número de concessão 201607010063); e a inovação de graduação e programa de formação de empreendedorismo (número de concessão 201610559028); a National Science Foundation para jovens cientistas da China (conceder número 31800819).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fosfolipase A2Sigma-AldrichP6534
Desoxicolato de sódioSigma-AldrichD6750-100G
Tampão fosfatoGibco BRL89033
Penicilina estreptomicina / anfotericina Gibco BRL15640055
Buffer bicarbonatoSigma-AldrichC3041
Concentrador de mesaChangzhou Aohua Instrument Co.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning Cellgro10-014-CVR
Soro fetal bovino sul-americano Gibco BRL10270-106/P30-3302
L-GlutaminaCorning Cellgro25-005-CI
0.25% Tripsina/2.21 mM EDTACorning Cellgro25-053-CI
Armário de BiossegurançaEsco,SingaporeAC2-2S1
Incubadora de temperatura constante CLS-170B-8da Esco,Singapore
 Corning430790
EP tuboAxygen31617934
Máquina centrífugaTOMOS1-16R 
SucroseSigma-AldrichS9378-500G
Pura Matrix BD354250
Sistema de cultura de perfusão dinâmicaMinucells e MinutissueD-93077
Bomba peristálticaIsmatecIPC N8
Tubulação da bombaIsmatecNr.1306
MINUSHEET 1300 Regensburg 
Sistema de perfusão dinâmicaMINUSHEETRegensburg
MINUSHEET 0006Regensburg 
MINUSHEET 0002Regensburggarrafa de vidro de 500 mL 
MINUSHEET 1301recipiente para cultura de perfusão 
KT20183Tubo de centrífuga Componentes de suporte de tecido Equipamento de troca gasosa

Referências

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  1. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
  2. Narita, T., et al.

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Etiquetas

Mesenchymal Stem Cell Sheet3D Dynamic Culture SystemDecellularized Porcine PericardiumBone Marrow Mesenchymal Stem CellsRAD16 I Peptide HydrogelDynamic Perfusion SystemCell Sheet ScaffoldStem Cell BioactivityMultilayered Cell StructureStem Cell Viability

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